Определение активности лактатдегидрогеназы

кинетический-спектрофотометрический метод

DAC-SpectroMed s. r.l. МД-2025, Молдова, 0 Тел.:/+37322/ 739961,739968; факс: /+37322/ 727522 Email: *****@***com  www.	LDH-DAC. Lq Код  2044L50  50 мл Код  2044L200  200 мл	PT MD 11-38623324-002:2002 Только для диагностики «in vitro» Хранить при  2-80С
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ КИНЕТИЧЕСКИЙ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Принцип метода Лактатдегидрогеназа (LDH) катализирует восстановление пирувата с образованием лактата и NAD+. Уменьшение абсорбции NADH, измеренной при длине волны  340(334-365) nm, пропорционально активности LDH 1,2. Пируват + NADH + Н+  LDH  Лактат + NAD+

Состав набора

Reagent А	рН 7,5
Фосфатный буфер Пируват Натрия азид	56  mmol/l 1,6  mmol/l 1 g/l
Reagent В
NADH Натрия азид	2,40 mmol/l 1 g/l
Ядовит! Не пипетировать ртом!

ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ

Реагенты при 2-80С стабильны до срока, указанного на этикетке.

Рабочий Реагент стабилен 4 недели при 2-80С.

Признаки непригодности: абсорбция Рабочего Реагента менее 1,1 при 334 nm (кюветы на 1 cm).

ОБРАЗЦЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сыворотка, свободная от гемолиза.

Лактатдегидрогеназа в сыворотке при 2-80С стабильна 24 часа.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ВЕЛИЧИНЫ

Сыворотка6: LDH 240 – 480 U/l.

Данные величины ориентировочны, рекомендуется определение собственных нормальных величин в каждой лаборатории.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Для контроля хода реакции и процедуры измерения рекомендуется использовать нормальные и патологические контрольные сыворотки (уровень I и II).

Каждая лаборатория должна установить собственную внутреннюю систему контроля качества.

Дополнительное оборудование

Анализатор, спектрофотометр или термостатирующий фотометр 370С с фильтром 340(334-365) nm.

Дозаторы на 25 ?l, 50 ?l и 1,0 ml. Таймер.

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Данный набор предназначен только для диагностики in vitro.

Образцы анализов пациентов должны рассматриваться как потенциально опасные и обрабатываться как инфекционные.

При использовании набора следует соблюдать правила безопасности при работе с едкими и ядовитыми веществами.

приготовление РАБОЧЕГО реагента

Рабочий реагент приготовить из расчета: 1 ml Reagent А +  1 ml Reagent В.

ПРОЦЕДУРА ОПРЕДЕЛЕНИЯ Метод:  кинетический Длина волны:  340 (334-365) nm Температура:  370С Бланк:  по дистиллированной воде Метод А 1. Доведите температуру Рабочего реагента и фотометра до температуры реакции (370С). 2. Внесите в кювету с длиной оптического пути 1 cm: Рабочий реагент 1,0 ml Образец 25 ?l NB: Объемы реагента и образца могут быть пропорционально изменены в соответствии с рабочим объемом кюветы используемого анализатора. 3. Смешайте и поместите кювету в фотометр. Включите секундомер. 4. Спустя  1  минуту  измерьте  начальную  абсорбцию  против дистиллированной воды, затем измеряйте абсорбцию через каждую 1 минуту в течение 3 минут. 5. Вычислите разницу между последовательными абсорбциями и среднюю разницу абсорбции за 1 минуту (?А/min). Метод В 1. Доведите температуру Reagent А, Reagent В и фотометра до температуры реакции (370С). 2. Внесите в кювету с длиной оптического пути 1 cm: Reagent А 1,0 ml Образец 50 ?l 3. Смешайте, инкубируйте 1 минуту и внесите в кювету: Reagent В 1,0 ml 4. Смешайте и поместите кювету в фотометр. Включите секундомер. 5. Спустя 1 минуту измерьте начальную абсорбцию против дистиллированной воды, затем измеряйте абсорбцию через каждую 1 минуту в течение 3 минут. 6. Вычислите разницу между последовательными абсорбциями и среднюю разницу абсорбции за 1 минуту (?А/min). Вычисления Содержание LDH в образце определить по формуле: ?А/minОб х ССт = СОб ?А/minСт Где: СОб - содержание LDH в образце, U/l; ССт - содержание LDH в стандарте, U/l; ?А/minСт - средняя разница абсорбции за 1 минуту стандарта; ?А/minОб - средняя разница абсорбции за 1 минуту образца. Вычисление по фактору: 334 nm:  Активность (U/l) = ?А/minОб х 8252 340 nm:  Активность (U/l) = ?А/minОб х 8450

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Предел чувствительности: 8,252 U/l.

Предел линейности: 1200 U/l.

Воспроизводимость (от периода к периоду):

Средняя концентрация	CV*	n*
344,6 U/l	0,99 %	25
523,6 U/l	3,27 %	25

*CV – коэффициент вариации; n – количество определений.

Достоверность: Результаты, полученные при использовании данного реагента, не показали системной разницы при сравнении с референсными реагентами. Подробности сравнительных экспериментов предоставляются по запросу.

Интерференция:

Билирубин до 855 ?mol/l (0,5 g/l), липиды до 10 g/l,  глюкоза до 55,5 mmol/l (10 g/l) и аскорбиновая кислота до 2,84 mmol/l (0,5 g/l) не влияют на результат определения6. Лекарственные препараты и субстанции могут влиять на результат определения3:

Ацебуталол, анестетики, азлоциллин, цефалоспорины, дикумарол, этанол, филграстим, флюороурацил, гепарин, имипрамин, интерферон, изотретиноин, кетоконазол, лабеталол, метотрексат, метопролол, нитрофурантоин, нестероидные противовоспалительные средства (например, дифлунисал, кетопрофен, пироксикам), пеницилламин, пиперациллин, пликамицин, пропоксифен, хинидин, сульфонамиды, тикарциллин, третинат, вальпроевая кислота, оксалат, мочевина, амикан, метронидазол, кетопрофен, клофибрат, флюорид (низкие дозы).

Данные метрологические характеристики были получены на анализаторе. Результаты могут варьировать в зависимости от используемого оборудования или процедуры определения.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Лактатдегидрогеназа присутствует во всех клетках организма, но наиболее высокое содержание обнаруживается в печени, сердце, почках, скелетной мускулатуре и эритроцитах.

Содержание LDH в сыворотке или плазме повышается при мегалобластной, гемолитической, серповидно-клеточной  и пернициозной анемиях, неоплазии, лейкемии, лимфоме, интенсивном карциноматозе, шоке,  гипоксии,  крайней гипертермии, циррозе, механической желтухе, гепатитах, почечных заболеваниях многих форм, инфаркте почки, инфаркте миокарда и легкого, болезни скелетной мускулатуры, застойной сердечной недостаточности, любом повреждении клеток,  которое приводит к потере цитоплазмы,  остром панкреатите4,5.

Пониженный уровень ЛДГ наблюдается при генетически обусловленном дефиците субъединиц Н и М.

Клинический диагноз должен устанавливаться на основе интеграции клинических и лабораторных данных.

ЛИТЕРАТУРА

Sociedad Espanola de Quimica Clinica, Comite Cientifico, Comision de Enzimas Metodo recomendado para la determinacion en rutina de la concentracion catalitica de lactato deshidrogenasa en suero sanguineo humano. Quim Clin 1989; 8: 57-61. Scientific Committee. Recommendations pour la mesure de la concentration catalitique de la lactate deschidrogenase dans le serum humain a 300C. Ann Biol Clin 1982; 40: 87-164. Young DS. Effects of drugs on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press, 1997. Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3rd edition. Burtis CA, Ashwood ER. WB Sa unders Co., 1999.

5. Friedman and Young. Effects of disease on clinical laboratory tests, 3th ed. AACC Press, 1997.

6. Ahh. Biol. Clin. 1982; 40:123.