Секрет Фиалки удивительной (Viola mirabilis L.)

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Главный ботанический сад им. Российской академии науки

Лаборатория Гербарий

ГБОУ Школа им.

Секрет Фиалки удивительной (Viola mirabilis L.)

Научный руководитель:

к. б. н.

Москва 2018

CОДЕРЖАНИЕ

Аннотация        3

Введение        4

1. Литературный обзор        7

2. Материалы и методы исследования        8

2.1. Подбор образцов        8

2.2. Выделение ДНК        10

2.3. Постановка ПЦР - полимеразной цепной реакции, амплификация фрагменов хлоропластной ДНК и ISSR-фрагментов        10

2.4. Визуализация продуктов амплификации. Очистка продуктов амплификации и секвенирование нуклеотидных последовательностей

       13

2.5. Выравнивание ДНК последовательностей        14

2.6. Статистическая обработка данных        14

3. Результаты и выводы        16

Список литературы        17

Аннотация

Начато исследование вероятной гибридизации у трех видов фиалок с территории Белгородской области– Фиалки удивительной, Фиалки приятной и Фиалки донской с использованием молекулярно-генетических методов. Определение и сравнение у исследуемых образцов последовательностей двух участков хлоропластной ДНК (trnV-ndhC, trnH-psbA) показало их высокую вариабельность и пригодность их использования для филогении рода Viola L.

Анализ этих спейсеров у образцов Фиалки удивительной, Фиалки приятной и их вероятных гибридов выявил 11 хлоропластных гаплотипов. Образцы, гибридной природы имеют гаплотипы, идентичные предполагаемому материнскому виду -  Фиалки удивительной. В случае анализа образцов Фиалки удивительной, Фиалки донской и их вероятных гибридов ситуация неоднозначна – 12 гаплотипов, отдаленно связанных друг с другом. Оба анализа согласуются с анализом данных в программе SplitsTree4.  Дальнейший анализ ядерной ДНК методом ISSR-маркирования (межмикросателлитные последовательности) дополнит полученные данные и позволит сделать окончательные выводы. 

Введение

       Фиалка удивительная (Viola mirabilis L.) вид фиалок из семейства Фиалковые (Violaceae Batsch), описанный Карлом Линнеем в 1753 году. Это теневыносливое влаголюбивое лесное растение, растет в лиственных лесах (преимущественно дубравах) и смешанных лесах, зарослях кустарника на достаточно богатой, умеренно увлажненной и хорошо аэрируемой почве. Распространена в Европе и ряде регионов Азии. В России встречается на всей территории европейской части (кроме арктических районов и Нижней Волги), в Предкавказье и Сибири. Известна во всех областях Средней России, чаще в нечерноземной полосе.

       Удивительной эта фиалка названа потому, что ее весенние хазмогамные цветки, развивающиеся в пазухах розеточных листьев, как правило, бесплодны, а плоды развиваются из летних клейстогамных цветков – на удлиненных летних побегах. В нечерноземной полосе это всегда так. В Белгородской области научным сотрудником ГБС им. РАН были неоднократно собраны экземпляры Фиалки удивительной, развивающие плоды из весенних цветков. Она предположила, что этот вид получает возможность скрещиваться с произрастающими рядом другими видами. А именно с Фиалкой приятной (avis W. Beck.) и Фиалкой донской (V. tanaitica Grosset.). Предполагаемые гибриды Фиалки удивительной и Фиалки приятной (V. mirabilis L. ? avis), по-видимому, в Белгородской области встречается довольно часто (, в печати).

       Предполагаемые гибридные растения образуют обширные клоны и довольно длинные подземные корневища, как Ф. приятная (avis), но имеют рыжеватые чешуи в основании розеточных побегов, как Ф. удивительная (V. mirabilis). Листья гибридных растений на одном и том же побеге могут иметь форму, как у типичной V. mirabilis и быть вытянутыми, продолговато-яйцевидными как у Ф. приятной (avis). Как правило, присутствуют только розеточные побеги (в пазухах которых иногда наблюдаются цветки), удлиненные стеблевые побеги развиваются редко – и коробочки на них выглядят недоразвитыми.

       Также существует вероятность образования гибридов между Ф. удивительной и Ф. донской (V. tanaitica). Предположительно гибридные их растения имели крупные прилистники, небольшие листья – как у Ф. донской (V. tanaitica). Формой листьев, сближением на удлиненных побегах близ верхушки листьями у клейстогамных цветков и рыжими прикорневыми чешуями они напоминали Ф. удивительную (V. mirabilis), но характерное для этого вида опушение стебля и черешков листьев двумя продольными полосками волосков у них отсутствовало.

       По-видимому, нужно обратить специальное внимание на образ жизни и гибридизацию Ф. удивительной (V. mirabilis) на юге России. Одних данных по морфологическим признакам часто бывает недостаточно, чтобы подтвердить или опровергнуть гибридогенное происхождение исследуемых образцов. В связи с этим мы попробуем решить эту проблему с использованием молекулярно-генетических методов. Одновременно научимся специфическим методикам работы в молекулярной лаборатории.

Цель работы: подтвердить или опровергнуть гибридогенное происхождение образцов фиалок по гербарным сборам, предоставленным (ГБС РАН).

Задачи:

научиться        правильно подбирать материал для        исследования; освоить        методики работы в молекулярной лаборатории        при работе с растительным материалом; подобрать        условия успешного протекания полимеразной        цепной реакции; изучить        основные методики статистической обработки полученных данных в специальных        программах; на основе полученных данных научиться правильно формулировать выводы по        исследуемой проблеме;
Литературный обзор

До настоящего момента попытки исследовать гибридизационные процессы в локальных популяциях фиалок с помощью молекулярно-генетических методов не предпринимались отечественными учеными-исследователями. Исследователь семейства Violaceae во «Флоре Восточной Европы» (том 9) указывает на целый ряд межвидовых гибридов, которые часто встречаются на территории «Флоры». Никитин приводит более 20 таких гибридов и их вероятных родителей, а также указывает на трудность в определении и изучении гибридной природы у образцов фиалок. Автор предлагает учитывать ряд особенностей (морфологических и репродуктивных) при установлении гибридов:

гибриды, как правило, занимают промежуточное положение между родительскими вилами по морфологическим признакам; гибриды между представителями различных секций подрода Viola обычно стерильны и слаборазвиты; листовые пластинки гибридов с участием V. mirabilis при сушке покрываются бурыми пятнами, а прикорневые чешуи их ярко окрашенные, рыже-бурые, особенно весной (,1996).

В работах зарубежных исследователей у некоторых представителей семейства Violaceae доказано наличие гибридизации между видами по данным ядерного генома (ITS - внутренний транскребируемый спейсер), а также по данным хлоропластного генома (интроны trnL-trnF, rpl16, atpF-atpH, и psbA-trnH). В этих работах также указывается на отсутствие фертильности гибридов и  обратных скрещиваний гибридов с родителями (Gil HY, Kim SC., 2016).

  2.Материалы и методы

2.1 Подбор образцов

       Исследовательская работа проводится на базе молекулярной лаборатории отдела Гербарий Главного ботанического сада имени РАН. Для исследования нами был отобран растительный материал по гербарным сборам из нескольких точек с территории Белгородской области. Были отобраны экземпляры, определенные , как чистые родительские виды Ф. удивительной и Ф. приятной, а также предполагаемые гибриды между ними. Для расширения выборки мы добавили еще несколько образцов каждого вида, собранных с территории Калужской, Смоленской, Волгоградской, Саратовской, Ярославской, Тульской, Белгородской областей в разные годы, а также с территории Чувашии, Донецкой области Украины, Молдавии (образцы хранятся в Гербарии Главного ботанического сада им. РАН) (Приложение 1). А также для проверки гибридного статуса и в качестве внешней группы мы включили в работу еще один вид — Ф. донская и два предположительных гибрида между ней и Ф. удивительной (из сборов ). Всего для исследования было отобрано 36 образцов: 11 образцов Ф. удивительной (обозначены VM), 10 образцов Ф. приятной (обозначены VS), 8 образцов предполагаемых гибридов между ними (обозначены VX), 5 образцов Ф. донской (обозначены VT) и 2 образца вероятных гибридов между Ф. донской и Ф. удивительной (обозначены VTX). Основные отличительные морфологические признаки исследуемых видов фиалок указаны в Таблице 1.

Таблица 1. Основные морфологические признаки исследуемых видов.

Признак	Ф. приятная	Ф. удивительная	Ф. донская
Простое опушение листьев	густое	редкие волоски	голые
Розетка листьев	есть	есть	есть
Вегетативная подвижность	Корневища разрастаются сильно, 1-2 метра заросль	Короткое корневище, образует дерновинки	Короткое корневище, не разрастается
Наличие стеблей	нет	есть	есть
Цвет прикорневых чешуй	зеленоватые	ярко-рыжие	темно-бурые
Цветки	В пазухах розетки - обычные	В розетке - хазмогамные, на стеблях - клейстогамные	Только на стеблях - обычные, клейстогамных нет
Цвет лепестков, аромат	Темно-фиолетовые с белым пятном, сильный фиалковый аромат	Лиловые, аромат слабый	Бледно-фиолетовые, запах - не выяснено

2.2. Выделение ДНК

       Из сухих листьев всех образцов нами была выделена общая ДНК с использованием двух методов: стандартного метода выделения ДНК с применением цетилтриметиламмоний бромида (CTAB) (Doyle, Doyle, 1987) и с помощью набора для экстракции растительной ДНК Nucleospin Plant Extraction Kit (“Machery-Nagel”). На первом этапе мы измельчили листья образцов с помощью металлических шариков с добавлением песка в гомогенизаторе (3 минуты) в 2,0 мл пробирках Эппендорф, чтобы разрушить клеточную стенку и добавили детергент (CTAB), который образует с ДНК и РНК нерастворимый комплекс. На втором этапе мы избавлялись от белков, фенольных соединений и полисахаридов смесью хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1).  И на последнем этапе мы отделяли детергент от нуклеиновых кислот промывкой 70 % спиртом. Осадок подсушивали в термостате при температуре 37?С и растворяли в 50 мкл стерильной деионизированной воде. При минимальном количестве исходного материала (менее 20 мкг) препараты тотальной ДНК получали с использованием набора для экстракции растительной ДНК Nucleospin Plant Extraction Kit (“Machery-Nagel”, Германия), следуя стандартному протоколу производителя.

       Наличие и качество ДНК проверяли электрофорезом в 1% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия. Образцы экстрагированной ДНК хранили при – 40 ?С. Для дальнейших манипуляций с ДНК делали разведение всех образцов 1:19.

2.3. Постановка ПЦР - полимеразной цепной реакции, амплификация фрагментов хлоропластной ДНК и ISSR-фрагментов

       Для установления видовой принадлежности исследуемых растений, а также для выявления гибридной природы некоторых из них, мы решили использовать два подхода к решению проблемы. Мы проанализируем нуклеотидные последовательности двух        межгенных спейсеров (интронов) хлоропластной ДНК — trnH-psbA        и trnV-ndhC. Нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров в ходе эволюции изменяются гораздо быстрее, чем последовательности генов, соответственно, в них накапливаются некоторое количество замен, вставок или делеций, что делает эти участки удобным объектом в исследованиях. Первый участок является высоко изменчивым        (размером около 500 пар нуклеотидов) у многих покрытосеменных растений и часто используется для идентификации большого числа видов растений (Shaw J., et all). Так как второй интрон trnV-ndhC уже использовался в филогенетических исследованиях рядом авторов на других родах цветковых растений (, , 2012), нам стало интересно, насколько он окажется вариабельным в группе фиалок. К тому же этот участок еще никем для фиалок не был изучен.        Для исследования ядерного генома мы используем ISSR - метод (ISSR (Inter Simple Sequence        Repeats)). Этот метод используется для выявления уровня внутри и межвидового полиморфизма растений (Fedorova A. V., Schanzer I. A., Kagalo, 2010). Это анонимный подход анализа полиморфизма многочисленных участков, рассеянных по различным регионам ДНК, зарекомендовал себя, как малозатратный, хорошо воспроизводимый метод, который может быть        успешно использован, как для выявления внутри и межвидового полиморфизма, так и для идентификации видов в популяции. В ISSR - анализе растений наиболее часто используют динуклеотидные и тринуклеотидные типы повторов микросателлитной ДНК, которые характерны для ядерного генома. Для постановки ПЦР используется только 1 праймер, который работает на обеих цепях ДНК, и амплифицируется фрагмент межмикросателлитной ДНК длиной от 100 до 2000 п. н. Гипервариабельные ISSR представляют собой универсальную систему генетических маркеров для анализа наследуемых изменений на уровне ядерной ДНК. Для амплификации межмикросаттелитных участков генома были использованы праймеры производства компаний «Диалат» и «Синтол» (Таблица 2).

Таблица 2. ISSR-праймеры.

Праймер	Последовательность	T. отж., ?С
UBC840	GAGAGAGAGAGAGAGAAYT	50
17899a	CACACACACACAAG	50
М2	ACACACACACACACAC(C/T)G	50
М4	AGAGAGAGAGAGAGAG(C/T)C	50
М10	CACACACACACA (A/G)G	50
М12	CACACACACACA (A/G) (C/T)	50
НВ13	GAGGAGGAGGC	50

ПЦР осуществляли в амплификаторе MJ Research PTC-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) Условия ПЦР: предварительная денатурация 95 С – 3 мин; 35 циклов: денатурация при 94 С – 30 с, отжиг при соответствующей температуре – 30 с, элонгация при 72 С – 40 с + прибавление 2 с на каждый цикл, заключительная элонгация в течении 4 минут. Температуру плавления для каждого праймера предварительно рассчитывали по формуле Т = 4 х (G+C) + 2 x (A+T), окончательную температуру отжига праймеров выбирали на основе результатов реакций с градиентом температур отжига. Реакционная смесь (20 мкл) содержала 10-20 нг ДНК, 20 пикомоль праймера и 4 мкл готового реакционного микса MasterMix 5X MagDDMIX-2025 (200 мкМ каждого dNTP, 1,5 мМ MgCl2, 1,5 ед. Taq-полимеразы и буфер). Для амплификации хлоропластных участков trnV-ndhC и trnH-psbA были использовали праймеры, синтезированные в ПК:

trnV(UAC)2X GTC TAC GGT TCG ART CCG TA

ndhC TAT TAT TAG AAA TGU CCA RAA AAT ATC ATA TTC

trnH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC

psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C

Условия ПЦР: предварительная денатурация 94С – 3 мин; 30 циклов: 94С – 30 с, отжиг при 56С – 40 с, элонгация при 62 С – 20 с; 2 цикла: 56С – 40 с, 62 С – 1мин 20 с.

2.4. Визуализация продуктов амплификации и очистка продуктов амплификации и секвенирование нуклеотидных последовательностей

Разделение продуктов ПЦР проводили электрофорезом в 1 % и 1,7% агарозном (Amresco)геле в 0,5-кратном трис-боратном буфере с окрашиванием бромидом этидия (0,5 мкг/мл) при 125 В в течение 15 или 80 минут в горизонтальной камере Sub - Cell® Model 192(Bio-rad) и фотографировали с помощью системы гель-документирования GelDoc-It® Imaging System (США). Для определения размеров фрагментов использовали маркер длины Gene Ruler 100+ п. н. (Fermentas). Так как общая выделенная ДНК была, видимо, загрязнена присутствием какой-то чужеродной ДНК (вероятно, грибов), вместе с нужными нам фрагментами участков trnH-psbA и trnV-ndhC амплифицировались еще фрагменты более легкие по весу. Поэтому очистку амплификатов мы проводили с помощью коммерческого набора CleanUp mini на колонках (производитель «Евроген»). Из агарозного геля мы скальпелем вырезали нужный фрагмент, взвешивали его и очищали согласно протоколу производителя. Концентрацию очищенных образцов определяли с помощью флюорометра Qubit. После этого образцы в необходимой концентрации вместе с праймерами высушивались в пробирках и отдавались на секвенирование. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems на базе ЦКП «Геном» (Институт Молекулярной Биологии РАН им. ) и в ПК (Москва).

2.5-2.6. Выравнивание последовательностей, статистическая обработка данных.

Длина выравнивания последовательности спейсера trnV-ndhC для фиалок составила 731 п. н., а спейсера trnH-psbA — 558 п. н. В приложении 2 показаны некоторые вариабельные части в выравниваниях по двум участкам хлоропластной ДНК. Из-за небольших неточностей в прочтении последовательностей секвенатором, все последовательности выверены нами вручную. Все последовательности будут депонированы в международную базу ГенБанк. Полученные нуклеотидные последовательности будут проанализированы с помощью специальных биологических статистических программ (BioEdit (Hall T. A. (1999)), TCS (Clement M.,2000) NewHybrids, Structure). Мы объединили оба выравнивания в одно и проанализировали в программе TCS в двух вариантах: 1) образцы Ф. удивительной, Ф. приятной, их предполагаемые гибриды; 2) образцы Ф. удивительной, Ф. донской, их предполагаемые гибриды. Данная программа на основе выравнивания выявляет различия, по которым определяются хлоропластные гаплотипы образцов методом статистической парсимонии. В первом случае (Приложение 3) программа внутри выборки определяет 11 гаплотипов: 1- VM1,VM4, VM7, VM8, VX1, VX2, VX5, VX7 (Белгородская, Смоленская и Ярославская области), 2- VM2 (Калужская область), 3- VM3 (Тульская область), 4- VM5 (Чувашия), 5- VM6 (Молдова), 6- VM9,VM10, VM11, VX3, VX4, VX6, VX8 (Белгородская область, участок Ямская степь), 7- VS1 (Белгородская область, Острасьевы яры), 8- VS2,VS4, VS5, VS7, VS8 (Донецкая, Белгородская, Волгоградская области), 9- VS3 (Белгородская область, участок Ямская степь), 10- VS6 (Саратовская область), 11- VS9, VS10( Белгородская область, участок Ямская степь). Все предполагаемые гибриды несут гаплотипы, характерные для Ф. удивительной (предполагаемого материнского вида), это вполне согласуется с наследованием хлоропластной ДНК по материнской линии (изменения в позициях между гаплотипами указаны на рисунке между узлами). Сходную картину показал анализ в программе SplitsTree4 (метод Neighbour Joining), при этом самыми удаленными образцами оказались два образца VM5 (Чувашия) и VM6 (Молдова) (Приложение 4). Во втором случае (Приложение 4) выделяются 12 гаплотипов: 1-VM1, VM4, VM7, VM8; 2- VM2; 3- VM3; 4- VM5; 5- VM6; 6- VM9,VM10,VM11; 7- VT1; 8- VT2, VT5; 9- VT3; 10- VT4; 11- VTX1; 12- VTX2. Все они генеалогически друг от друга сильно удалены (Приложение 5 и 6). В данном случае результат носит неоднозначный характер, и его интерпретация зависит от данных по ядерной ДНК. По фотографиям агарозных гелей ISSR - фрагментов (Приложение 7) можно уже визуально четко отделить предполагаемые родительские виды (Ф. удивительная (VM), Ф. приятная (VS), Ф. донская (VT)). Для анализа этих участков необходимо подсчитать количество специфических для каждого образца или вида фрагментов вручную или с помощью программы CrossChecker и составить бинарную матрицу (наличия 1/отсутствия 0 фрагментов). Ее анализ в программах PAST, NewHybrids и Structure позволит

нам подтвердить или опровергнуть предположения о гибридогенном происхождении образцов фиалок, собранных ею с территории Белгородской области.

Результаты и выводы

       Так как работа технически рассчитана на длительное время и требует больших усилий в статистической обработке полученных данных, говорить с уверенностью об окончательных результатах мы пока не можем. На данный момент нами проделана основная часть работы по проблеме исследования: освоены методики выделения ДНК из растительного материала, проведения ПЦР, очистки пцр-продуктов; подобраны праймеры для ПЦР, амплифицированы и отсеквенированы фрагменты хлоропластной ДНК, получены электрофоретические спектры ISSR-маркеров. На основе полученных данных мы уже можем сказать о том, что выбранные для работы межгенные спейсеры trnH-psbA и trnV-ndhC, оказались очень вариабельными (изменчивыми). В ближайшее время будет проведена статистическая обработка ISSR-спектров в программах PAST, NewHybrids, Structure. Эти данные будут сопоставлены с полученными хлоропластными гаплотипами, что позволит с уверенностью подтвердить или опровергнуть нашу гипотезу.

Список использованной литературы:

Сем. Violaceae Batsch - Фиалковые // Флора Восточной Европы. Под ред. . С.-Петербург: Мир и семья, 1996. Т. 9. С. 180-206. Дополнения к флоре Средней России и Белгородской области (по материалам 2015-16 гг.)// Бюл. МОИП. Отд. биол., 2018. Т.123 (в печати). , , Гибридизация между Rosa rubiginosa L. и R. villosa L. в условиях заповедника «Белогорье» (урочище «Стенки изгорья») и природа R. oskolensis Buzunova et Grigorj. // Бюл. Главн. бот. сада. 2012. Вып. 198, №4. С. 33-40. Doyle J. J., Doyle J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue // Phytochem. Bull. — 1987. — Vol. 19. — P. 11—15. Clement M., Posada D. & Crandall K. A. (2000): TCS: a computer program to estimate gene genealogies. // Mol. Ecol. 9: 1657–1659. Fedorova A. V., Schanzer I. A., Kagalo A. A. Local differentiation and hybridization in wild rose populations in Western Ukraine. // Wulfenia. Vol. 17. 2010. P. 99–115. Gil HY, Kim SC. Viola woosanensis, a recurrent spontaneous hybrid between V. ulleungdoensis and V. chaerophylloides (Violaceae) endemic to Ulleung Island, Korea. //  J Plant Res. 2016 Sep;129(5):807-822. Hall T. A. (1999): BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. // Nucl. Acids Symp. Ser. 41:95–98. Shaw J., Lickey E. B., Beck J. T., Farmer S. B., Liu W., Miller J., Siripun K. C., Winder C. T., Schilling E. E., Small R. L. The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis // Am. J. Bot. — 2005. — Vol. 92, N1. — P. 142—166.