ЛЕКЦИЯ 14
Методы с использованием конъюгированных иммуноглобулинов
1 Иммунофлюоресценция
2 Иммуноферментный анализ
3 Радиоиммунологический анализ
4 Иммуноблотинг
Иммуноанализами называют такие методы качественного и количественного определения растворимых веществ, в основе которых лежит взаимодействие антигена с антителом (т. е. иммунологическое распознавание), которое детектируется (визуализуется) с помощью специальной метки, заранее конъюгированной либо с антителом, либо с антигеном. В качестве меток используют вещества, которые при определенных условиях может увидеть либо тот или иной прибор, либо глаз человека. Приборы могут не только «увидеть», но и измерить количество метки. Реакции с использованием меченых антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и АТ в исследуемых образцах.
РЕАКЦИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕЧЕНЫХ АТ И АГ
Метки:
1) радионуклид, анализ называют радиоиммунным (РИА);
2) ферменты, катализирующие превращение субстрата с образованием цветного или флюоресцирующего продукта. В данном случае анализы называют иммуноферментными (ИФА) или, как разновидность, иммунофлюоресцентными;
3) флюоресцирующие или люминесцирующие вещества и др.
МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или
РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)
Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале.
Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ-лучах комплекс
Микроб сыворотка, меченная флюорохромом
Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина ? ФИТЦ
При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности.
При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом. Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение.
При непрямом РИФ используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген-антитело. Этот комплекс выявляется с помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к гамма-глобулиновой фракции крови того вида животного, от которого была получена диагностическая сыворотка.
Рис. 1. Реакция иммунофлюоресценции (схема).
Постановка РИФ
На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченных антител.
Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 20-25 мин, или в термостате при 37° С в течение 15 мин. Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.
На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа или люминесцентной насадки к обычному оптическому микроскопу.
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)
Иммуноферментный анализ (ИФА) — метод выявления антигенов (или антител) с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с меткой-ферментом (пероксидазой хрена, галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале.
Наиболее распространен твердофазный ИФА — вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (стандартные диагностические антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках микропанели (планшета для реакций) из полистирола.
Радиоиммунологический анализ (РИА) — высокочувствительный метод, основанный на реакции «антиген—антитело» с применением антигенов или антител, меченных одним из радионуклидов (125I, 14С, 3Н, 51Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и определяют его радиоактивность в соответствующем счетчике у - или ?-излучения: интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена или антител, которые подлежат идентификации.
Радиоиммунологичeский анализ применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, ферментов, лекарственных веществ и иммуноглобулинов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале. Метод представляет определенную экологическую опасность из-за присутствия радиоактивной метки и поэтому требует специальных мер защиты от радиоактивности.
Иммуноблоттинг (иногда называемый вестерн-блоттингом от английского Western ? западный) ? это метод исследования белковых антигенов. Белки разделяют с помощью электрофореза и переносят на мембрану. Затем мембрану инкубируют в растворе антител и связанные антитела выявляют с помощью радиоизотопного или ферментного методов.
Данный метод получил широкое распространение. Например, он используется для идентификации компонентов нейрофиламентов, которые предварительно разделяют в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН). Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.
Итак, проведение аналитических процедур при подозрении на инфекционное заболевание, должно быть направлено на обнаружение патогенного агента (вируса, бактерии, простейшего и т. п.), а также иммунологического ответа макроорганизма на этот агент.
Рассматривая примеры использования различных методов для специфической диагностики инфекционных заболеваний можно отметить, что коммерческие препараты, используемые в мире для этих целей, относятся в основном к методам агглютинации, преципитации, нейтрализации вирусов, ингибирования гемагглютинации, пассивной гемагглютинации, коагглютинации, латексагглютинации, реакции связывания комплемента, иммунофлуоресценции, ИФА. Значительно реже для этих целей используют радиоиммунологический анализ, метод генного зондирования, а коммерческие иммуносенсоры и липосомальные методы еще только разрабатываются.
Для бактериальных инфекций в некоторых случаях сохраняется использование методов прямой агглютинации бактерий для идентификации их чистой культуры (при респираторных, кишечных инфекциях) либо определение антител (кишечные инфекции), хотя значение этих реакций в сравнении с другими более чувствительными, постепенно снижается. Такая же закономерность наблюдается и при использовании методов прямой агглютинации при паразитарных заболеваниях.
Для вирусных инфекций аналогом является метод прямой гемагглютинации. Однако, из-за его относительно невысокой специфичности, практически более важным является метод ингибирования (торможения) реакции гемагглютинации с целью определения антител к вирусу. Для этих же целей используют метод нейтрализации вирусов, однако он более трудоемок из-за необходимости поддержания культуры вируса.
На смену этим реакциям при бактериальных, вирусных и паразитарных инфекциях приходят методы коагглютинации (определение антигенов) и латексагглютинации (определение антигенов, либо антител). Эти методы находят все большее практическое применение, особенно при диагностике менингитов, респираторных и некоторых кишечных инфекций. Реакция пассивной агглютинации по-прежнему популярна при диагностике паразитарных заболеваний, реже при определении антител к вирусам (краснуха, мононуклеоз).
Реакция связывания комплемента используется для определения антител при большинстве видов инфекций, а особенно широко - при вирусных заболеваниях и болезнях, вызываемых риккетсиями, микоплазмами и т. п. Однако в последнее десятилетие этот метод вытесняется ИФА.
Иммунофлюоресцентный метод для определения антигенов и антител в силу своей универсальности также распространен при различных видах инфекционной патологии. В обычных вариантах он основан на микроскопии и визуальном наблюдении. Это одновременно и недостаток (субъективная оценка) и достоинство (наглядность), что в значительной мере руководит при его выборе врачом, в зависимости от целей анализа. Модификации последних лет, основанные на инструментальном учете, вместе с ИФА теснят другие иммунохимические методы.
Радиоиммунологический анализ для диагностики инфекций применяется для подтверждения некоторых форм гепатита В, а также СПИДа. Расширение области его использования в практике диагностики инфекционной патологии мало вероятно.
Иммуноферментный анализ для определения антигенов и антител к микроорганизмам находит все более широкое применение в практике. В настоящее время по частоте применения он не уступает, а в многих случаях (гепатиты, СПИД) превосходит другие методы иммунохимического анализа. При бактериальных, вирусных, паразитарных заболеваниях с его помощью определяют различные антигены микробов и антитела к ним, относящиеся к разным классам иммуноглобулинов.
Практически важным при выявлении антигена любым методом иммунохимического анализа является представление о природе искомого антигена. В некоторых случаях система анализа ориентирована лишь на определенный тип антигена, характерный для определенного типа инфекции. Например, при диагностике коклюша можно определять различные компоненты бактерии - ЛПС, различные белки и т. д. Однако наиболее существенно выявление коклюшного токсина. Вирусы, вызывающие у человека СПИД (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) имеют общие антигены с вирусами лейкоза крупного рогатого скота, но диагностически значимо определять специфические гликопротеины gp 24, gp 120 и т. д. То же относится и к определению антител. При бактериальном эндокардите, вызываемом S. aureus диагностически более значимы антитела к тейхоевым кислотам, а при респираторной стафилококковой инфекции - антитела к поверхностным антигенам. При использовании того или иного набора для проведения иммунологического анализа следует определять для какого типа заболевания определяемый признак является информативным, т. е. увеличивающим вероятность точного диагноза.
Следовательно, в результате рассмотрения всего многообразия методов иммунохимической диагностики, можно заключить, что необходимым является использование различных методов, оптимальный набор которых зависит от конкретной патологии. Так для острой респираторной инфекции кроме классических бактериологического и вирусологического анализа можно рекомендовать метод латексагглютинации для определения антигенов, иммунофлуоресцентный метод для подтверждения, иммуноферментный для определения антител. При СПИДе проводится определение вируса и антител к нему иммуноферментным методом (иногда скрининг - методом латексагглютинации) с подтверждением иммуноферментным (вестерн-блат), либо радиоиммунологическим методом.
Цели непосредственного анализа диктуют наиболее приемлемые варианты обследования и уровень сложности методов. Для массового скрининга необходимы простые, но надежные и чувствительные методы (латексагглютинация, гомогенный ИФА, иногда РПГА), позволяющие проводить десятки и сотни анализов в сутки. Для установления первичного диагноза в поликлиническом лечебном заведении, для анализа образцов в лаборатории СЭС необходимы относительно простые методы, но с более высокими показателями чувствительности (ИФА, РИА). При обследовании пациента в специализированной клинике комплекс таких методов должен быть как можно более широким, включая и длительные наблюдения динамики развития процесса, иммуногистологический анализ (в том числе - иммунофлуоресцентный), генное зондирование и т. д.
Последовательное применение изложенных принципов, на наш взгляд, позволит наиболее эффективно использовать преимущества высокочувствительных и информативных методов иммунохимического анализа для диагностики инфекционных заболеваний человека.
