Отработка процесса передачи генетического материала методом конъюгации бактерий.
(Конъюгация)
Постановщик (-и):
., ст. н.сотр., к. б.н., контур»;
. ст. н.сотр., д. м.н., .
Экспедиции МКС-7, МКС-9,МКС-12, МКС-13, МКС-14, МКС-15, МКС-16, МКС-17, МКС-18, МКС-19, МКС-21, МКС-24, МКС-27, МКС-33, МКС-35, МКС-36,, МКС-39 / продолжается/
Область исследования: космическая биотехнология, конъюгация, донор, реципиент.
Биотехнологический эксперимент «Конъюгация» посвящен разработке методов конструирования новых рекомбинантных штаммов-продуцентов БАВ, путем переноса плазмидных и хромосомных ДНК при бактериальной конъюгации и предусматривает объединение в емкости реактора жидких культур штаммов донора и реципиента в условиях орбитального полета с последующим генетическим анализом полученных культур и наземной селекцией стабильных гибридов.
Исследования позволят разработать методы получения гибридных штаммов продуцентов биологически активных веществ путем переноса плазмидных и хромосомных ДНК при бактериальной конъюгации. Внедрение полученных в ходе работы рекомбинантных штаммов-продуцентов в производство и последующее применение разработанной методологии для получения новых штаммов – продуцентов БАВ и их использование на других предприятиях отрасли может дать значительный экономический эффект.
Генноинженерные технологии получения новых высокоэффективных лечебно-профилактических препаратов для медицины и ветеринарии являются в настоящее время приоритетными в фармацевтической промышленности. Они исключают использование в производстве дорогостоящего и дефицитного сырья человеческого или животного происхождения и создают условия практически неограниченного производства целевого продукта. Основная задача рекомбинантной технологии - это передача генетического материала в клетки микроорганизмов. Одним из альтернативных подходов является бактериальная конъюгация - аналог полового процесса, в котором две бактериальные клетки вступают в контакт, в результате чего реципиентная клетка получает часть генетического материала донора. При передаче конъюгативных плазмид наблюдается мобилизация, то есть одновременный перенос плазмид, которые сами не способны инициировать конъюгацию. Благодаря явлению мобилизации конъюгация может служить универсальным методом передачи генетической информации в технологии рекомбинантных ДНК.
Краткое описание эксперимента
На Международной космической станции, начиная с экспедиции МКС-7, реализуется космический эксперимент (КЭ) «Конъюгация». КЭ «Конъюгация» посвящен разработке методов конструирования новых рекомбинантных штаммов-продуцентов биологически активных веществ (БАВ), путем переноса плазмидных и хромосомных ДНК при бактериальной конъюгации и предусматривает объединение в емкости реактора жидких культур штаммов донора и реципиента в условиях орбитального полета с последующим генетическим анализом полученных культур и наземной селекцией стабильных гибридов.
Для эксперимента используется специально разработанная НПП «БиоТехСис» научная аппаратура «Рекомб-К» (рисунок 1).
Рисунок 1 - Гибридизатор «Рекомб-К»
Гибридизатор представляет собой цилиндр, содержащий 3 емкости, соединенные каналами с односторонними клапанами. Загрузка гибридизатора культурами штаммов, питательной средой и растворами осуществлялась в земных условиях.
Рекомбинантные штаммы донора и реципиента конструируются на Земле для каждого сеанса эксперимента.
«Рекомб-К» доставляется на борт транспортного корабля в пассивном холодильнике (4±2°С). На борту МКС все необходимые операции по перетеснению препаратов выполняются с помощью перемещения поршней биореактора по разработанной методике КЭ.
Использование результатов эксперимента на Земле
Разработанный метод получения гибридных штаммов-продуцентов БАВ путем переноса хромосомных или плазмидных ДНК при бактериальной конъюгации в условиях космического полета и последующей наземной селекции будет использоваться для получения продуцентов ценных белков в интересах здравоохранения.
Полученные гибридные штаммы-продуценты БАВ после наземной селекции будут использоваться в качестве кандидатов в производственные штаммы.
Использование результатов эксперимента для освоения космоса
Полученные данные о влиянии условий орбитального полета на эффективность переноса хромосомных и плазмидных ДНК при бактериальной конъюгации будут использованы при создании технологических линий получения рекомбинантных белков в условиях микрогравитации.
Результаты
Рекомбинантные штаммы донора и реципиента конструируются на Земле для каждого сеанса эксперимента.
Возможности и универсальность метода были продемонстрированы на примере получения штаммов, синтезирующих интерлейкин-1?, Cu, Zn-супероксиддисмутаза и эпидермальный фактор роста (ЭФР) человека.
Полученный в результате КЭ «Конъюгация» и последующей наземной селекции вариант продуцента интерлейкина-1? человека – E. coli BL21::Tn5/F?;pHIL1?OriT ? имеет высокую генетическую стабильность и превосходит по продуктивности штамм, используемый в действующем производстве препарата «БЕТАЛЕЙКИН». В идентичных условиях наиболее продуктивные клоны штамма E. coli С600/pHIL-1r? давали максимальный уровень продукции 2,2 мкг/мл культуры, полученный в КЭ «Конъюгация» штамм E. coli BL21::Tn5/F?;pHIL1?OriT – 3,9 мкг/мл.
Для подтверждения универсальности данного методического подхода, а также для приближения результатов исследования к практике был выбран целевой белок, уже применяемый в научно-практической деятельности. В качестве такого белка выбрали Cu, Zn-супероксидисмутазу человека (СОД).
СОД обладает высоким терапевтическим эффектом при лечении хронических воспалительных заболеваний, в частности, артритов различной этиологии, при лечении ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, при лечении радиационных поражений организма. В последнее время на первое место выходит антишоковый эффект СОД при тяжелых ожогах и механических травмах.
В результате реализации двух КЭ «Конъюгация» в период МКС-24 и МКС-27 был успешно осуществлен перенос двух рекомбинантных плазмид, кодирующих целевой белок – Cu, Zn-супероксиддисмутазу человека (СОД). Из биоматериала, полученного при конъюгативном скрещивании в КЭ, были выделены четыре возможных варианта гибридных клонов E. coli – продуцентов СОД: две группы в зависимости от штамма-реципиента и плазмиды и по два варианта гибридов в каждой группе: гибриды I-го типа, получившие в результате мобилизации только рекомбинантную плазмиду, и гибриды II-го типа, получившие дополнительно конъюгативную плазмиду F?.
Средняя продуктивность полученных клонов двух вариантов штамма-продуцента
СОД составляла 170-185 мкг/мл культуры, что достаточно велико для первичных клонов. В обоих случаях продуктивность полученных линий гибридных штаммов достаточно велика, чтобы использовать их в качестве исходного материала для селекции высокопродуктивных вариантов штаммов-продуцентов.
Продуктивность различных вариантов гибридных штаммов - продуцентов СОД, полученных в результате реализации космического эксперимента «Конъюгация», представлена на рисунке 2.
Рисунок 2 - Средняя продуктивность полученных линий гибридных штаммов – продуцентов СОД
Другой объект исследований, представляющий большой практический интерес – эпидермальный фактор роста человека (ЭФР). ЭФР является уникальным ростовым фактором, обеспечивающим монослойный рост кожи, то есть заживление ран без образования рубцов. Это обеспечило его широкое применение при лечении ожогов, для заживления послеоперационных швов, при лечении трофических язв, пролежней, обморожений, для профилактики и лечения радиационных дерматитов, а также в косметической хирургии.
Получение гибридов – продуцентов ЭФР в КЭ «Конъюгация» встретилось с серьёзными трудностями. Из-за высокой токсичности целевого продукта для бактериальной клетки полученные гибриды постепенно утрачивали способность синтезировать ЭФР. Наконец, в результате реализации КЭ «Конъюгация» в период МКС-39 путём комбинации предварительной селекции в КЭ и последующей наземной селекции удалось выделить две стабильных чистых линии штамма-продуцента ЭФР ? E. coli BL21(DE3)/F?;pEThEGFоriT. Обе полученные линии штамма – продуцента ЭФР проявляли высокую генетическую стабильность и воспроизводимость по выходу целевого продукта. Данные по продуктивности отдельных субклонов (бактериальных культур, полученных из отдельной колонии) полученного штамма представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Содержание ЭФР в биомассе индуцированных культур чистых линий E. coli BL21(DE3)::Tn5/ F?; pEThEGFOriT – продуцента ЭФР.
№ субклона | Выход ЭФР (мкг/мл культуры) | |
Для субклона | Средний по линии | |
8/1 | 160 | 124 (±6)* |
8/2 | 134 | |
8/3 | 117 | |
8/4 | 105 | |
8/5 | 112 | |
8/6 | 128 | |
8/7 | 124 | |
8/8 | 107 | |
11/1 | 137 | 125 (±4)* |
11/2 | 115 | |
11/3 | 120 | |
11/4 | 115 | |
11/5 | 143 | |
11/6 | 109 | |
11/7 | 119 | |
11/8 | 113 |
*/ В скобках приведено стандартное отклонение средней величины
Полученные варианты штамма E. coli BL21(DE3)/F?;pEThEGFоriT представляют интерес в качестве перспективных для производств штамма - продуцента ЭФР.
Полученные данные подтвердили, что метод мобилизации рекомбинантных плазмид при бактериальной конъюгации в КЭ позволяет получать бактериальные штаммы-продуценты с высоким уровнем биосинтеза целевого продукта, достаточного для практического применения.
Заключение
В результате проведённой серии КЭ «Конъюгация» разработан оригинальный методический подход для получения рекомбинантных штаммов E. coli – мобилизация плазмид при конъюгативном скрещивании бактерий в условиях микрогравитации. По эффективности переноса плазмид данный метод превосходит большинство методик генетической трансформации бактерий и может конкурировать с наиболее эффективным её вариантом – переносам плазмид методом электропорации.
Подтверждением надежности и универсальности метода мобилизации рекомбинантных плазмид в условиях микрогравитации является успешное получение продуцентов трёх различных белков человека, имеющих перспективы в качестве применения в медицине: интерлейкина 1?, эпидермального фактора роста (ЭФР) и Cu, Zn-супероксиддисмутазы.
В результате наземной селекции получены:
- 2 варианта гибридного штамма – продуцента интерлейкина-1?, способные синтезировать значительные количества ценного белка; в ходе наземной селекции получены 4 варианта гибридных штаммов – продуцентов СОД, отличающиеся по типу контроля продукции СОД; из биоматериала, полученного в КЭ, выделены две чистые линия штамма, синтезирующие значительное количество эпидермального фактора роста человека, по генетической стабильности и продуктивности соответствующие уровню промышленного продуцента.
Полученные штаммы будут использованы в качестве исходного материала для селекции высокопроизводительных штаммов в технологических разработках контур».
Публикации
, , и др. Изучение процессов конъюгации и генетической рекомбинации у клеток Escherichia coli в условиях космического полета.//Биотехнология.- 1994.- №7.- С.24-29. , , «Перенос плазмид при бактериальной конъюгации в условиях орбитального космического полета» // В сб.: Материалы научно-технической конференции по основным результатам научно-прикладных исследований на РС МКС, г.. Королев 2007г. , , . «Передача и обмен генетического материала при бактериальной коньюгации в наземных экспериментах, имитирующих условия орбитального полета», тезисы доклада на Международную научно-практическую конференцию «Пилотируемые полеты в космосе» (10-11 ноября 2005 г) , , «Перенос плазмид при бактериальной конъюгации в условиях орбитального космического полета»// Космонавтика и ракетостроение, №4(49), 2007г, стр.95.