Научно-техническое обоснование
космического эксперимента
"Изучение влияния факторов космического полета на активность фермент-субстратных систем" («Константа-2»)
1. Сущность исследуемой проблемы. Краткая история и состояние вопроса
Техническим заданием на КЭ «Константа» ставилась задача по выявлению наличия и характера влияния факторов космического полета на активность модельного ферментного препарата по отношению к специфическому субстрату. Для этого была сделана попытка измерить Км непосредственно на РС МКС с проведением синхронного наземного эксперимента. На основе анализа информативности известных фермент-субстратных систем, степени их разработки, условий проведения экспериментов на МКС, прежде всего требований по обеспечению безопасности экипажа для КЭ была выбрана система бутирилхолинэстераза – бутирилтиохолин. В этой системе измеряется единственный параметр – время распада бутирилтиохолина, которое регистрируется по совпадению окраски специального индикатора бис-азокрасителя (аналог реактива Эллмана) с цветным эталоном. Использование в качестве субстрата тиоэфиров позволяет проводить реакцию в фосфатном буфере при постоянном значении рН. Все измерения проводятся при температуре окружающей среды, которая на МКС достаточно стабильна. Температура синхронных наземных экспериментов корректируется в соответствии с температурой на борту МКС.
В целом Техническое задание на КЭ «Константа», включающее два этапа эксперимента выполнено в полном объёме. На первом этапе в 2009-2010 гг. подготовлено и проведено три сеанса КЭ, результаты экспериментальной работы изложены в научно-технических отчётах. С использованием научной аппаратуры «Рекомб-К» установлена возможность определения ферментативной активности изолированного препарата холинэстеразы по отношению к специфичному субстрату в условиях РС МКС. При подготовке ко второму этапу КЭ в 2010-2012 гг. создана специальная НА «Константа», проведена наземная отработка фермент-субстратной системы и проведены биолого-технические испытания НА. Результаты этих испытаний явились основанием для изготовления лётного образца специальной НА «Константа», разработки методики снаряжения НА, разработки циклограммы проведения эксперимента на РС МКС, включая методику документирования его результатов, а также обучения и тренировок экипажей.
В 2011-2012 гг. экипажами МКС-27, МКС-29 и МКС-31 проведены три сеанса лётного эксперимента.
Полученные результаты позволяют считать, что в проведенных сеансах решена главная задача научной программы КЭ «Константа». Экспериментально изучена классическая зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации специфичного субстрата, рассчитаны значения константы Михаэлиса. Установлено, что в условиях космического (орбитального) полета активность бутирилхолинэстеразы по отношению к бутирилтиохолину значительно выше, чем в синхронном эксперименте на Земле.
Во всех трех сеансах активность фермента на МКС регистрируется через 2-3 недели после того, как на Земле ферментативная активность в той же системе полностью отсутствует. Наблюдаемый эффект по нашему мнению может быть обусловлен только действием микрогравитации.
В интересах науки и для закрепления приоритета результатов исследований в частности необходимо их подтверждение на других фермент-субстратных системах или из других классов ферментов (оксидоредуктазы, трансферазы, лиазы, изомеразы и лигазы).
Соотношение размеров ферментов и их субстратов варьирует в очень широких пределах. Так, молекулярная масса ацетилхолинэстеразы составляет немного более 300000 дальтон, а молекулярная масса гидролизуемого ею субстрата - ацетилхолина составляет всего 146 дальтон. Напротив, небольшие по размеру пищеварительные ферменты, такие как a-амилаза (молекулярная масса не превышает 50000 дальтон) атакуют одну специфическую сложноэфирную связь высокомолекулярного субстрата – крахмала (молекулярная масса исчисляется миллионами дальтон).
Представляется, что в КЭ предпочтение должно быть отдано ферментам с наивысшей скоростью катализируемой ими реакции, для которых характерна высокая степень соответствия (комплементарность) между пространственными структурами субстрата и активного центра фермента. Также методически важно, чтобы субстрат преобразовывался необратимо, а влияние продуктов его распада на скорость реакции было минимальным или отсутствовало полностью.
Поэтому, с целью максимального использования существующей научной аппаратуры и методических наработок, предлагается провести серию экспериментов с уже изученными системами. Полученные в такой системе результаты, во-первых, будут сопоставимы с известными литературными данными, во-вторых, могут быть прямо использованы в интересах космической медицины.
2. Необходимость проведения КЭ в условиях космического полета
Проведенные исследования в период и после пребывания различных биообъектов в условиях космических полетов и, прежде всего, в условиях долговременных экспериментов на орбитальных станциях, свидетельствуют о развитии явлений дисгармонии тонко настроенных биохимических механизмов гомеостаза и метаболизма, как у теплокровных организмов, так и у высших растений и микроорганизмов. Причины и механизмы таких перестроек, к сожалению, пока остаются невыясненными.
Подробное рассмотрение ситуации позволило заключить, что ответ на вопрос о причинах сбоев реакций биокатализа в условиях космических полетов можно было бы получить при исследовании количественных характеристик активности ферментов в их реакции со специфичным субстратом, поскольку косвенно на такую возможность указывали результаты отдельных космических экспериментов.
Необходимость проведения исследований в реальных условиях космоса определяется целью и задачами эксперимента и диктуется невозможностью имитировать на Земле совокупность действия ФКП, присущих орбитальному полету и космическому пространству, на свойства и специфическую активность ферментов.
3. Описание КЭ
Основной целью эксперимента «Константа-2» является исследование наличия и характера влияния факторов космического полета на активность различных ферментных препаратов по отношению к специфическому субстрату в зависимости от принципа действия (расщепление, синтез) и молекулярной массы.
3.1.Порядок проведения КЭ
Для проведения КЭ на борт доставляется и используется аппаратура «Константа». Рекомендуемое время начала сеанса 4-е – 5-е сутки после доставки аппаратуры на МКС.
Температура окружающей среды контролируется на месте проведения эксперимента с помощью регистратора температуры.
Перед началом эксперимента включить видеокамеру и произвести фотографирование исходного состояние кассеты (фото №1). Затем произвести одновременное перемещение жидкости из емкостей №1 и №2 в камеры смешения и включить электронный секундомер. Время перемещения рабочих растворов является временем начала эксперимента. Кассету снять с панели, энергично встряхнуть 4-5 раз в двух плоскостях снова закрепить на панели. Для получения корректных результатов необходимо хорошее перемешивания рабочих растворов, которое, как показали эксперименты второго этапа НИР в условиях микрогравитации достигается с трудом.
Визуально наблюдать за изменением окраски дисков в камерах смешения до её совпадения с цветовыми шаблонами (закреплены на кассета) и проводить фотосъёмку. В момент совпадения окраски на диске какой-либо камере смешения с цветом эталона сфотографировать диск, записать это время и продолжить наблюдение за изменением окраски раствора на остальных дисках. Наблюдение и фотографирование может быть прекращено, когда окраска дисков во всех ячейках совпала с шаблоном. Весь эксперимент фиксируется видеокамерой, что позволяет уточнить результаты и оценить работу оператора. Одновременно на Земле проводится такой же эксперимент с идентично снаряженной кассетой. Поскольку активность фермента в процессе КЭ постоянно снижается, быстрое получение результатов КЭ и сопоставление их с наземными экспериментами позволяет оперативно ориентировать космонавта о возможном ходе следующей сессии КЭ.
Всего в эксперименте должны быть использованы все 6 кассет укладки, отсутствие аналитического эффекта (изменение цвета) свидетельствует о полной инактивации фермента и не является отрицательным результатом.
После возвращения на Землю укладки «Константа-2» и проведения регламентных работ кассеты могут быть использованы для наземной части эксперимента и для тренировок экипажей.
3.3.Технические особенности КЭ
Решение проблемы основано на принципе измерения скорости реакции превращения субстрата ферментом. Управляемое изменение скорости реакции достигается простым изменением концентрации субстрата. Регистрация самой реакции превращения субстрата осуществляется по изменению окрашивания (возможно, обесцвечивание) реакционной смеси. Точное измерение времени появления специфического окрашивания реакционной смеси — главный параметр такого космического эксперимента.
Для обоснованного выбора модельной фермент-субстрат-индикаторной системы необходимо оценить условия, в которых должны осуществляться эксперименты, возможность их стандартизации и коррекции
4. Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными отечественными и зарубежными исследованиями
Экспериментальные данные об изменении характеристик реакций биокатализа в условиях Космоса являются оригинальными. Они дают возможность приблизиться к выявлению причин изменений молекулярных механизмов реакций живой материи в условиях Космоса.
Такие данные необходимы для создания надежных средств профилактики и защиты от агрессивных факторов космоса, а также в реальном освоении биотехнологий, необходимых для реализации длительных космических полетов и колонизации космических объектов солнечной системы.
Работы по получению количественных характеристик активности ферментов в их реакции со специфичным субстратом на РС МКС, в условиях орбитального космического полета и последующего наземного анализа за рубежом не проводились
5.Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование
5.1.Основными результатами КЭ будут следующие:
- экспериментальное определение интегрального влияния факторов космического полета на устойчивость и биокаталитическую активность важнейших ферментов млекопитающих;
- определение возможности как оперативного, так и систематического контроля биохимических показателей космонавтов в условиях космического полета с помощью ферментных тест-систем;
- определение возможных направлений защиты ферментных систем животных от нежелательных воздействий факторов космического полета.
6. Обоснование технической возможности создания НА с заданными характеристиками
Техническая возможность создания аппаратуры для КЭ «Константа-2» обосновывается имеющимися образцами оборудования, основанными на перетеснении культуры из одной емкости в другую: НА «Рекомб-К», НА «Константа»
7.Характеристики рисков и дискомфорта для экипажа, связанных с КЭ
7.1.Проведение эксперимента на борту МКС не должно создавать опасных ситуаций для экипажа и МКС. На всю аппаратуру для проведения КЭ, включая биопрепараты, доставляемую на МКС, должны быть оформлены сертификаты по безопасности.
Список цитируемой литературы
А. Ленинджер Биохимия, изд. Мир, Москва, 1974 и др. Биотехнология. Т. 7. Иммобилизованные ферменты, Высшая школа,1987. бщая микробиология М: «Мир» 1987 576 с. , , Основы медицинской бактериологии, вирусологии и иммунологии. - М.: Логос, 2003. 264 с. , Биотехнология: генетические основы, микробиологические процессы. – М., 2002. – 245 с. Биологическая наука и Биотехнология в России, Национальный исследовательский Совет, the National Academies of Sciences, USA, РАН, Москва, 2006г . Альтернативы медицины. Том 1. Основы биомедицины и фармакомоделирования, Москва. 2007г. Экспресс-отчет по КЭ «Константа» в период МКС-25, инв. № 000. Экспресс-отчет по КЭ «Константа» в период МКС-27, инв. № 000. Этапный отчет по КЭ «Константа» за 2011г., инв. № 2342. Экспресс-отчет по КЭ «Константа» в период МКС-29, инв. № 000. Экспресс-отчет по КЭ «Константа» в период МКС-31, инв. № 000. Экспресс-отчет по КЭ «Константа» в период МКС-33, инв. № 000. Экспресс-отчет по КЭ «Константа» в период МКС-35, инв. № 000.