Диагностирование вирусоносительства картофеля в системе семеноводства

ДИАГНОСТИРОВАНИЕ ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВА

КАРТОФЕЛЯ В СИСТЕМЕ СЕМЕНОВОДСТВА

, ,

ВКГУ имени С. Аманжолова, г. Усть-Каменогорск, Казахстан

Картофель – одна из самых популярных сельскохозяйственных культур, используемая как в свежем виде, так и для переработки на картофелепродукты, основные из которых чипсы, картофель-фри, пюре, крахмал, спирт, а также на кормовые цели.

Одним из главных факторов, определяющих хронически низкий уровень урожайности картофеля, является использование некачественного семенного материала, зараженного инфекционными фитопатогенами [1].

Практически повсеместное распространение имеют вирусные болезни с тенденцией возрастания и вредоносности в основных картофелепроизводящих регионах. Особенно опасная тенденция наблюдается в связи с усилением вредоносности тяжелых форм вирусного и вироидного заражения (морщинистая и полосчатая мозаика, скручивание листьев, веретеновидность клубней и др.) на многих сортах картофеля, находящихся в хозяйственном и торговом обороте.

Эта тенденция во многом усугубляется недостаточным объемом производства гарантированного здорового (свободного от фитопатогенных вирусов) исходного материала для оригинального и элитного семеноводства, а также отсутствием в стране эффективного вирусологического контроля, всестороннего мониторинга и прогноза численности насекомых-переносчиков фитопатогенных вирусов на картофеле.

В настоящее время известно около 40 фитопатогенных вирусов, идентифицированных на картофеле в различных странах и регионах с разнообразными природно-климатическими условиями. На основе современных представлений и сведений, опубликованных в мировой литературе по культуре картофеля в последние годы, к числу наиболее важных фитопатогенных вирусов, получивших практически повсеместное распространение везде, где возделывается картофель, относятся вирусы: скручивания листьев картофеля, ВСЛК; Y картофеля, УВК; X картофеля, XВК; S картофеля, SВК; М картофеля, МВК.

Фитопатогенные вирусы вызывают серьезные болезни картофеля, которые приводят к значительным потерям урожая. Вирусные частицы можно рассмотреть только при помощи электронного микроскопа. Они обычно содержат в качестве инфекционного начала нуклеиновую кислоту, окруженную протеиновой оболочкой. Вирусы картофеля различаются по размеру и форме частиц. Они могут быть либо изометрическими, например, вирус скручивания листьев, либо палочковидными и нитевидными, например, вирусы картофеля X, S, M, Y, Aи вирус мозаики aucuba.

В настоящее время в Российской Федерации для решения важнейших практических задач развития оригинального, элитного и репродукционного семеноводства картофеля актуальным является освоение современных методов вирусологического контроля и схемы сертификации семенного картофеля.

Распознать вирусы по симптомам инфицированных растений иногда бывает достаточно сложно. В некоторых случаях даже эксперты затрудняются идентифицировать вирусы, а внешние симптомы их проявления иногда могут отсутствовать. Поэтому, наряду с приобретением практических навыков распознавания симптомов вирусных болезней на растениях и клубнях, важное значение имеет применение современных лабораторных методов вирусологического контроля на основе иммуноферментного (ИФА) и молекулярно-гибридизационного анализа (МГА).

Главной целью использования лабораторных методов в процессе оригинального семеноводства является получение качественного здорового семенного материала, соответствующего требованиям существующих нормативных допусков.

В практической работе по семеноводству картофеля основой вирусологического контроля является проведение тщательных визуальных оценок по внешним симптомам проявления вирусных болезней и своевременное удаление больных растений в период вегетации. Однако внешние симптомы могут отсутствовать на растениях, когда инфекция находится в скрытой форме. Поэтому введение в схему сертификации семенного картофеля лабораторных метолов диагностики, позволяющих  выявить вирусные патогены в скрытой форме, имеет чрезвычайно важное значение в решении проблемы повышения качества семенного картофеля.

Для проведения лабораторного тестирования на скрытую зараженность картофеля вирусами используется метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Этот метод обеспечивает достаточно высокую эффективность диагностики вирусов и возбудителей некоторых бактериозов картофеля [2].

В основе всех методов иммунодиагностики лежит выявление комплекса антиген-антитело. В одной группе методов (капельная агглютинация, ммунодиффузные тесты) эти компоненты выявляют визуально, так как они имеют высокую светорассеивающую способность. Другие методы основаны на введении специальной метки в молекулы антител. В случае иммуноферментного анализа к молекуле антитела «пришивается» фермент. Из многочисленных модификаций иммуноферментного анализа наибольшее предпочтение в практике получил сэндвич-вариант твердофазного ИФА (метод двойных антител). Основное его достоинство – высокая чувствительность, превосходящая возможность других схем.

Принцип сэндвич-варианта твердофазного ИФА основан на последовательном взаимодействии тестируемого вируса с иммобилизованными на твердой фазе и меченными ферментом антителами с последующим выявлением фермента-маркера субстратом. Оптическая плотность продукта ферментативной реакции пропорциональна концентрации определяемого вируса. Поскольку продукт ферментативной реакции имеет цветовую окраску, результаты можно учитывать как инструментально, так и визуально.

В качестве твердой фазы в практике наиболее часто применяется 96-луночные микроплаты из оптически прозрачного полистирола, позволяющие проводить весь цикл анализа от стадии иммобилизации до измерения ферментативной активности в каждой из лунок.

Чувствительность определения вирусов методом ИФА с помощью диагностических наборов в 100-1000 раз выше чувствительности метода капельной агглютинации и составляет около 10 нг/мл сока. Высокая чувствительность и специфичность метода открывают новые возможности его применения в селекционно-семеноводческой работе по картофелю.

Высокая чувствительность ИФА позволяет диагностировать вирусы с высокой степенью надежности в различном материале картофеля: меристемных растениях, тепличных и полевых растениях, ростках и глазках клубней.

Для получения достоверных результатов зараженности растений из верхушечных меристем необходимо провести не менее чем трехкратную их проверку в процессе микрочеренкования.

Первую проверку проводят во время черенкования первого растения с 5-6 листочками, полученного из верхушечной меристемы. Один из черенков в нижней части растения растирают в ступке, разбавляя буфером для проб и конъюгата в соотношении масса : объем – 1 :10. Необходимое количество экстракта для анализа пробы на один вирус составляет 0,1 мл.

Первая проверка позволяет выявлять 64-100% зараженных растений в зависимости от сорта и зараженности. На основе этой проверки растения-регенеранты, содержащие вирус, удаляют, а здоровые растения размножают микрочеренкованием. Линии, полученные при черенковании здоровых растений-регенерантов, тестируют повторно. Для достоверной оценки меристемной линии достаточно одного меристемного растения, чтобы получить из него сок с помощью ручного пресса. Минимальное количество сока, необходимое для анализа на один вирус, составляет 0,01мл. Затем сок нужно разбавить пробно-конъюгантным буфером в соотношении 1 : 10 непосредственно в лунке полистирольной платы, покрытой антителами [3].

Наши наблюдения, проведенные в течение вегетации 2013 года показали отсутствие на сортах явных признаков вирусных, вироидных и фитоплазменных болезней.

Важным элементом на всех этапах оздоровления и воспроизводства оздоровленного семенного материала является контроль качества семенного картофеля, в основе которого лежит комплекс методов диагностики патогенов.

Нами был освоен метод иммуноферментного анализа (ИФА) и завезен из ВНИИКОХ им. набор иммунодиагностических реагентов для определения вирусов картофеля и выполнен анализ в период цветения меристемных полевых растений.

От посадки микрорастений до анализа прошел период по сортам 1,5-2,0 месяца и появилось скрытое вирусоносительство вируса Х у сорта Белоснежка до 6%, вируса S у сортов Ароза, Майя и Розара до 1%, Брянского деликатеса и Белоснежки до 3%, Сантэ и Латона до 1%. Наибольшее развитие вируса S наблюдается в сортах Тамыр – 20%, Жанасай – 21,0% и Улан – 25%. Вируса Ј  нами не обнаружено. Неудача постигла определение вируса М, результаты которого все время вызывали сомнения.

Полученные данные говорят о серьезности положения данного вопроса, необходимости организации определения скрытого вирусоносительства не только по листовым пробам, но и на всех этапах оригинального семеноводства и осуществлении контроля качества в каждом элит производящем хозяйстве.

Необходимо начать изучение и внедрение метода ПЦР, как наиболее мобильного и эффективного. Вопрос стоит в оборудовании и организации лаборатории, в которой можно будет проверять как пробирочные растения in vitro, так и растения в разных фазах вегетации в поле и клубнях.

Литература

1. , , и др. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. – М.: Картофелевод, 2009. – 272 с.

2. Фитопатогенные вирусы и их контроль в семеноводстве картофеля (Практическое руководство). – М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2004. – 80 с.

3. Новые технологии производства оздоровленного исходного материала в элитном семеноводстве картофеля (Рекомендации). М. – 2000.