Приложение№3
Определение видовой и родовой принадлежности бактерий
Цель: установить могут ли найденные в помещении Лицея бактерии представлять опасность.
Образцы для исследования:
Женский туалет после уборки (Ж) – были найдены палочки (см. Приложение№2) Женский туалет до уборки (Х) – представляет собой благоприятную среду для развития патогенной микрофлоры. Раздевалка (Р) - самый высокий уровень загрязнения (см. основную работу, таблица №2). Кабинет до проветривания (Д) – представляет собой благоприятную среду для развития патогенной микрофлоры.На первом этапе была проведена ПЦР-амплификация (с использованием специальных праймеров) фрагмента гена 16S рибосомной РНК. Так, как именно этот ген уникален для каждой бактерии, и по нему через базу данных очень просто определить, к какому роду относятся выделенные нами микроорганизмы. Последовательность гена 16S pРНК – это своеобразный паспорт бактерии, зная который, становится несложно определить видовую принадлежность, поскольку эта последовательность для каждой бактерии уникальна.
ПЦР амплификация достаточно сложный, долговременный процесс, который включает в себя множество этапов. Однако на сегодняшний день, это самый точный способ для определения наличия возбудителя заболевания в биологических образцах.
Суть диагностики ПЦР-амплификации заключается в многократном удвоении определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. В результате количество этого фрагмента ДНК увеличивается настолько, что становится достаточным для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который мы зададим сами, благодаря использованию специфических праймеров – своеобразных «затравок».
Для проведения ПЦР необходимы следующие компоненты1 :
-ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать (ДНК бактерий из выбранных образцов, всего 4 пробирки Р, Д, Х, Ж)
-два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента (для ограничения начала и конца амплифицируемого участка.)
-термостабильная ДНК-полимераза (катализирует реакцию полимеризации ДНК)
-дезоксинуклеотидтрифосфаты A, G, C, T (нуклеотиды для построения новых цепей ДНК)
-ионы Mg2+ (необходимы для работы полимеразы)
-буферный раствор (обеспечивает необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора)
Из этих компонентов были приготовлены 4 реакционных смеси в специальных микропробирках. Отличие в постановке реакции определялось внесением различной матрицы ДНК - для каждого из образцов Р, Д,Х, Ж добавлялась своя ДНК. Остальные же компоненты и их количество во всех 4-х реакционных смесях оставались одинаковыми. Пробирки с реакционной смесью были помещены в аппарат –амплификатор, в котором в течение 1, 5 часов происходили цикличные изменения температуры, способствующие увеличению копий ДНК в геометрической прогрессии.
После этого в качестве проверки необходимо провести электрофорез полученных амплифицированных участков ДНК в агарозном геле, который покажет, насколько удачно удалось амплифицировать ДНК бактерий.
При проведении электрофореза фрагменты ДНК мигрируют в специальном агарозном геле, который залит буферным раствором, под воздействием электрического тока. Дело в том, что сахарофосфатный остов молекул ДНК имеет отрицательный заряд и поэтому цепи ДНК двигаются в электрическом поле от отрицательного катода к положительному аноду.
Перед началом электрофореза к образцам необходимо добавить краситель (бромфеноловый синий), чтобы визуализировать ход электрофореза, и утяжелитель - сахарозу, чтобы образцы не растекались в буферном растворе. Краситель также необходим, чтобы впоследствии можно было увидеть результат под ультрафиолетовыми лучами. Таким образом, становится понятно, достаточно ли ДНК материала для дальнейшего исследования, и соответствует ли размер амплифицированных фрагментов ДНК расчетному. Если оба условия выполнены, можно говорить о корректном проведении ПЦР и переходить к следующему этапу.
После того как стало ясно, что количество материала достаточно, началась работа над следующей стадией - клонированием ДНК. Клонирование ДНК (клонирование генов) — процесс выделения заданной последовательности ДНК и получения многих её копий in vitro.
Эта стадия предшествует окончательному этапу - секвенированию последовательности фрагмента гена 16S рРНК, зная которую, можно провести типирование анализируемых бактерий, то есть определить их видовую и родовую принадлежность.
Амплифицированные в ходе ПЦР фрагменты ДНК были клонированы в специальный вектор pGEM-T при помощи фермента ДНК-лигазы. Лигаза позволяет фрагменты исследуемой ДНК с ДНК вектора. В результате смыкания исследуемой ДНК и векторной ДНК образуется рекомбинантная кольцевая молекула ДНК.
Далее образованные рекомбинантные молекулы вводят в клетки с целью добиться их репликации (за счет генетического вектора) и увеличения количества копий. Наиболее популярным способом введения в клетки рекомбинантных молекул ДНК, в которых вектором служит плазмида, является трансформация этими молекулами клеток кишечной палочки
Е. coli. Уникальность Esсherichiacoli состоит в том, что она является самой быстро делящейся бактерией на земле, соответственно воспроизводить себе подобных (клонировать), она будет с большой скоростью. Данный подход позволит в очередной раз многократно увеличить количество исследуемого фрагмента гена 16S pPHK (на данном этапе уже в составе кольцевой рекомбинантной ДНК) .
Для того чтобы клетки Е. coli были способны к восприятию рекомбинатной ДНК, их подвергают тепловому шоку. При этом меняется проницаемость мембраны и клеточной стенки Е. coli и чужеродная кольцевая ДНК может заскочить внутрь. Данный процесс называется трансформацией.
После введения рекомбинатных молекул ДНК в бактерии последние высевают на МПА (мясо-пептонный агар), обогащенный антибиотиком ампициллином для селекции (отбора) желаемых клеток, т. е. клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Ген устойчивости к ампициллину содержался в векторе pGEM-T, а значит, содержится и внутри полученной нами рекомбинантной молекулы ДНК.
Для каждого образца (4 шт) берётся по 2 высева разного объёма: 50 мкл и 300 мкл. Это делается для того, чтобы не промахнуться с конечным результатом. Если изначально в образце было много палочек, то в образце 500 мкл будет слишком много колоний, и это затруднит дальнейшую работу, а если наоборот мало, то образец в 30 мкл будет недостаточно клонов для секвенировани.
Из полученных колоний Е. coli, содержащих рекомбинантную ДНК, выделяется плазмидная кольцевая ДНК с фрагментом интересующего нас гена 16S рРНК, далее происходит секвенирование.
В результате получается последовательность нуклеотидов, по которой можно легко установить к какому роду принадлежат бактерии из образцов воздушной среды, отобранных в помещениях лицея.
По итогам была составлена таблица. (Фотографии выбранных колоний см в Приложении №2)
Таблица 1
Образец | Раздевалка | Кабинет до проветривания | Туалет женский до уборки | Туалет женский после уборки |
Род/вид бактерий | Roseomonas oryzae | Staphylococcus epidermidis | Agrococcus jenensis | Leifsonia xyli |
Безопасен для человека | нет | да | да | да |
Roseomonas oryzae.
Бактерии этого рода могут редко вызывать:
-бактериемию
-катетер-ассоциированные инфекции
-перитонит
1 https://www. invitro. ru/for-clients/mat/1133/
