ЗАНЯТИЕ 4
Тема: ФЕРМЕНТЫ. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ (УИРС)
Обоснование темы. Знание механизма действия ферментов как биокатализаторов, понимание закономерностей процессов, лежащих в основе повышения или понижения ферментативной активности, поможет будущему врачу глубже понять химическую сущность обмена веществ в организме человека в норме и при патологии, что позволит в дальнейшем проводить более обоснованную патогенетическую терапию при лечении соответствующих заболеваний.
Цель занятия:
1. Изучить механизм действия ферментов.
2. Усвоить принципы количественного определения активности ферментов.
Необходимый исходный уровень:
Из курса биоорганической химии студенты должны знать:
-механизм действия ферментов;
- кинетику ферментативных реакций.
Основные понятия темы: активный центр фермента, его свойства, механизм действия ферментов, принцип количественного определения активности фермента.
ВОПРОСЫ К ЗАНЯТИЮ
1. Структурно - функциональная организация ферментных белков: активный центр, его свойства. Контактный и каталитический участки активного центра ферментов.
2. Механизм действия ферментов. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и фермента. Константа Михаэлиса-Ментен.
3. Принципы количественного определения активности ферментов. Единицы активности.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
К ПРАКТИЧЕСКОЙ ЧАСТИ ЗАНЯТИЯ
Лабораторная работа: ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ
-АМИЛАЗЫ В СЛЮНЕ
Принцип метода:
Об активности фермента судят по уменьшению активности поглощения комплекса крахмал-йод при 640нм, обусловленному гидролизом субстрата реакции (крахмал) под действием амилазы слюны при инкубации при 370С в течение 6 минут. Реакцию останавливают добавлением раствора соляной кислоты 0,15 моль/л.
ХОД РАБОТЫ:
Проводим ферментативную реакцию в двух пробирках
Опытная проба Контрольная проба
3. Рабочий субстратно-буферный раствор 0,5 мл 0,5 мл
Инкубировать в термостате 5 минут при 370С
4. Слюна
(источник фермента) 0,01мл -
Инкубировать в термостате точно (!) 6 минут при 370С
5. раствор соляной кислоты (0,15 моль/л) 4,0 мл 4,0 мл
6. Слюна - 0,02 мл
7. Раствор йода 0,3 мл 0,3 мл
Перемешать
После добавления всех реагентов и перемешивания немедленно фотометрируют в кюветах 1 см при длине волны 630 нм (630-690 нм) против дистиллированной воды. Активность фермента в исследуемом образце выражают в единицах, которые определяют как количество крахмала (мг), гидролизованного за 1 секунду при 370С и относят к 1л жидкости. Расчет активности проводят по формуле:
Активность амилазы (ед.) =
Ео, Ек – оптическая плотность пробы и стандарта; d – разведение исследуемого материала (для слюны в 10 раз).
Нормальные величины: амилаза слюны в норме от 62,5 ед. до 250 ед.
Клинико-диагностическое значение: активность б-амилазы в слюне может повышаться при приеме пищи богатой углеводами, повышение активности наблюдается при гиперсаливации, а также при заболеваниях слюнных желез (паратите). Понижение активности б-амилазы слюны наблюдается при гипосаливации, при бессолевой диете (анион Cl - активатор амилазы слюны) и некоторых заболеваниях полости рта.
Результат:
Вывод:
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ
1. Ответить на следующие тесты
1. Выберите правильный ответ
Количественное измерение ферментов основано на зависимости скорости реакции от:
1. температуры
2. времени инкубации субстратов с ферментом
3. величины рН
4. концентрации субстрата
5. концентрации фермента
2. Выберите правильные ответы
Скорость ферментативной реакции зависит от:
1. температуры
2. времени инкубации субстрата с ферментом
3. величины рН
4. концентрации субстрата
5. присутствия ингибитора
3. Выберите правильные ответы
В состоянии равновесия в ферментативной реакции:
1. происходит изменение концентрации субстрата
2. образуется фермент-субстратный (ЕS) комплекс
3. происходит изменение концентрации продукта
4. соотношение скорости прямой и обратной реакции зависит от концентрации S и Р
5. скорость прямой реакции равна скорости обратной
4. Выберите правильные ответы
Константа Михаэлиса (Км):
1. параметр константы ферментативной реакции
2. может иметь разное значение для изоферментов
3. величина, при которой все молекулы находятся в форме ЕS
4. чем больше ее величина, тем больше сродство Е к S
5. концентрация S, при которой достигается половина максимальной скорости реакции (V мах)
5. Выберите правильные ответы
Активный центр ферментов:
1. это участок, комплементарного взаимодействия с S и непосредственно участвующий в катализе
2. может связывать структурные аналоги S, что мешает катализу
3. имеет строго определенные границы, что исключает влияние окружающих групп на катализ
4. формируется как из полярных, так и из гидрофобных аминокислот разных участков полипептидного остова
5. включает участок (домен) для связывания кофактора
6. Выберите правильные ответы
Образованию фермент-субстратного комплекса предшествует:
1. диссоциация продукта от фермента и возвращение фермента в исходное состояние
2. изменение порядка соединения аминокислот в полипептидной цепи
3. установление индуцированного комплементарного соответствия между Е и S
4. сближение функциональных групп, участвующих в катализе
5. изменение конформации как Е, так и S
ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Биохимия / под ред. . – М.: ГЭОТАР – МЕД, 2009. – 759с
2. Щербак, химия / . Спб ГМУ, 2005. – 479с.
ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ЛИТЕРАТУРА
1.Березов, химия / , . – М.: Медицина, 1998.- 704 с.
2. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / под ред. . - М.: ГЭОТАР – МЕД, 2008.- 380 с.
3. Николаев, химия / .- М.: МИА, 2007. – 565 с.
4. Биохимия человека. В 2 –х томах / Р. Марри и др. – М.: Мир, 1993.- 347 с.
5. Биохимия / . - М.:Медицина, 2010.- 605 с.
