Иммуноглобулин противооспенный лошадиный очищенный, раствор для внутримышечного введения

__________________________________________________________________

Иммуноглобулин противооспенный                        ФС

лошадиный очищенный, раствор

для внутримышечного введения                         Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин противооспенный лошадиный очищенный, раствор для внутримышечного введения, применяемый для экстренной профилактики и лечения натуральной оспы и заболеваний, вызываемых патогенными для человека ортопоксвирусами, а также лечения больных (за исключением детей) с осложнениями после прививок оспенной вакциной.

Основным действующим веществом препарата являются антитела (иммуноглобулины класса G лошади), нейтрализующие патогенные для человека ортопоксвирусы.

Иммуноглобулин противооспенный лошадиный очищенный, раствор для внутримышечного введения выпускается в комплекте с иммуноглобулином лошадиным противооспенным очищенным в разведении 1:100.

Препараты иммуноглобулина противооспенного лошадиные не содержат консервантов и антибиотиков.

ПРОИЗВОДСТВО

Для производства иммуноглобулина противооспенного лошадиного очищенного используется сыворотка крови лошадей, иммунизированных вирусом вакцины, штаммы Б-51 и Л-ИВП. Препарат иммуноглобулина противооспенного лошадиного очищенного представляет собой концентрированный раствор антител (иммунологически активной фракции иммуноглобулинов G (IgG) сыворотки крови лошадей), обладающих активностью антител к патогенным для человека ортопоксвирусам.

Производство иммуноглобулина противооспенного лошадиного очищенного должно осуществляться с соблюдением требований, указанных в ОФС «Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные».

Производственные штаммы

Производственный штамм Б-51 должен иметь типичные культуральные, морфологические, биологические и генетические свойства; обладать остаточной вирулентностью для кроликов (не должен вызывать гибели при внутримозговом н некрозов при внутрикожном введении в дозе 6 lg ООЕ). Культура штамма не должна содержать посторонних вирусных агентов и микоплазм, обладать биологической активностью, определенной на хорионаллантоисных оболочках 12–13-суточных куриных эмбрионов методом подсчета оспин, не менее 2⋅107 оспинообразующих единиц в 1 мл (ООЕ/мл).

Производственный штамм Л-ИВП должен иметь типичные культуральные, морфологические, биологические и генетические свойства: обладать остаточной вирулентностью для кроликов (не должен вызывать гибели при внутримозговом н некрозов при внутрикожном введении в дозе 4 lg ООЕ). Культура штамма не должна содержать посторонних вирусных агентов и микоплазм, обладать биологической активностью, определенной на хорионаллантоисных оболочках 12–13-суточных куриных эмбрионов методом подсчета оспин, не менее 8⋅107 ООЕ/мл соответственно.

При работе с производственными штаммами необходимо руководствоваться требованиями санитарных правил (СП) «Безопасность работы с микроорганизмами III–IVгрупп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», действующих в Российской Федерации.

ИСПЫТАНИЯ

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость. Допускается наличие незначительного осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Определение проводят визуально.

Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.

Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор с оптической плотностью не более 0,05. Определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм.

Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор с оптической плотностью не более 0,15. Определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм.

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».

Извлекаемый объем. Должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем».

рН. От 5,0 до 7,2. Испытуемый образец разводят до 1 % концентрации 0,9 % раствором натрия хлорида. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок. От 9 % до 11 %. Определение проводят колориметрическим методом c биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод А).

Сульфаты. Менее 3 мкг/мл. Определяют в соответствии с ОФС «Сульфаты».

Электрофоретическая однородность. Не менее 90 % гамма-глобулинов, альфа - и бета-глобулинов – не более 10 %. Наличие альбумина не допускается. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы».

Молекулярные параметры. Содержание мономеров и димеров иммуноглобулина G должно быть не менее 90 %, полимеров и агрегатов – не более 10 %, фрагменты должны отсутствовать. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ».

Термостабильность. Препарат должен оставаться жидким и не образовывать геля после выдерживания в водяной бане или водяном термостате при температуре (56±1)°С в течение 4 ч.

Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность. Должен быть апирогенным. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность» (тест-доза должна составлять 1,0 мл препарата на кг массы кролика)

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой тела 18–20 г и двух морских свинках массой –300 г. Тест-доза для белых мышей составляет 0,5 мл (внутрибрюшинно), для морских свинок – 5,0 мл (подкожно в оба бока по 2,5 мл). Период наблюдения за животными составляет 7 суток.

Специфическая активность. Титр вируснейтрализующих антител к вирусу вакцины, штамм Л-ИВП, должен быть не ниже 1:16000. Определение проводят в реакции нейтрализации с вирусом вакцины на хорионаллантоис-ных оболочках  куриных эмбрионов (КЭ) 12–13-суточного возраста от кур породы «Леггорн», «Роменбраун», «Родонид-2», «Изобраун» и «Хайсек» или другой породы, чувствительной к вирусу вакцины. Куриные эмбрионы получают из хозяйств, свободных от вирусных и других возбудителей, патогенных для человека. Метод анализа основан на способности специфических антител иммуноглобулина нейтрализовать вирус вакцины при температуре (35,0 ± 0,5) єС в течение 1 ч. Это действие проявляется в уменьшении числа оспин на ХАО КЭ в сравнении с контролем. За титр принимают наибольшее разведение сыворотки, вызывающее уменьшение 50 или более процентов числа оспин на ХАО КЭ в сравнении с контролем.

Контроль специфичесокй активности проводят одновременно с определением специфической активности стандартного образца специфической активности оспенной вакцины.

Подготовка КЭ

КЭ 12–13- суточного возраста после доставки в лабораторию просматривают под овоскопом. КЭ погибшие и с плохо развитыми кровеносными сосудами отбраковывают. Оставшиеся после отбраковки КЭ помещают в инкубатор, где их инкубируют при температуре (35,0 ± 0,5) єС и относительной влажности 50–60 % до отслаивания ХАО.

Приготовление растворов

В качестве разводящей жидкости в реакции нейтрализации используют цитратно-белковый раствор (ЦБР). В цитратно-белковый раствор еx tempore вводят бензилпенициллина натриевую (калиевую) соль и стрептомицина сульфат по 250 ЕД/мл.

Отслаивание ХАО КЭ

В реакции нейтрализации используют 12–13-суточные КЭ с отслоенными ХАО. Скорлупу над воздушной камерой КЭ обрабатывают спиртовым раствором йода и профламбированным пробойником пробивают в ней отверстие. Инъекционную иглу с затупленным концом вводят в проделанное отверстие и осторожно продвигают по внутренней поверхности скорлупы к участку ХАО, свободному от крупных кровеносных сосудов. При этом должна быть прорвана подскорлупная оболочка, выстилающая дно воздушной камеры КЭ, в месте перехода ее на скорлупу. Иглу продвигают не глубже 4–5 мм вперед от места разрыва подскорлупной оболочки. Отверстие в скорлупе заклеивают парафином. Отслаивают КЭ под овоскопом. Подготовленные КЭ укладывают на лотки отслоенными участками вверх и помещают в инкубатор при температуре от 35,0 до 36,0 оС не позднее чем за 2 часа до инфицирования.

Подготовка антигена (АГ)

В качестве антигена в реакции нейтрализации используют жидкую культуру вируса вакцины, приготовленную из вируссодержащих ХАО КЭ. Для этого 12–13-суточные КЭ инфицируют вирусом вакцины в дозе (1–10).104 ООЕ путем внесения вируссодержащей суспензии на предварительно отслоенную ХАО КЭ (методика отслаивания описана ниже). Зараженные КЭ инкубируют при температуре (35,0 ± 0,5) єС и относительной влажности (50–60) % в течение 48 ч, после чего вскрывают, отбирают пораженные вирусом ХАО, измельчают в течение 3 мин при 8000 об/мин с помощью измельчителя тканей и готовят 10 % суспензию на ЦБР. Полученную суспензию центрифугируют при 2500 об/мин в течение 10 мин, отбирают вируссодержащую надосадочную жидкость, добавляют стерильный глицерин до 10 %-ой (по объему) конечной концентрации. Срок хранения антигена – не более 2 лет при температуре не выше минус 20є С.

Перед постановкой реакции нейтрализации определяют рабочее разведение антигена. Из 10 %-ой суспензии культуры вируса вакцины готовят ряд десятикратных разведений на цитратно-белковом растворе до 10-6. Для этого отбирают пипеткой по 0,5 мл вируссодержащей суспензии и вносят в 2 пробирки, содержащие жидкость для разведения – 4,5 мл ЦБР с антибиотиками (бензилпенициллина калиевая или натриевая соль и стрептомицина сульфат в концентрации 250 ЕД/мл) – разведение 10-1. Из каждой пробирки с разведением 10-1 готовят 2 ряда последовательных 10-кратных разведений вируса. С этой целью по 0,5 мл разведенного материала переносят в последующую пробирку с 4,5 мл жидкости для разведения (разведение 10-2), не касаясь жидкости пипеткой, и т. д. до разведения 10-6. Для дальнейшей работы используют объединенные разведения вируса из двух параллельных рядов. Затем в чистые пробирки наливают по 0,8 мл каждого разведения вируса вакцины (с 10-2 по 10-6) и 0,8 мл цитратно-белкового раствора. Смесь ЦБР и вируса пипетируют и выдерживают при температуре 37 оС в течение 1 часа, после чего вводят по 0,2 мл на отслоенный участок ХАО КЭ. КЭ помещают в инкубатор при температуре от 35,0 до 36,0 оС и относительной влажности 50–60 % на 48 ч. После инкубации КЭ вскрывают и подсчитывают оспины на ХАО КЭ. За рабочее разведение вируса (АГ) принимают разведение, при котором на ХАО КЭ формируется от 30 до 50 оспин.

Разведение иммуноглобулина и контрольных сывороток

На цитратно-белковом растворе готовят ряд последовательных 10-кратных разведений исследуемого иммуноглобулина и стандартной положительной сыворотки: 1:10, 1:100, 1:1000 в объеме 1,0 мл каждое. Из последнего разведения 0,1 мл выбрасывают. Далее из разведения 1:1000 готовят ряд последовательных двукратных разведений: 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000, 1:32000 и 1:64000 в объеме 0,8 мл каждое. Из последнего испытуемого разведения 0,4 мл смеси выбрасывают.

Из контрольной отрицательной сыворотки, не содержащей специфические антитела, готовят разведение 1:5.

Приготовление рабочего разведения вируса (антигена)

Рабочее разведение вируса (АГ) готовят на цитратно-белковом растворе с учетом предварительного его титрования на ХАО КЭ. Рабочим разведением АГ считается разведение, вызывающее образование на ХАО КЭ от 30 до 50 оспин.

Смешивание рабочего разведения вируса (антигена) с разведениями испытуемых образцов и контрольных сывороток

В пробирки с 0,8 мл разведений иммуноглобулина и контрольной положительной сыворотки (от 1: 4000 до 1:64000) и разведения 1:5 отрицательной контрольной сыворотки добавляют равный объем (0,8 мл) АГ. С учетом данного смешивания разведения сыворотки увеличиваются в 2 раза (от 1:8000 до 1:128000 и 1:10). Штатив с пробирками встряхивают в течении 5–10 с и помещают в термостат при температуре 37 оС на 1 ч.

Приготовление контрольного разведения антигена

В две пробирки с 0,8 мл АГ добавляют по 0,8 мл цитратно-белкового раствора. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 оС, на 1 ч.

Инфицирование и инкубирование зараженных КЭ

На отслоенные ХАО КЭ в объеме 0,2 мл вводят:

- инкубированную смесь разведений иммуноглобулина с антигеном;

- инкубированное контрольное разведение АГ;

- инкубированную смесь антигена и разведений стандартной сыворотки, содержащей вируснейтрализующие антитела к ортопоксвирусам (положительный контроль);

- инкубированную смесь антигена и десятикратным разведением сыворотки, не содержащей вируснейтрализующих антител к ортопоксвирусам (отрицательный контроль);

В качестве стандартных контрольных используют гомологичные сыворотки, предварительно оттитрованные не менее 3 раз.

Каждое разведение сыворотки вводят в 4–6 шт. КЭ. На каждое контрольное разведение антигена используют от 5 до 10 шт. КЭ.

После инфицирования КЭ помещают в инкубатор при температуре (35,0 ± 0,5) єС и относительной влажности 50–60 % на 48 ч.

Учет результатов

После инкубирования КЭ вскрывают и подсчитывают число оспин на ХАО. После подсчета оспин на каждой ХАО КЭ определяют их среднее арифметическое значение для контрольного разведения АГ и отрицательного  контроля. Реакция подлежит учету при наличии в контрольном разведении АГ от 40 до 60 оспин и совпадении значений титра контрольных сывороток с ранее определенным. За титр сыворотки принимают ее конечное разведение, которое на ХАО КЭ вызывает на 50 % меньшее количество оспин по сравнению с контролем рабочего разведения АГ.

Пример расчета специфической активности иммуноглобулина представлен в таблице.

Таблица - Пример расчета специфической активности иммуноглобулина

Исследуемый образец	Разведение образца	Объем, вносимый в пробирку	Доза вируса вакцины (антигена), ООЕ/мл	Объем антигена, вносимый в пробирку	Полученное разведение образца	Количество КЭ на разве-дение	Количество оспин на ХАО КЭ, шт.	Сред-количество оспин, шт.	Титр ВНА
Исследуемый иммуногло- булин	1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000	0.8 0,8 0,8 0,8 0,8	450 ООЕ/ мл	0.8 0,8 0,8 0,8 0,8	1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000	4 4 4 4 4	5,4,2,1 10,8,11,7 24,18,17,25 38,41,40,37 43,47,40,46	3 9 21 39 44	1:32000
Стандартный образец (положитель-ный контроль)	1:4000 1:8000 1:16000 1:32000 1:64000	0.8 0,8 0,8 0,8 0,8	450 ООЕ/ мл	0.8 0,8 0,8 0,8 0,8	1:8000 1:16000 1:32000 1:64000 1:128000	4 4 4 4 4	3.6,2,1 12.16,22.10 22,18,19,25 39,41,44,37 43,47,40,46	3 15 21 40 44	1:32000
Нормальный лошадиный иммуноглобулин (отрица-тельный контроль)	1:5	0,8	450 ООЕ/ мл	0,8	1:10	4	44,42,36,48	43	≤1:5
ЦБР (конт-роль рабоче-го разведе-ния антигена	-	0,8	450 ООЕ/ мл	0,8	-	10	48,50.36.42.40. 32.38.49.30.32	40	-

Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с препаратом

Иммуноглобулин лошадиный против Боливийской геморрагической лихорадки разведенный 1:100

Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.

Прозрачность. Испытуемый раствор не должен отличаться по своей прозрачности от растворителя, используемого при его приготовлении. Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».

Цветность. Бесцветный раствор, не превышающий степень окраски эталона Y7 Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС « Степень окраски жидкостей».

рН. От 5,0 до 7,2. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок. От 0,09 до 0,11 %. Определение проводят  колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод Б).

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС «Стерильность».

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °С, в условиях, исключающих замораживание.