Антигены (стр. 3 )

Оценка результатов

Нет агглютинации во всех сыворотках - это Оab(I) группа крови Агглютинация в сыворотках Оab(I) и Вa(III) - это Аb(II) группа крови Агглютинация в сыворотках Оab(I) и Аb(II) - это Вa(III) группа крови Агглютинация во всех сыворотках - это АВ0(IV) группа крови

Рис. 13. Результат РГА при определении группы крови АВО: а) - отрицательная РГА (нет гемагглютинации); б) - положительная РГА (гемагглютинация).

Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, то для исключения неспецифической агглютинации необходимо провести дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой АВ0(IV) группы. Для этого на плоскость наносят большую (0,1 мл) каплю сыворотки АВ0(IV) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл) каплю исследуемой крови и смотрят результат через 5 минут. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле при наличии ее в каплях со стандартными сыворотками групп Оab(I), Аb(II) и Вa(III) позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ0(IV).

Лабораторная работа 6 Гемагглютинация, ее разновидности и аспекты применения

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 6

ГЕМАГГЛЮТИНАЦИЯ, РАЗНОВИДНОСТИ И АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ

Феномен агглютинации заключается в том, что антитела, взаимодействуя с корпускулярными антигенами вызывают их склеивание с образованием агрегатов, хлопьев, зерен, комочков, различаемых невооруженным глазом или с помощью лупы.

Антитела, принимаемые участие в реакции агглютинации, называются агглютининами, а антигены – агглютиногенами, образующийся при этом осадок – агглютинатом. Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

АГ (агглютиноген)+ АТ (агглютинин)+

электролит (изотонический раствор хлорида натрия) = агглютинат

Рис.1 Схема РА

Различают реакции прямой и непрямой агглютинации. При реакции прямой агглютинации антитела агглютинируют корпускулы непосредственно, а при реакции непрямой (пассивной) агглютинации ей повергаются растворимые антигены, предварительно адсорбированные на корпускулярном носителе, которым могут быть инертные частицы (латекс, оксид бария, бентонит) или клетки (эритроциты барана, I(0)-группы крови человека). Если в качество носителя применяются эритроциты, то реакция называется реакциейпассивной гемагглютинации (РПГА).

Рис.2 Схема РПГА

Эритроциты при их использовании в качестве носителя взаимодействуют с антигеном, склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок.

Сенсибилизированные антигеном эритроциты используют в РПГА как эритроцитарный диагностикум для обнаружения антител (серодиагностика). Если нагрузить эритроциты антителами (эритроцитарный антительный диагностикум), то можно применять для выявления антигенов.

Реакция гемагглютинации (РГА) представляет собой реакцию

АГ (эритроциты крови) + АТ (стандартная сыворотка) + электролит = гемагглютинат

Применяется для обнаружения групп крови АВО

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) ставится следующим образом: в лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят − 0,5 мл заведомо положительной сыворотки и в последнюю 0,5 мл физиологического раствора (контроли). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разведенного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч.

Рис. 3 Результат РНГА

В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном − оседают в виде пуговки или колечка.

РПГА применяют для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий и других высокодисперсных веществ, риккетсий и вирусов, комплексы которых с агглютининами в обычных РА увидеть не удается; для выявления в сыворотках больных антител к этим высокодисперсным веществам и микроорганизмам.

Рис. 4 Результат РНГА при диагностике штаммов гриппа

Учет результатов РНГА, поставленной с целью обнаружения ботулотоксина

Возбудитель ботулизма − Clostridium botulinum вырабатывает токсины семи сероваров (А, B, C, D, E, F, G), однако чаще других встречаются серовары А, В, Е. Все токсины отличаются по антигенным свойствам и могут быть дифференцированы в реакциях типоспецифическими сыворотками. Для этой цели можно поставить реакцию пассивной (непрямой) гемагглютинации с сывороткой больного, в которой предполагается наличие токсина, и эритроцитами, нагруженными антителами антитоксических противоботулинических сывороток типов А, В, Е. Контролем служит нормальная сыворотка.

Учет. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном − оседают в виде пуговки или колечка.

Правила забора крови для иммунологического исследования

Для серологического исследования у человека натощак берут кровь в количестве 5-6мл из локтевой вены при соблюдении правил асептики. Кровь ставят в термостат на 30-60 мин. Образовавшийся кровяной сгусток отделяют от стенки стерильной стеклянной палочкой и оставляют в холодильнике на 18-20 ч. Отстоявшуюся сыворотку осторожно сливают в стерильную пробирку, в случае примеси эритроцитов ее центрифугируют. Сыворотка может храниться в стерильных условиях в холодильнике до 1 месяца. Для более длительного хранения ее замораживают при температуре от -20° до

- 70°С.

Ход работы:

1.Изучить порядок постановки и учет реакций гемагглютинации.

2. Зарисовать схемы реакций прямой и непрямой гемагглютинации.

2.Изучить правила забора крови для серологических исследований.

3.Ответить на вопросы:

1) В чем заключается феномен агглютинации?

2) В чем особенности непрямой реакции агглютинации?

3) Какие компоненты применяются в реакции гемагглютинации?

4) Для каких целей используют реакцию прямой гемагглютинации?

5) В чем различия прямой и непрямой реакций гемагглютинации?

4.Провести определение групп крови (компьютерная программа).

Реакции связывания комплемента.
РИФ и ИФА.

Содержание:

Реакция связывания комплемента. Иммунофлюоресцентный метод. Иммуноферментный анализ.

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА

Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает.
Результат опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь). Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Рис. 1. Схема реакции связывания комплемента.

Рис. 2. Постановка и результат РСК.

Выводы: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.

РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса. Диагностическое значение имеет четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) и двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине.

Рис. 3. Серодиагностика с парными сыворотками.

Выводы: В парных сыворотках больного выявлено четырехкратное увеличение титра антител к вирусу гриппа А.

МЕТОД ФЛЮОРЕСЦИРУЮЩИХ АНТИТЕЛ (МФА) или
РЕАКЦИИ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (РИФ)

Иммунофлюоресцентный метод является методом выбора для быстрого выявления и идентификации неизвестного микроорганизма в исследуемом материале.
Аг + АТ + электролит = светящийся в УФ - лучах комплекс
Микроб сыворотка, меченная флюорохромом

Часто используют краситель изотиоционат флюоресциина - ФИТЦ
При исследовании этим методом используют люминесцентный микроскоп.

Ф

На мазок наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченных антител. Помещают стекло во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре в течение 20-25 мин, или в термостате при 37° С в течение 15 мин. Промывают стекло в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. На высушенный мазок наносят каплю монтирующей жидкости, мазок накрывают покровным стеклом и микроскопируют с использованием люминесцентного микроскопа или люминесцентной насадки к обычному оптическому микроскопу.

Рис. 4. Пневмококки, выявленные РИФ (люминесцентная микроскопия).

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА)

Иммуноферментный анализ или метод – выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой. После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат-хромоген. Субстрат расщепляется ферментом иизменяется цвет продукта реакции – интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале.

Рис. 5. Иммуноферментный анализ (ИФА) (схема).

Рис. 6. Результат ИФА. Желтый цвет раствора в лунке яляется положительным результатом.

Использование ИФА в диагностике инфекционных болезней.

ИФА эффективно применяется для лабораторной диагностики сравнительно большого круга инфекционных болезней. При этом, используя различные модификации метода, можно одновременно проводить обнаружение антигенов и антител, что значительно повышает результативность исследования.

В литературе накопились многочисленные данные, свидетельствующие о широком применении ИФА при выявлении антител и антигенов в отношении почти всех из известных групп вирусов и бактерий, вызывающих заболевания животных: инфекционный бурсит кур ( и другие,1993), инфекционный ринотрахеит крупого рогатого скота ( и др.,1991), вирусная диарея ( и др., 1991), болезнь Ауески ( и др.,1994), бешенство ( и др.,1991), болезнь Ньюкасла (Cилаева Н. и др., 1991), инфекционный ларинготрахеит (Atiduk C. et al.,1989) и многих других.

В настоящее время ИФА разработан при бруцеллезе, столбняке, сальмонеллезе, паратуберкулезе, лептоспирозе и практически при всех, имеющих эпизоотологическое и экономическое значение, вирусных болезнях сельскохозяйственных животных.

Достаточно много работ опубликовано по обнаружению специфических антител в сыворотке крови при микоплазменных инфекциях сельскохозяйственных животных.

Большинство авторов отмечают простоту постановки, экономичность и быстроту получения ответа при использовании ИФА, результаты которого коррелируют со многими общепринятыми серологическими методами (РНГА, РДП, РА, ВИЭОФ), но превосходят их по чувствительности, сохраняя при этом высокую специфичность.

Компоненты реакции, условия их приготовления и применения

^ Буферные растворы