Иммуноглобулин против лихорадки Эбола лошадиный очищенный, раствор для внутримышечного введения

________________________________________________________

Иммуноглобулин против лихорадки  ФС

Эбола лошадиный очищенный,

раствор для внутримышечного введения                Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин против лихорадки Эбола лошадиный очищенный, раствор для внутримышечного введения, применяемый для экстренной профилактики лихорадки Эбола у людей.

Основным действующим веществом препарата являются антитела (иммуноглобулины класса G лошади), нейтрализующие вирус лихорадки Эбола.

Иммуноглобулин против лихорадки Эбола лошадиный очищенный, раствор для внутримышечного введения выпускается в комплекте с иммуноглобулином против лихорадки Эбола лошадиным очищенным, разведенным 1:100.

Препараты иммуноглобулина против лихорадки Эбола лошадиные не содержат консервантов и антибиотиков.

ПРОИЗВОДСТВО

Для производства иммуноглобулина против лихорадки Эбола лошадиного очищенного используется сыворотка крови лошадей, иммунизированных вирусом Эбола, штамм Заир. Препарат иммуноглобулина против лихорадки Эбола представляет собой концентрированный раствор антител (иммунологически активной фракции иммуноглобулинов G (IgG) сыворотки крови лошадей), обладающих активностью антител к вирусу лихорадки Эбола.

Производство иммуноглобулина лошадиного против лихорадки Эбола должно осуществляться с соблюдением требований, указанных в ОФС «Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные».

Производственный штамм  Заир вируса Эбола должен иметь типичные культуральные, морфологические, биохимические и генетические свойства. Культура штамма не должна содержать бактериальной микрофлоры, посторонних вирусных агентов и микоплазм, должна обладать биологической активностью в постоянной культуре клеток GMK-АН-1 не ниже 10000 бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл).

При работе с производственным штаммами необходимо руководствоваться требованиями санитарных правил (СП) «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)», действующих в Российской Федерации.

ИСПЫТАНИЯ

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.

Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор с оптической плотностью не более 0,05. Определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм.

Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор с оптической плотностью не более 0,15. Определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм.

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».

Извлекаемый объем. Должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем».

рН. От 5,0 до 7,2. Испытуемый образец разводят до 1 % концентрации 0,9 % раствором натрия хлорида. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок. От 9 % до 11 %. Определение проводят колориметрическим методом c биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод А).

Электрофоретическая однородность. Не менее 90 % гамма-глобулинов, альфа - и бета-глобулинов – не более 10 %. Наличие альбумина не допускается. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы».

Молекулярные параметры. Содержание мономеров и димеров иммуноглобулина G должно быть не менее 90 %, полимеров и агрегатов – не более 10 %, фрагменты должны отсутствовать. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ».

Термостабильность. Препарат должен оставаться жидким и не образовывать геля после выдерживания в водяной бане или водяном термостате при температуре (56±1)°С в течение 4 ч.

Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность. Должен быть апирогенным. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность» (тест-доза должна составлять 1,0 мл препарата на кг массы кролика).

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой тела 18–20 г и двух морских свинках массой –300 г. Тест-доза для белых мышей составляет 0,5 мл (внутрибрюшинно), для морских свинок – 5,0 мл (подкожно в оба бока по 2,5 мл). Период наблюдения за животными составляет 7 сут.

Специфическая активность. Титр вируснейтрализующих антител к вирусу Эбола, штамм Заир, должен быть не ниже 1:4096. Испытания проводят в реакции нейтрализации (РН) методом подавления бляшкообразования вируса Мачупо в монослое постоянной культуры клеток GMK-AH-1. Для постановки РН используют культуры клеток на уровне 40–42 пассажа; посевная концентрация – от 200·103 до 250·103 клеток на 1 мл ростовой питательной среды Игла МЕМ с добавлением 7,5 % сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культур клеток во флаконах объемом 75 мл; монослой формируется в течение 3 сут.

В качестве вируссодержащего материала используют 10 % суспензию гомогената печени обезьян павианов гамадрилов, инфицированных вирусом Эбола, штамм Заир, с биологической активностью не менее 4,0 lg БОЕ/мл. Методика определения биологической активности вируссодержащего материала в монослое постоянной культуры клеток GMK-AH-1 должна быть изложена в нормативной документации.

Вируссодержащую 10 % суспензию гомогената печени обезьян, осветленную путем центрифугирования при 500–700 g (2000–3000 об/мин) в течение 10 мин при температуре от 2 до 6 оС, разводят раствором с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культур клеток (2 % по объему), пенициллина натриевой (калиевой) соли 200 ЕД/мл и стрептомицина сульфата 200 ЕД/мл до расчетной концентрации вируса Эбола, приблизительно равной 160 БОЕ/мл. Полученную суспензию разливают в пробирки по 10,0 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре от минус 55 до минус 65 оС не более одного года.

При постановке реакции нейтрализации проводят:

1) контроль биологической активности вируссодержащей суспензии, разведенной до расчетной концентрации вируса;

2) контроль возможной вируснейтрализующей активности агарового покрытия;

3) контроль возможной вируснейтрализующей активности сыворотки крови лошадей нормальной.

Подготовка испытуемых образцов иммуноглобулина

Испытуемый иммуноглобулин лошадиный Эбола очищенный разводят раствором Хенкса с добавлением пенициллина натриевой (калиевой) соли и стрептомицина сульфата по 200 ЕД/мл двукратным шагом.

В реакции используют образцы иммуноглобулина в разведении от 1:512 до 1:16384, которые объединяют в соотношении 1:1 с вируссодержащим материалом в рабочем разведении.

По 1,5 мл каждого разведения испытуемого иммуноглобулина и цельной нормальной лошадиной сыворотки (контроль) помещают в пробирки, добавляют в каждую из них по 1,5 мл вируссодержащей суспензии в рабочем разведении с расчетной концентрацией вируса Эбола, приблизительно равной 160 БОЕ/мл. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при температуре от 36,5 до 37,5 оС на 60 мин. По истечении времени инкубирования пробирки извлекают, переносят в емкость со льдом. Далее по 0,5 мл смеси из каждой пробирки равномерно наносят на всю поверхность флаконов объемом 75 мл с трехсуточным монослоем клеток GMK-AH-1, предварительно слив из флаконов с культурой клеток среду роста в емкость для утилизации. На каждое разведение испытуемого иммуноглобулина берут не менее 4 флаконов.

Для осуществления контроля биологической активности вируссодержащей суспензии, разведенной в расчетной концентрации вируса Эбола (приблизительно равной 160 БОЕ/мл) берут не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.

Для осуществления контроля возможной вируснейтрализующей активности агарового покрытия используют не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.

Для осуществления контроля возможной вируснейтрализующей активности сыворотки крови лошадей нормальной используют не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.

Флаконы инкубируют 60 мин при температуре от 36,5 до 37,5 оС, после чего из них пипеткой удаляют ранее внесенную смесь в емкость для утилизации. На монослой клеток наносят по 7,5 мл первичного агарового покрытия и оставляют флаконы при комнатной температуре на ровной горизонтальной поверхности. После застывания агарового покрытия флаконы переворачивают монослоем клеток вверх и помещают в термостат при  температуре от 36,5 до 37,5 оС на 7 сут. Через 7 суток во флаконы вносят по 3,5 мл вторичного агарового покрытия и его застывания продолжают инкубирование клеток при тех же условиях в течение 24–48 ч.

Методики приготовления первичного агарового покрытия (с учетом внесенного в него аминокислотного витаминного комплекса) и вторичного агарового покрытия должны быть приведены в нормативной документации производителя на иммуноглобулин против лихорадки Эбола.

Учет результатов

Учет реакции производят не более чем через 9 сут инкубирования по подавлению бляшкообразующей способности вируса Эбола в монослое культуры клеток GMK-AH-1.

Бляшки или «негативные» колонии – ограниченные участки клеток GMK-AH-1 под агаровым покрытием, разрушенных вирусом Эбола, видимые невооруженным глазом как светлые пятна округлой формы с четко очерченными краями (размером от 0,5 до 1,5 мм) на фоне окрашенных живых клеток.

За титр вируснейтрализующих антител принимают наибольшее разведение испытуемого иммуноглобулина, при котором происходит нейтрализация вируса Эбола на 50 % от его исходной биологической активности (количество бляшек во флаконах с испытуемым иммуноглобулином снижено на 50 % и более по сравнению с количеством бляшек во флаконах с контролем, смесью нормальной сыворотки лошадей с вируссодержащей суспензией).

При этом количество бляшек в рабочем разведении антигена (контроль дозы антигена) может колебаться от 30 до 50.

Титр специфических антител к вирусу Эбола должен быть не ниже 1:4096.

Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с препаратом

Иммуноглобулин против лихорадки Эбола лошадиный очищенный, разведенный 1:100

Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.

Прозрачность. Испытуемый раствор не должен отличаться по своей прозрачности от растворителя, используемого при его приготовлении. Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».

Цветность. Бесцветный раствор, не превышающий степень окраски эталона Y7 Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС « Степень окраски жидкостей».

рН. От 5,0 до 7,2. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок. От 0,09 до 0,11 %. Определение проводят  колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод Б).

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС «Стерильность».

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °С, в условиях, исключающих замораживание.