Иммуноглобулин против лихорадки Марбург лошадиный, раствор для внутримышечного введения

__________________________________________________________

Иммуноглобулин против         ФС

лихорадки Марбург        лошадиный,

раствор для внутримышечного введения                 Вводится впервые

__________________________________________________________________

Настоящая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин против лихорадки Марбург лошадиный, раствор для внутримышечного введения, применяемый для экстренной профилактики лихорадки Марбург у людей.

Основным действующим веществом препарата являются антитела (иммуноглобулины класса G лошади), нейтрализующие вирус лихорадки Марбург.

Иммуноглобулин против лихорадки Марбург лошадиный, раствор для внутримышечного введения выпускается в комплекте с иммуноглобулином против лихорадки Марбург лошадиным разведенным 1:100.

Препараты иммуноглобулина против лихорадки Марбург лошадиные не содержат консервантов и антибиотиков.

ПРОИЗВОДСТВО

Для производства иммуноглобулина против лихорадки Марбург лошадиного используется сыворотка крови лошадей, иммунизированных вирусом Марбург, штамм Рорр. Препарат иммуноглобулина против лихорадки Марбург представляет собой концентрированный раствор иммунологически активной фракции иммуноглобулинов G (IgG) сыворотки крови лошадей, обладающей активностью антител к вирусу лихорадки Марбург.

Производство иммуноглобулина лошадиного против лихорадки Марбург должно осуществляться с соблюдением требований, указанных в ОФС «Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные».

Производственный штамм Popp вируса Марбург должен иметь типичные культуральные, морфологические, биохимические и генетические свойства. Культура штамма не должна содержать бактериальной микрофлоры, посторонних вирусных агентов и микоплазм, должна обладать биологической активностью в перевиваемой культуре клеток GMK-AH-1(Д) не ниже 1⋅106 БОЕ/мл.

При работе с производственным штаммами необходимо руководствоваться требованиями санитарных правил (СП) «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)», действующих в Российской Федерации.

ИСПЫТАНИЯ

Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.

Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор с оптической плотностью не более 0,05 (определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометриявультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм).

Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор с оптической плотностью не более 0,15 (определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм).

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».

Извлекаемый объем. Должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем».

рН. От 5,0 до 7,2. Испытуемый образец разводят до 1 % концентрации 0,9 % раствором натрия хлорида. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок. От 9 % до 11 %. Определение проводят колориметрическим методом c биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод А).

Сульфаты. Менее 3 мкг/мл. Определяют в соответствии с ОФС «Сульфаты».

Электрофоретическая однородность. Не менее 90 % гамма - глобулинов, альфа - и бета-глобулинов – не более 10 %. Наличие альбумина не допускается. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы».

Молекулярные параметры. Содержание мономеров и димеров иммуноглобулина G должно быть не менее 90 %, полимеров и агрегатов – не более 10 %. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ».

Термостабильность. Препарат должен оставаться жидким и не образовывать геля после выдерживания в водяной бане или водяном термостате при температуре (56±1)° С в течение 4 ч.

Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».

Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность» (тест-доза должна составлять 1,0 мл препарата на кг массы кролика)

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой тела 18–20 г и двух морских свинках массой –300 г. Тест-доза для белых мышей составляет 0,5 мл (внутрибрюшинно), для морских свинок – 5,0 мл (подкожно в оба бока по 2,5 мл). Период наблюдения за животными составляет 7 сут.

Специфическая активность. Титр вируснейтрализующих антител к вирусу Марбург, штамм Рорр, должен быть не ниже 1:2048. Определение проводят в реакции нейтрализации (РН) методом подавления бляшкообразования вируса Марбург в монослое постоянной культуры клеток GMK-AH-1. Для постановки РН используют культуры клеток на уровне 40–42 пассажа; посевная концентрация – от 200·103 до 250·103 клеток на 1 мл ростовой питательной среды Игла МЕМ с добавлением 7,5 % сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культур клеток во флаконах объемом 75 мл; монослой формируется в течение 3 сут.

В качестве вируссодержащего материала используется 10 % суспензия гомогената печени обезъян павианов гамадрилов, инфицированных вирусом Марбург, штамм Popp с биологической активностью не менее 4,0 lg БОЕ/мл. Методика определения биологической активности вируссодержащего материала в монослое постоянной культуры клеток GMK-AH-1 должна быть изложена в нормативной документации.

Вируссодержащую 10 % суспензию гомогената печени обезьян с известной биологической активностью, осветленную путем центрифугирования при 500–700 g (2000–3000 об/мин) в течение 10 мин при температуре от 2 до 6 оС, разводят раствором Хенкса с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культур клеток (2 % по объему), пенициллина натриевой (калиевой) соли 200 ЕД/мл и стрептомицина сульфата 200 ЕД/мл до расчетной концентрации вируса Марбург, приблизительно равной 160 БОЕ/мл. Полученную суспензию разливают в пробирки по 10,0 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре от минус 55 до минус 65 оС не более одного года.

При постановке реакции нейтрализации проводят:

1) контроль биологической активности вируссодержащей суспензии, разведенной до расчетной концентрации вируса;

2) контроль возможной вируснейтрализующей активности агарового покрытия;

3) контроль возможной вируснейтрализующей активности сыворотки крови лошадей нормальной.

Подготовка испытуемых образцов иммуноглобулина.

Испытуемый иммуноглобулин против лихорадки Марбург разводят раствором Хенкса с добавлением пенициллина натриевой (калиевой) соли и стрептомицина сульфата по 200 ЕД/мл двукратным шагом.

В реакции используют образцы исследуемого препарата в разведении от 1:128 до 1:32768, которые объединяют в соотношении 1:1 с вируссодержащим материалом в рабочем разведении.

По 1,5 мл каждого разведения испытуемого иммуноглобулина и нормальной лошадиной сыворотки (контроль) помещают в пробирки, добавляют в каждую из них по 1,5 мл вируссодержащей суспензии в рабочем разведении с расчетной концентрацией вируса Ласса, приблизительно равной 160 БОЕ/мл. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при температуре от 36,5 до 37,5 оС на 60 минут.

По истечении времени инкубирования пробирки извлекают, переносят в емкость со льдом. Далее по 0,5 мл смеси из каждой пробирки равномерно наносят на всю поверхность флаконов объемом 75 мл с трехсуточным монослоем клеток GMK-AH-1, предварительно слив из флаконов с культурой клеток среду роста в емкость для утилизации. На каждое разведение испытуемого образца берут не менее 4 флаконов.

Для осуществления контроля биологической активности вируссодержащей суспензии, разведенной в расчетной концентрации вируса Марбург (приблизительно равной 160 БОЕ/мл) берут не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.

Для осуществления контроля возможной вируснейтрализующей активности агарового покрытия используют не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.

Для осуществления контроля возможной вируснейтрализующей активности сыворотки крови лошадей нормальной используют не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.

Флаконы инкубируют 60 мин при температуре от 36,5 до 37,5о С, после чего из них пипеткой удаляют ранее внесенную смесь в емкость для утилизации. На монослой клеток наносят по 7,5 мл первичного агарового покрытия и оставляют флаконы при комнатной температуре на ровной горизонтальной поверхности. После застывания агарового покрытия флаконы переворачивают монослоем клеток вверх и помещают в термостат при температуре от 36,5 до 37,5 оС на 7 сут. После инкубирования во флаконы вносят по 3,5 мл вторичного агарового покрытия и после его застывания продолжают инкубирование клеток при тех же условиях в течение 24–48 ч.

Методики приготовления первичного агарового покрытия (с учетом внесенного в него аминокислотного витаминного комплекса) и вторичного агарового покрытия должны быть приведены в нормативной документации производителя на иммуноглобулин против лихорадки Марбург.

Учет результатов

Учет реакции производят через 24–48 ч инкубирования после нанесения вторичного агарового покрытия по подавлению бляшкообразующей способности вируса Марбург в монослое культуры клеток GMK-AH-1.

«Бляшки» или негативные колонии ограниченные участки клеток GMK-AH-1 под агаровым покрытием, разрушенных вирусом Марбург, видимые невооруженным глазом как светлые пятна округлой формы с четко очерченными краями (размером от 0,1 до 0,2 мм) на фоне окрашенных живых клеток.

За титр вируснейтрализующих антител принимают наибольшее разведение испытуемого иммуноглобулина, при котором происходит нейтрализация вируса Марбург на 50 % от его исходной биологической активности (количество бляшек во флаконах с испытуемым иммуноглобулином снижено на 50 % и более по сравнению с количеством бляшек во флаконах с контролем, смесью нормальной сыворотки лошадей с вируссодержащей суспензией).

При этом количество бляшек в рабочем разведении антигена (контроль дозы антигена) может колебаться от 30 до 50.

Титр специфических антител к вирусу Марбург должен быть не ниже 1:2048.

Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с препаратом

Иммуноглобулин лошадиный против лихорадки Марбург разведенный 1:100.

Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определение проводят визуально.

Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.

Прозрачность Испытуемый раствор не должен отличаться по своей прозрачности от растворителя, используемого при его приготовлении. Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».

Цветность. Бесцветный раствор, не превышающий степень окраски эталона Y7 Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС « Степень окраски жидкостей».

рН. От 5,0 до 7,2. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Белок. От 0,09 до 0,11 %. Определение проводят колориметрическим методом c биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод Б).

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС «Стерильность».

Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».

Хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8° С, в условиях, исключающих замораживание.