________________________________________________________
Иммуноглобулин против ФС
Боливийской геморрагической
лихорадки лошадиный, раствор
для внутримышечного введения Вводится впервые
Настоящая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин против Боливийской геморрагической лихорадки (БГЛ) лошадиный, раствор для внутримышечного введения, применяемый для экстренной профилактики Боливийской геморрагической лихорадки у людей.
Основным действующим веществом препарата являются антитела (иммуноглобулины класса G лошади), нейтрализующие вирус Мачупо.
Иммуноглобулин против Боливийской геморрагической лихорадки лошадиный, раствор для внутримышечного введения выпускается в комплекте с иммуноглобулином лошадиным против Боливийской геморрагической лихорадки разведенным 1:100.
Препараты иммуноглобулина против Боливийской геморрагической лихорадки лошадиные не содержат консервантов и антибиотиков.
ПРОИЗВОДСТВО
Для производства иммуноглобулина против Боливийской геморрагической лихорадки лошадиного используется сыворотка крови лошадей, иммунизированных вирусом Мачупо, штамм Carvallo. Препарат иммуноглобулина против Боливийской геморрагической лихорадки представляет собой концентрированный раствор антител (иммунологически активной фракции иммуноглобулинов G (IgG) сыворотки крови лошадей), обладающих нейтрализующей активностью по отношению к вирусу Мачупо.
Производство иммуноглобулина лошадиного против Боливийской геморрагической лихорадки должно осуществляться с соблюдением требований, указанных в ОФС «Иммуноглобулины и сыворотки (антитела) гетерологичные».
Производственный штамм Carvallo вируса Мачупо должен иметь типичные культуральные, морфологические, биохимические и генетические свойства. Культура штамма не должна содержать бактериальной микрофлоры, посторонних вирусных агентов и микоплазм, должна обладать биологической активностью в постоянной культуре клеток Vero не ниже 1⋅106 бляшкообразующих единиц в 1 мл (БОЕ/мл).
При работе с производственным штаммами необходимо руководствоваться требованиями санитарных правил (СП) «Безопасность работы с микроорганизмами I–II групп патогенности (опасности)», действующих в Российской Федерации.
ИСПЫТАНИЯ
Описание. Прозрачная или слегка опалесцирующая, бесцветная или светло-желтого цвета жидкость. Определение проводят визуально.
Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.
Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцирующий раствор с оптической плотностью не более 0,05. Определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм.
Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор с оптической плотностью не более 0,15. Определение проводят в соответствии с ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях» в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм.
Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».
Извлекаемый объем. Должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС «Извлекаемый объем».
Сульфаты. Менее 3 мкг/мл. Определение проводят в соответствии с ОФС «Сульфаты».
рН. От 5,0 до 7,2. Испытуемый образец разводят до 1 % концентрации 0,9 % раствором натрия хлорида. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Белок. От 9 % до 11 %. Определение проводят колориметрическим методом c биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод А).
Электрофоретическая однородность Не менее 90 % гамма-глобулинов и не более 10 % альфа - и бета-глобулинов. Наличие альбуминов не допускается. Определение проводят в соответствии с ОФС «Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы».
Молекулярные параметры. Содержание мономеров и димеров иммуноглобулина G должно быть не менее 90 %, полимеров и агрегатов – не более 10 %. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Определение молекулярных параметров иммуноглобулинов методом ВЭЖХ».
Термостабильность. Препарат должен оставаться жидким и не образовывать геля после выдерживания в водяной бане или водяном термостате при температуре (56±1)°С в течение 4 ч.
Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность».
Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным. Испытание проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность» (тест-доза должна составлять 1,0 мл препарата на кг массы тела кролика).
Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность». Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой тела 18–20 г и двух морских свинках массой –300 г. Тест-доза для белых мышей составляет 0,5 мл (внутрибрюшинно), для морских свинок – 5,0 мл (подкожно в оба бока по 2,5 мл). Период наблюдения за животными составляет 7 сут.
Специфическая активность. Титр вируснейтрализующих антител к вирусу Мачупо, штамм Carvallo, должен быть не ниже 1:1024. Испытания проводят в реакции нейтрализации (РН) методом подавления бляшкообразования вируса Мачупо в монослое постоянной культуры клеток GMK-AH-1. Для постановки РН используют культуры клеток на уровне 40–42 пассажа; посевная концентрация – от 200·103 до 250·103 клеток на 1 мл ростовой питательной среды Игла МЕМ с добавлением 7,5 % сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культур клеток во флаконах объемом 75 мл; монослой формируется в течение 3 сут.
В качестве вируссодержащего материала используется 10 % суспензия гомогената печени морских свинок, инфицированных вирусом Мачупо, штамм Carvallo, с биологической активностью не менее 6,0 lg БОЕ/мл. Методика определения биологической активности вируссодержащего материала в монослое постоянной культуры клеток GMK-AH-1 должна быть изложена в нормативной документации.
Вируссодержащую 10 % суспензию гомогената печени морских свинок, осветленную путем центрифугирования при 500–700 g (2000–3000 об/мин) в течение 10 мин при температуре от 2 до 6 оС, разводят солевым раствором Хенкса с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота жидкой для культур клеток (2 % по объему), пенициллина натриевой (калиевой) соли 200 ЕД/мл и стрептомицина сульфата 200 ЕД/мл до расчетной концентрации вируса Мачупо, приблизительно равной 160 БОЕ/мл. Полученную суспензию разливают в пробирки по 10,0 мл и хранят в замороженном состоянии при температуре от минус 25 до минус 35 оС не более одного года.
При постановке реакции нейтрализации проводят:
1) контроль биологической активности вируссодержащей суспензии, разведенной до расчетной концентрации вируса;
2) контроль возможной вируснейтрализующей активности агарового покрытия;
3) контроль возможной вируснейтрализующей активности сыворотки крови лошадей нормальной.
Подготовка испытуемых образцов иммуноглобулина.
Испытуемый иммуноглобулин против БГЛ разводят раствором Хенкса с добавлением пенициллина натриевой (калиевой) соли и стрептомицина сульфата по 200 ЕД/мл двукратным шагом.
В реакции используют образцы иммуноглобулинов в разведении от 1:256 до 1:4096, которые объединяют в соотношении 1:1 с вируссодержащим материалом в рабочем разведении.
По 1,5 мл каждого разведения испытуемого иммуноглобулина и цельной нормальной лошадиной сыворотки (контроль) помещают в пробирки, добавляют в каждую по 1,5 мл вируссодержащей суспензии в рабочем разведении с расчетной концентрацией вируса Мачупо, приблизительно равной 160 БОЕ/мл. Пробирки энергично встряхивают и помещают в термостат при температуре от 36,5 до 37,5 оС на 60 мин. По истечении времени инкубирования пробирки извлекают, переносят в емкость со льдом. Далее по 0,5 мл смеси из каждой пробирки равномерно наносят на всю поверхность флаконов объемом 75 мл с трехсуточным монослоем клеток GMK-AH-1, предварительно слив из флаконов с культурой клеток среду роста в емкость для утилизации. На каждое разведение испытуемого иммуноглобулина берут не менее 4 флаконов.
Для осуществления контроля биологической активности вируссодержащей суспензии, разведенной в расчетной концентрации вируса Мачупо (приблизительно равной 160 БОЕ/мл) берут не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.
Для осуществления контроля возможной вируснейтрализующей активности агарового покрытия используют не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.
Для осуществления контроля возможной вируснейтрализующей активности сыворотки крови лошадей нормальной используют не менее 4 флаконов с монослоем культуры клеток.
Флаконы инкубируют 60 мин при температуре от 36,5 до 37,5 оС, после чего из них пипеткой удаляют ранее внесенную смесь в емкость для утилизации. На монослой клеток наносят по 7,5 мл первичного агарового покрытия и оставляют флаконы при комнатной температуре на ровной горизонтальной поверхности. После застывания агарового покрытия флаконы переворачивают монослоем клеток вверх и помещают в термостат при температуре от 36,5 до 37,5 оС на 5 сут. После инкубирования во флаконы вносят по 3,5 мл вторичного агарового покрытия и после его застывания продолжают инкубирование клеток при тех же условиях в течение 24–48 ч.
Методики приготовления первичного агарового покрытия (с учетом внесенного в него аминокислотного витаминного комплекса) и вторичного агарового покрытия должны быть приведены в нормативной документации производителя на иммуноглобулин против БГЛ.
Учет результатов
Учет реакции производят не более чем через 7 сут инкубирования по подавлению бляшкообразующей способности вируса Мачупо в монослое культуры клеток GMK-AH-1.
Бляшки или «негативные» колонии – ограниченные участки клеток GMK-AH-1 под агаровым покрытием, разрушенных вирусом Мачупо, видимые невооруженным глазом как светлые пятна округлой формы с четко очерченными краями (размером от 1,5 до 2,0 мм) на фоне окрашенных живых клеток.
За титр вируснейтрализующих антител принимают наибольшее разведение испытуемого иммуноглобулина, при котором происходит нейтрализация вируса Мачупо на 50 % от его исходной биологической активности (количество бляшек во флаконах с испытуемым иммуноглобулином снижено на 50 % и более по сравнению с количеством бляшек во флаконах с контролем, смесью нормальной сыворотки лошадей с вируссодержащей суспензией).
Титр специфических антител к вирусу Мачупо должен быть не ниже 1:1024.
Растворители и реагенты, выпускаемые в комплекте с препаратом
Иммуноглобулин лошадиный против Боливийской геморрагической лихорадки разведенный 1:100
Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определение проводят визуально.
Подлинность. Подтверждается наличием белков только сыворотки крови лошади. Испытание проводят методом иммуноэлектрофореза в геле с использованием сывороток против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи в соответствии с ОФС «Иммуноэлектрофорез в агаровом геле». Допустимо проведение испытания методом иммунодиффузии в геле в соответствии с ОФС «Иммунодиффузия в геле». В результате испытания должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови лошади.
Прозрачность. Испытуемый раствор не должен отличаться по своей прозрачности от растворителя, используемого при его приготовлении. Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей».
Цветность. Бесцветный раствор, не превышающий степень окраски эталона Y7 Определение проводят визуальным методом в соответствии с ОФС « Степень окраски жидкостей».
рН. От 5,0 до 7,2. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».
Белок. От 0,09 до 0,11 %. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС «Количественное определение белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека и животных» (метод Б).
Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС «Стерильность».
Упаковка и Маркировка. В соответствии с ОФС «Иммунобиологические лекарственные препараты».
Хранение. В защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °С, в условиях, исключающих замораживание.
