Преимущество микробиологического синтеза пиоцианина над химическим

Преимущество микробиологического синтеза пиоцианина над химическим

, , студенты гр.4Д10

Томский Политехнический Университет, 634050, г. Томск, пр. Ленина,30,
тел.[phone]

E-mail: *****@***ru

Антибиотики занимают особое место в современной медицине. Бактерии, традиционно являющиеся источником многих лекарственных субстанций, выделяют вещества с антибиотическими свойствами в процессе антагонизма - противостояния между микроорганизмами в окружающей среде. Кроме того, многие бактерии приобретают резистентность к большинству распространённых антибиотиков. Сегодня остро встает задача по созданию новых и эффективных препаратов. Одним из таких является пиоцианин – продукт жизнедеятельности бактерии Pseudomonas aeruginosa.

Изучение и выделение антибиотиков является одним из важнейших этапов  развития медицины.

В данной работе рассматриваются преимущества различных методов получения пигмента пиоцианина.

Пиоцианин относится к феназиновым соединениям, которые обладают огромным потенциалом как биологически активные вещества. Свойства данного соединения могут стать основой для нового препарата с сильными антибиотическими и противоопухолевыми свойствами.

Пигмент пиоцианин можно получить как химическим, так и биологическим методами.

Рассмотрим химический метод, состоящий из следующих стадий:

Стадия 1. Получение б-метоксифеназина (конденсация)

В колбе объемом 4 л смешивают раствор монометилового эфира пирогаллола в сухом бензоле с порошкообразной перекисью свинца. Реакционную массу встряхивают в течение 10-20 мин. Красновато-бурое твердое вещество отфильтровывают. К фильтрату немедленно прибавляют раствор о-фенилендиамина в уксусной кислоте и бензол. После ряда операций получают светло-желтое вещество с температурой плавления 167-169 оС.

Стадия 2. Получение б-оксифеназина (демитилирование)

В круглодонную колбу помещают раствор б-метоксифеназина в 55%-ной бромистоводородной кислоте. Раствор нагревают в течение 5 часов при 110-120 оС. Затем реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, смешивают с водой, почти полностью нейтрализуют едким натром и экстрагируют эфиром. После нескольких стадий экстракции, перекристаллизации и фильтрации получают твердое вещество оранжевого цвета с Тпл 153-155 оС.

Стадия 3. Получение пиоцианина (алкилирование)

В коническую колбу, снабженную хлоркальциевой трубкой, помешают раствор б-оксифеназина в диметилсульфате и нагревают в течение 10 мин. При 100 оС. Раствор охлаждают до комнатной температуры и прибавляют к нему абсолютный эфир. Выделившееся темно-бурое твердое вещество отфильтровывают. Сухой метосульфат растворяют в воде, подщелачивают и исчерпывающе экстрагируют порциями хлороформа. Затем раствор экстрагируют 5%-ной соляной кислотой. Кислотные вытяжки  и снова исчерпывающе экстрагируют хлороформом. Затем хлороформ отгоняют в вакууме, а полученный голубой кристаллический осадок перекристаллизовывают (выход 58% теоретич.). Препарат представляет собой темно-синие игольчатые кристаллы с Тпл 133 оС [1].

В методике используются дорогие  и токсичные вещества, которые могут остаться в конечном продукте в форме примесей, кроме того реакция проходит при высоких температурах в течение длительного времени, что является экономически невыгодным.

Рассмотрим микробиологический метод получения пиоцианина. Синегнойная палочка, продуцент пиоцианина, неприхотлива и хорошо развивается на средах общего назначения. Культивирование микроорганизма производилось при 30оС  в течение 168 часов [2].

В процессе выделения пиоцианина экстракция является одними из важнейших этапов. Пиоцианин является экзопродкутом, т. е. выделяется непосредственно в культуральную жидкость. Правильно подобранный растворитель и вспомогательные вещества, время и условия экстракции во многом определяют качество и количество конечного продукта.

Методика экстракции встречается в зарубежной литературе[3]. Данная методика была доработана, и сводится к следующим этапам:

Один объем растворителя приливают к одному объему биомассы, встряхивают. Если разделение проходит плохо, к водной фазе приливают слабощелочной раствор NaOH.  Растворитель отфильтровывают от крупных частиц питательной среды и компонентов биомассы, фильтрат упаривают. Концентрированный растворитель вносят в делительную воронку и приливают 0,1М раствор соляной кислоты, раствор меняет цвет на интенсивно-красный. Органическую фазу сливают. Раствор пиоцианина нейтрализуют 1N NaOH, за окончанием реакции нейтрализации следят по изменению окраски пиоцианина – вещество становится синим. Пиоцианин извлекают органическим растворителем, раствор концентрируют, полученное вещество сушат на воздухе.

В методиках по извлечению пиоцианина в качестве растворителя используют хлороформ. Он обладает всеми подходящими свойствами для экстрагента, а так же нередко используется в фармацевтическом производстве как для экстракции, так и для очистки биологически активных веществ. Однако хлористый метилен не уступает ему по свойствам, но имеет более низкую температуру кипения, низкую токсичность и представляет собой более подходящий вариант для использования в потенциальном производстве лекарственного препарата.

В результате данного исследования можно сделать вывод, что получение пиоцианина микробиологическим путем является более простым, безопасным и выгодным. В настоящее время проводятся работы по увеличению выхода продукта и изучению потенциальных свойств пиоцианина. Рассматривается его применение в качестве биосенсора или диагностикума.

Список литературы:

, Синтезы органических препаратов, Сборник 4. М. - Издательство иностранной литературы, 1953 , Выделение и исследование абиотической активности метаболита Pseudomonas aeruginosa пиоцианина // IX международная конференция студентов и молодых ученых «Перспективы развития фундаментальных наук», 2012 Kurashi. - Studies on the Biosynthesis of Pyocyanine. (II) Isolation and Determination of Pyocyanine, 19583