Исследование цитотоксичности пектинов, полученных биотехнологическим путем, на культуре клеток HEK 293
а, а, b
магистрант 2 курса ВятГУа
кандидат биологических наук, старший научный сотрудникb
Вятский Государственный Университет, Центр Превосходства «Фармацевтическая биотехнология», Киров, Российская Федерация
E-mail: *****@***ru
Ключевые слова: каллус, пектин, цитотоксичность
Хорошо известно, что физиологическая активность пектинов, в том числе противовоспалительное и иммуномодулирующее действие, зависит от их макромолекулярной структуры и химического состава. Состав и свойства пектинов, полученных из нативных растений, во многом определяются условиями произрастания. В настоящее время для решения данной проблемы используют пектины, полученные биотехнологическим путем. Однако физиологическая активность пектинов каллусных культур исследована недостаточно.
Цель исследования: оценить действие пектинов выделенных из ряда каллусных культур на метаболическую активность клеток млекопитающих.
В исследовании использованы пектин яблочный AU 701 (Herbstreith&Fox, Germany) и пектины, выделенные из каллусной культуры Heracleum sosnowskyi (HSc), Sorbus aucuparia (SAc), Cirsium arvense (CAc). Культивирование каллусов проводили на твердой питательной среде с добавлением фитогормонов. Для выделения фракции пектинов использовали экстракцию оксалатом аммония при 68°С.
В экспериментах была использована клеточная линия почек эмбриона человека (HEK 293). Клетки культивировали в среде DMEM, c добавлением следующих компонентов до конечной концентрации: 10% бычья эмбриональная сыворотка, 50 мг/мл гентамицина, 1% незаменимых аминокислот, 1% пирувата, 1% HEPES.
Для приготовления 1% раствора взвешивали 20 мг пектина и растворяли в
2 мл полной питательной среды. Далее последовательно разбавляли раствор до
концентрации 0,05%.
Для исследования цитотоксичности был использован МТТ-тест. Клетки рассеивали в 96-луночный планшет в плотности 8*103 и инкубировали 24 ч при 37°С, при содержании в атмосфере 5% СО2 в инкубаторе Galaxy 170S. Растворы пектинов вносили в лунки с адгезированными клетками и инкубировали 48 ч при стандартных условиях. За 2 часа до окончания инкубации в лунки вносили по 10 мкл МТТ в PBS. После окончания инкубации раствор отбирали, добавляли 100 мкл 4 мМ HCl в изопропаноле. С помощью планшетного спектрофотометра CLARIOstar определяли оптическую плотность при 530 нм и вычитали измеренное фоновое поглощение при 620 нм.
Результаты действия пектинов на метаболическую активность клеток представлены на рисунке 1.
Установлено, что при инкубации клеток HEK 293 в 0,1% растворах пектина снижение жизнеспособности клеток не происходит. При инкубации в 0,5% растворах AU 701, HSc и SAc жизнеспособность клеток снижается до 80%. Более значительное снижение метаболической активности наблюдалось при инкубации клеток с 0,5% раствором CAc. При увеличении концентрации пектинов в культуральной среде до 1% метаболическая активность клеток снизилось до 65, 57, 45, 26% для HSc, Sac, AU 701, CAc соответственно.
Таким образом, установлено, что большее цитотоксическое действие проявляет раствор пектина, полученного из каллусной культуры Cirsium arvense.
Различия в действии пектинов на метаболическую активность могут быть обусловлены несколькими причинами:
- изменение физико-химических характеристик культуральной среды (вязкость, осмотическое и кислотно-щелочное равновесие и др.); действие на мембранные структуры (ионные каналы, рецепторы, транспортеры).
Рисунок 1. Цитотоксическая активность растворов пектинов в отношении клеток HEK 293. Данные представлены в виде среднеарифметического значения ± стандартное отклонение (n=3). p <0.05 по сравнению с контролем.
