Семеноводство картофеля на основе биотехнологии. Методы размножения семян. Апробационные признаки.
Лекция 3. Семеноводство картофеля на основе биотехнологии. Методы размножения семян. Апробационные признаки.
В настоящее время первичное семеноводство картофеля переведено на безвирусную основу с использованием метода биотехнологии (использование меристемной ткани для оздоровления сортов).
Биотехнология оздоровления сортов картофеля является основной составной частью семеноводческого процесса, благодаря широкому внедрению системы централизованного производства исходного безвирусного материала.
В республике Казахстан получение исходного оздоровленного материала возложено на Казахский научно-исследовательский институт картофелеводства и овощеводства. Из КазНИИКО оздоровленный картофель в виде культуры in vitro (пробирочные растения), а также в виде меристемных клубней, микроклубней и миниклубней поступает по заявке в элитовыращивающие хозяйства для дальнейшего размножения с целью выращивания элиты.
Система семеноводства картофеля на основе пробирочных растений (с высадкой их в открытый грунт) имеет 4-летнюю схему: 1-год - питомник размножения; 2-год - питомник суперсуперэлиты; 3-год - питомник суперэлиты; 4-год - питомник элиты.
Система семеноводства картофеля на основе миниклубней (полученные от пробирочных растений в теплице) имеет укороченную 3-летнюю схему: 1-год - питомник суперсуперэлиты; 2-год - питомник суперэлиты; 3-год - питомник элиты.
При этой схеме семеноводства картофеля имеется возможность на товарных посадках культуры использовать семена, эквивалентные суперэлитному и элитному материалу.
Оздоровление сорта начинается с выбора исходного материала. Для отбора здоровых растений используются посадки картофеля, полученного от учреждения-оригинатора и посадки местных репродукций. Но лучше всего отбор здоровых растений производить на изолированном участке оздоровленного картофеля. Для оздоровления обычно отбирают 2-3 клубня из куста хорошо развитого, высокоурожайного и самого здорового. Для активного лечения клубни каждого сорта подвергаются термотерапии.
Оздоровление исходного материала картофеля в лаборатории. Термотерапию клубней проводят в термостабильной камере (термостат) в течение 2 часов, с температурой 37-390С и влажностью 75%, продолжительность - 50-60 дней. При термотерапии на клубнях образуются ростки длиной 2-3 см, которые отделяют от клубня и стерилизуют в 0,1%-растворе диацида, сулемы или 1-6%-растворе гипохлорида кальция в течение 6-8 минут и промывают несколько раз в стерильной воде. Работы по вычленению меристемы проводят в в ламинар-боксе предварительно обработанных ртутно-кварцевой (бактерицидной) лампой в течение 40 мин. При работе под микроскопом слабым нажатием иглы отщипывают молодые и зачаточные листочки, вычленяют меристему размером 0,1-0,2 мм и переносят в пробирку с питательной средой Мурасиге-Скуга с агаром или же на жидкую среду. После каждого вычленения меристемы столик микроскопа вытирают ватой, смоченной в спирте, инструменты (иглы и скальпель) стерилизуют в спирте с дальнейшей обработкой над пламенем горелки. Используют культуральные пробирки различной формы и размера. Перед этим пробирки тщательно моют, полоскают несколько (5-7) раз в дистиллированной воде и стерилизуют в сушильном шкафу. После пассажа меристемы на питательную среду пробирки закрывают марлево-ватными пробками. Растения, полученные из меристемы, выращивают на специальных стеллажах с люминисцентным основанием 7-9 тыс. люкс.
Световой и температурный режим регулируется автоматически. В светлый период (16 часов в сутки) поддерживается температура 23-250С, в темный период (8 часов в сутки) - 19-210С. Влажность воздуха - 70-80%. В зависимости от сорта картофеля растения с 5-6 листочками регенерируют из меристем 35-45 минут, но иногда от 2 до 8 мес.
При использовании методов культуры ткани для получения растений картофеля, свободных от вирусной инфекции, вирусологическая диагностика должны быть максимально достоверной и ранней. Для более точного определения зараженности растений в процессе оздоровления рекомендуется применять комплекс методов диагностики вирусов (серологический, индикаторный, электронно-микроскопический).
Таблица 1 - Состав питательной среды для культивирования апикальной меристемы картофеля (По модификации КазНИИКО)
Компоненты | Концентрация, мг/л |
Макросоли | |
NH4NO3 | 3300 |
KNO3 | 3800 |
CaCl2 . 2H2O | 880 |
MgSO4 . 7H2O | 740 |
KH2PO4 | 340 |
Микросоли | |
H3BO3 | 620 |
MnSO4 . 4H2O | 230 |
KnSO4 . 4H2O | 860 |
KУ | 83 |
CuSO4 . 5H2O | 2,5 |
Na2MoO4 . 2H2O | 25 |
CoCl2 . 6H2O | 2,5 |
Витамины | |
Мезоинозит | 100 |
Тиамин (В1) | 1,0 |
Аскорбиновая кислота (С) | 1,0 |
Пиридоксин (В6) | 1,0 |
Никотиновая кислота (РР) | 2,0 |
Стимуляторы роста | |
Гибберелловая кислота | 0,1 |
Кинетин | 2,0 |
ИУК | 0,1 |
Аденин | 20 |
Углеводы | |
Сахароза | 30000 |
и другие реактивы | |
Гидролизат казеина | 1000 |
Агар-агар | 6-7 гр. |
рН | 5,7 |
Подготовка питательной среды. Питательную среду готовят с использованием дистиллированной воды. Для макро - и микросолей и групп витаминов готовят объединенные маточные растворы. Для некоторых макросолей, выпадающих в осадок и для регуляторов роста готовят отдельные маточные растворы, которые хранят в холодильнике. Для приготовления 1 л рабочего раствора берут 50 мл маточного раствора макросолей, 1 мл маточного раствора микросолей, 5 мл маточного раствора Fe-хелат, добавляют сахарозу и доводят до 1 л дистиллированной водой, рН среды доводят до 5,7 с помощью 0,1 н КОН или 0,1 н HCl. Навеску агара на 1 л среды заливают 20 мл воды и подогревают в колбе под воронкой на кипящей водяной бане для полного растворения. Жидкий агар вливают в предварительно подогретый до 60-700С раствор макро - и микросолей, витаминов и других компонентов среды. Приготовленную среду тщательно перемывают, разливают по 10-15 мл в пробирки и закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробирки с питательной средой стерилизуют в автоклаве в течение 35-40 минут под давлением 0,9-1 атм.
Размножение клубней глазками, четвертинками и половинками. Для размножения клубней указанным способом за месяц до посадки клубни размножаемого сорт проращивают в теплом и светлом помещении при температуре 21-240С. Перед посадкой вырезают глазки с мякотью и высаживают на поверхность предварительно политой почвы. Клубни разрезают на части и высаживают на глубину 4-6 см. При каждой резке клубней нож обеззараживают в дезинфицирующем растворе. Для этого нож следует периодически опускать в 3-5%-раствор лизола, лизоформа или в 2%-раствор формалина, марганцевокислого калия (марганцовка). Для предотвращения загнивания посадочного материала разрезанные части клубней обрабатывают препаратом ТМТД из расчета 5-7 кг/т. Коэффициент размножения - до 1:35.
Укоренение верхушек и пазушных побегов. Метод укоренения пазушных побегов является наиболее доступным и простым, не требующим лабораторного оборудования и специальной подготовки специалистов. В теплицы предварительно высаживают маточные растения, выращенные в пробирках или клубни этих растений. Когда растения картофеля достигнут высоты 15-20 см, у них обрезают верхушки, что стимулирует рост пазушных побегов. Чтобы ускорить укоренение, верхушки в течение 6 часов выдерживают в растворе гетероауксина в концентрации 50 мг/л и высаживают в рассадные ящики с питательной смесью во влажную почву на глубину междоузлия 5-8 см. На 6-8-день верхушки укореняются и трогаются в рост. Через 15-20 дней после срезания верхушек с растений отделяют пазушные побеги, которые используются для посадки. В среднем от одного растения пазушного побега получают 7-9 клубней. За три съема от одного маточного растения получают до 110 пазушных побегов. Урожай растений из пазушных побегов зависит от возраста маточных растений, наиболее высоким он бывает при съеме черенков в период их активного роста (до бутонизации). Коэффициент размножения - до 1:800.
Получение микроклубней in vitro. Использование в качестве посадочного материала микроклубней значительно упрощает, удешевляет семеноводческий процесс. Преимущество метода: исключается перезаражение материала, т. е. они полностью свободны от патогенов; благодаря малому размеру и массе значительно меньше расходов при хранении и транспортировке. Микроклубни можно получить в любое время года. Сохранение коллекции сортов в виде микроклубней обеспечивает идеальную изоляцию. Важный фактор клубнеобразования in vitro - фотопериод. Температурный оптимум клубнеобразования может быть изменен в результате воздействия компонентов культуральной среды. При 250С скорость клубнеобразования повышается. Для клубнеобразования in vitro имеет значение определенная концентрация в среде углеводов и их соотношение с другими компонентами среды. Не менее важный фактор клубнеобразования - повышенная концентрация сахарозы в среде - 68%. Все известные в настоящее время гормоны растений (ауксины, гиббереллины, абсцизины, цитокинины) принимают участие в регуляции процесса клубнеобразования. На процесс клубнеобразования влияют также сортовые особенности растений.
Размножение картофеля ростковыми черенками. Для размножения картофеля ростковыми черенками клубни проращивают при температуре 18-200С. При достижении длины ростков 5-10 см их отделяют от клубней и разрезают на черенки по междоузлиям. Для ускорения клубнеобразования обрабатывают раствором гетероауксина в концентрации 50 мг/л. Для этого разрезанные черенки помещают в посуду с раствором гетероауксина и выдерживают в течение часа. Затем черенки высаживают в вегетационные домики на поверхность предварительно политого субстрата. В качестве субстрата может служить речной песок. Схема посадки - 5-8 см. После высадки черенки поливают и подкармливают раствором Кнопа. При достижении высоты ростковых черенков 10-15 см их высаживают в открытый грунт по схеме 90х10 см. Необходимым условием ухода являются частые поливы.
Микрочеренкование растений. Этот метод применяют при размножении первых здоровых растений, выращенных из верхушечных меристем. Размножать оздоровленные растения можно на агаризированной (твердой) среде в стерильных условиях или на жидкой среде с исключением органических соединений в нестерильных условиях. После отрастания растений из верхушечных меристем до образования 5-8 листочков их в стерильном боксе пинцетом извлекают из пробирки и на простерилизованной чашке Петри острым скальпелем разрезают на черенки, включающие часть стебля с одним листочком. На старой питательной среде можно оставить часть стебля с корневой системой для повторного отращивания. Черенки сажают в пробирки с питательной средой на глубину междоузлий. Инструменты и чашку Петри стерилизуют перед черенкованием каждого растения. Выращивают растения из черенков при 20-230С, относительной влажности 70-80%, освещении люминисцентными лампами с силой света 3-4 тысяч люкс и 16-часовом светопериоде. На 3-4-день после посадки у черенков начинается рост стебля и корней. Через 12-15 дней растения полностью отрастают и готовы для повторного черенкования. Для выращивания растений из черенков можно использовать среду Мурасиге-Скуга в модификации КазНИИКО (таблица).
Таблица - Состав питательной среды для выращивания растений из черенков
(в модификации КазНИИКО)
Компоненты | Для черенкования, мг/л | Для черенкования перед высадкой, мг/л |
Макросоли | ||
NH4NO3 | 1250 | 1250 |
KNO3 | 1900 | 1100 |
CaCl2 . 2H2O | 440 | 332 |
Ca(No3)2 | - | 332 |
MgSO4 . 7H2O | 370 | 370 |
KH2PO4 | 970 | 970 |
Na22ДГА | 37,8 | 37,8 |
FeSO4- 7H2O | 27,8 | 27,8 |
Микросоли | ||
H3BO3 | 6,2 | 6,2 |
MnSO4 . 4H2O | 22,3 | 22,3 |
Zn2SO4-7 H2O | 860 | 860 |
KJ | 0,83 | 0,83 |
CuSO4 . 5H2O | 0,025 | 0,025 |
Na2MoO4 . 2H2O | 0,25 | 0,25 |
CoCl2 . 6H2O | 0,025 | 0,025 |
Витамины | ||
Тиамин (В1) | 2,0 | 2,0 |
Пиридоксин (В6) | 1,0 | 1,0 |
Аскорбиновая кислота (С) | 2,0 | 2,0 |
Стимуляторы роста | ||
Кинетин | 0,04 | |
СА-8 | 1,0-10,0 | - |
ИУК | 1,0 | - |
Гибберелловая кислота | 0,1 | - |
Углеводы | ||
Сахароза | 20000 | 10000 |
и другие реактивы | ||
Гидролизат казеина | 40 | 40 |
Агар-агар | 7000 | 7000 |
рН | 5,7-5,8 | - |
Выращивание пробирочных растений в полевых условиях. После того, как растения, полученные из верхушечных меристем отрастут, и, у них образуются 6-7 листочков (междоузлий), их извлекают из пробирки пинцетом и переносят в чашки Петри. Острым скальпелем или же ножницами разрезают на черенки, включающие часть стебля с одним листочком. Затем их высаживают в вегетационные домики по схеме 5х2 см (5 см между рядами и 2 см между растениями). Эту работу проводят за 15-20 дней до посадки в поле с целью закаливания. Вегетационные домики покрыты светопрозрачным материалом, а нижняя часть заложена речным песком слоем 5-10 см на водонепроницаемом дне, обеспечивающий влажность сыпучего материала, в результате которого создается повышенная влажность воздуха за счет естественного испарения влаги, что предотвращает интоксикацию и гибель растений до посадки в поле. Дальнейший уход за растениями заключается в периодических поливах подогретой водой и 1-2-кратной подкормке раствором Кнопа в составе (г/л): Са(NO3)2 - 1; KNO3 - 0,25; FeCl или FeSO4 - 0,1; KCl - 0,72; KH2PO4 - 0,25; MgSO4 - 0,25. Подкормка раствором Кнопа проводится через неделю после высадки пробирочных растений в открытый грунт. При достижении высоты 10-15 см, растения осторожно вытаскивают из субстрата, не повреждая при этом корневую систему, для чего песок предварительно поливают обычной водой. Перед высадкой растений в открытый грунт овощным культиватором мелко нарезают борозды с междурядьем 45 см. Затем через ряд вносят перегной из расчета 30 тонн на 1 га. Эти борозды предварительно поливают. На предварительно политые борозды растения высаживают так, чтобы на поверхности оказалась верхушка растений с 2-3 листочками пробирочных растений.
Апробация посадок картофеля. Апробация проводится на всех сортовых посевах, предназначенных для семенных целей в своем хозяйстве или для обеспечения сортовыми семенами в порядке обмена или продажи другим хозяйствам. Подразделяют базисный семенной картофель (суперсуперэлита, суперэлита, элита) и репродукционный (I, II, III репродукции).
Апробация картофеля проводится в период цветения, когда четко проявляются все морфологические апробационные признаки. До начала апробации апробатор должен проверить сортовые документы на высаженный сортовой картофель (акт апробации посадок картофеля прошлого года, аттестат на элитный картофель, свидетельство на семенной картофель), ознакомиться с актами выделения семенного участка и проведения сортовой прочистки, установить площадь посева, подлежащего апробации и осмотреть его в натуре, изучить агротехнические мероприятия, применяемые на посевах апробируемого участка. Если сортовая прочистка не была проведена или проведена неудовлетворительно, апробатор должен организовать ее. На каждую прочистку составляется специальный акт с указанием даты прочистки, сорта, площади, количества удаленных сортовых примесей и больных растений. Общее состояние посадок считается хорошим, когда растения нормально развиты, смыкаются в рядах и выпад их не превышает 10%.
Апробацию проводят методом осмотра проб по диагонали поля. В пробу входит 20 растений, осматриваемых подряд на одном ряду. Количество всех осматриваемых в пробах растений (кустов) картофеля составляет апробационный образец. Количество проб и размер апробационного образца зависит от площади апробируемого участка. На участках площадью до 5 га берут 15 проб по 20 кустов, т. е. осматривают 300 кустов, на участке до 10 га 20 проб по 20 кустов (400 кустов), до 15 га - 25 проб по 20 кустов (500 кустов). На участке более 15 га берут дополнительно по 2 пробы на каждые 5га сверх 15 га.
При осмотре проб устанавливается принадлежность кустов к основному сорту, сортовая примесь с указанием окраски клубней (белая, красная). Отмечают кусты, пораженные вирусными болезнями, черной ножкой, кольцевой и бурой бактериальной гнилью. Результаты осмотра проб заносят в полевой журнал (регистрационный лист к акту апробации посевов картофеля).
