Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов.

Для многих целей, и прежде всего для структурных исследований белков, биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения изотопномеченых аминокислот и белков, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы соединений, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации (стереоселективности) конечных продуктов. Метод заключается в выращивании штаммов-продуцентов необходимых БАС на ростовых средах, содержащих различные субстраты, представляющие собой органические соединения и неорганические соли, содержащие стабильные изотопы 2Н, 13С, 15N и 18О.

Решающее значение для биотехнологического получения изотопномеченых аминокислот и белков имеет правильный выбор микроорганизмов, способных к устойчивому росту на средах, содержащих стабильные изотопы и к продукции нужных БАС. Наиболее доступными объектами для получения многих изотопномеченых белков признаны микроводоросли, большое разнообразие которых в природе позволяет выбирать среди них отдельные виды, способные к эндогенному накоплению белков. В то же время комплексное использование компонентов меченой биомассы микроводорослей позволяет выделять, например, [2H]аминокислоты, в том числе и гетеромеченые, из гидролизатов суммарных белков биомассы, выращенной на 2Н2O-среде. Другие традиционные штаммы микроорганизмов также могут эффективно применяться для получения изотопномеченых аминокислот и белков. При этом основными требованиями к микроорганизмам, используемым для получения изотопномеченых соединений являются устойчивый рост на средах, содержащих стабильные изотопы и высокий уровень продукции нужных БАС, который можно повысить за счёт применения генно-инженерных методов, а также мутагенеза и селекции. Это создаёт предпосылки для конструирования новых бактериальных штаммов-продуцентов с заданными свойствами и для дальнейшего изучения их характеристик. Биотехнологический подход экономически целесообразен и особенно незаменим, когда необходимы высокая стереоселективность и максимальные уровни изотопного обогащения синтезируемых соединений.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

При биотехнологическом получении изотопномеченых соединений используют несколько подходов, один из которых заключается в униформном обогащении стабильными изотопами клеточных БАС по всему углеродному скелету молекул. Это достигается за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих меченые субстраты высокого уровня изотопной чистоты и с последующим фракционированием компонентов биомассы на различные классы природных соединений. Так, аминокислоты с униформным характером включения изотопной метки 13С по скелету молекулы получают, в основном, при выращивании автотрофных микроорганизмов на ростовых средах, содержащих вместо обычных углеродных субстратов исключительно их низкомолекулярные аналоги, например 13СО2 . Таким способом были получены многие белки, синтезируемые микроводорослями: ферридоксин из Anabaena, цитохром C-553 , цитохром C2 из Rhodospirillum, и флаводоксин из Anabaena 7120 и использованы для дальнейших ЯМР исследований. Для структурных исследований белков методом спектроскопии ЯМР, для которого необходимо, чтобы как можно больше атомов в молекуле были замещены на их стабильные изотопы, биосинтетические подходы по получению униформно меченых аминокислот могут обеспечить сравнительно недорогое получение нужного количества меченых продуктов. аминокислоты получают аналогичным путём за счёт выращивания микроорганизмов на водных средах, содержащих К15NO3 или другие 15N-содержащие соли, в то время как высокообогащённые дейтерием аминокислоты можно получать с использованием ростовых сред, содержащих вместо обычной воды 99,9% 2H2O. Однако, при этом необходимо учитывать эффекты, связанные с клеточной адаптацией к 2Н2O. Известно, что 2Н2О действует токсически на клетки, ингибируя жизненно-важные функции роста и развития многих микроорганизмов.

Однако, несмотря на негативный биостатический эффект 2Н2O, разные таксономические роды бактерий могут быть достаточно легко адаптированы к росту и биосинтезу на средах содержащих максимальные концентрации тяжелой воды, в то время как клетки высших растений способны выдерживать не более 60% 2Н2О, а животные клетки не более 30% . С точки зрения физиологии и генетики адаптация клетки к 2Н2О является комплексным феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клетки. В связи с этим, разработка методов физиологической адаптации клетки к 2Н2О для получения высокообогащённых дейтерием БАС является весьма актуальной [76-78]. Следует также подчеркнуть, что исследования по адаптации биологических объектов к 2Н2О также должны учитывать химические изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высокими. При этом различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей химических реакций, протекающих в 2Н2О по отношению к таковым в обычной воде, измеренных как соотношение kH/k2H. Это соотношение меняется для различных связей, образованных с участием дейтерия и может варьировать в пределах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся изменения в констатнах скоростей химических реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.). Кроме того, следует помнить, что 2H2O является гидроскопическим соединением, активно поглощающем пары влаги из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, следовательно, этапы, связанные с выращиванием бактерий на 2H2O-средах необходимо проводить в герметических условиях с использованием безводных реагентов, предварительно перекристаллизованных в 2Н2O неорганических солей и т. п. аминокислоты можно получать за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды - H218O. Адаптация клеток к H218O в данном случае не является лимитирующим этапом. Однако, H218O используется в качестве источника изотопной метки в редких случаях, главным образом, вследствие высокой стоимости изотопных соединений кислорода.

Селективного включения стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков можно достичь за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах, меченых предшественников аминокислот, или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм.

Очень часто, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клетке приводят к специфическому мечению других биосинтетически родственных аминокислот за счёт использования клеткой многочисленных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В некоторых случаях этот фактор может существенно облегчить процесс получения селективно меченых белков и аминокислот. Таким способом был получен Т4-лизоцим, с селективным характером включения метки 15N лишь по остаткам глутамата, глутамина и аргинина. В работах [86, 87] сообщается о получении других индивидуальных белков, селективно меченных изотопом 15N по остаткам гистидина и лизина.

Разработка методов выращивания микроорганизмов имела для бактериологии огромное значение, оказавшись в каком-то смысле важнее микроскопа. Ведь микробы представляют собой всего лишь какие-то палочки, точки, запятые, и вообще их внешний вид мало что дает с точки зрения классификации. Вместе с тем на геле из агар-агара любой микроорганизм образует колонию довольно больших размеров и характерной формы. Это позволяет невооруженным глазом определять различные виды микробов и даже их количество в пробе.

Располагая столь эффективными методами исследования, Кох смог сформулировать основные принципы медицинской микробиологии, показав, как установить связь между определенным микроорганизмом и данным заболеванием:

1. Искать микроорганизмы в случаях любых болезней. 2. Их число и распределение должно объяснять клиническую картину заболевания. 3. Каждая инфекция непременно имеет своего возбудителя, которого необходимо подробно охарактеризовать морфологически.

Эта знаменитая триада Коха легла в основу развития бактериологии. Кох показал важность этих принципов, выделяя микроорганизмы у больных людей и животных, выращивая их в питательных средах, идентифицируя микробы и выясняя в опытах на лабораторных животных, какой из микроорганизмов является возбудителем той или иной болезни.

Методы выращивания бактерий и других одиночных микроорганизмов

Обычно популяции клеток культивируют в жидкой среде. Питательный бульон готовят, растворяя необходимые питательные вещества в воде, доводят рН среды до нужного значения, и стерилизуют среду в автоклаве паром высокого давления. В зависимости от объемов используемой среды применяют самые различные емкости - от пробирок с ватными пробками до колб, бутылей разного размера и громадных чанов на десятки тысяч литров (используемых в пивоварении и фармакологической промышленности). В питательную среду вносят небольшое число клеток и инкубируют при постоянной температуре. Если для организмов необходим кислород (а он необходим почти всегда), то культуру инкубируют на механической качалке или через нее пропускают стерильный воздух. Клетки выращивают также на поверхности агара изолированными колониями или, если они посеяны достаточно густо, единым слоем.

Среды для культивирования микроорганизмов. Натуральные (комплексные) среды, состоящие из природных соединений и имеющие неопределенный химический состав (части зеленых растений, животные ткани, солод, дрожжи, фрукты, овощи, навоз, почва и т. д.), содержат все компоненты, необходимые для роста и развития микроорганизмов большинства видов. Используются следующие среды:

мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входят хлорид натрия, фосфат калия, иногда глюкоза или сахароза; используется обычно в лабораторной практике;

картофельные среды с глюкозой и пептоном, часто используемые в лаборатории для культивирования многих видов актиномицетов и бактерий;

среды с кукурузным экстрактом, соевой мукой, бардой и другими веществами, в состав которых входят сульфат аммония, карбонат кальция, фосфаты, глюкоза, сахароза, лактоза или иные углеводы и ряд других соединений; среды успешно применяются в промышленности, т. к. являются дешевыми и обеспечивают хорошее развитие микроорганизмов с высоким выходом антибиотиков.

Поскольку натуральные среды не позволяют получать строгие количественные данные для изучения физиологических и биохимических особенностей организма, применяют синтетические среды, которые подбирают для отдельных продуцентов индивидуально. Синтетические среды могут быть как относительно простыми, так и сложными, для составления которых используют методы математического планирования эксперимента.

Источниками углерода могут быть органические кислоты, спирты, углеводы, сочетания различных углеродсодержащих соединений.

При промышленном получении ряда антибиотиков в качестве источников углерода нередко применяют картофельный крахмал, кукурузную муку или другие растительные материалы. Однако не все продуценты обладают достаточно активными амилазами, способными осуществлять гидролиз крахмалсодержащего сырья. Предварительное осахаривание крахмалсодержащих материалов с помощью ферментов значительно облегчает использование микроорганизмами этих материалов.

Источники азота оказывают большое влияние на образование микроорганизмами антибиотических веществ. Обычно в средах для культивирования микроорганизмов источником азота служат соли азотной (реже азотистой) кислоты, аммонийные соли органических и неорганических кислот, аминокислоты, белки и продукты их гидролиза. Многие микроорганизмы успешно используют и окисленные формы азота, некоторые из них нуждаются именно в нитратном источнике азота (Streptomyces auranticus, btropicus и некоторые другие). Ряд актиномицетов иногда усваивают лучше нитраты, чем аммонийные соли; они могут использовать даже нитриты, если их вносят в среду в небольших количествах (не более 50 мг NaNO2 / 1 л среды). При этом усвоение нитритов тесно связано с источником углерода; например в присутствии глицерина нитриты потребляются гораздо лучше, чем в присутствии глюкозы. Использование аммония и некоторых органических источников азота плесневыми грибами улучшается в присутствии небольших количеств (0,1–0,2 %) некоторых дикарбоновых (янтарной и фумаровой) кислот. В ряде случаев для накопления антибиотика необходимо присутствие и аммонийного, и нитратного источника азота (биосинтез пенициллина).

Обычно наиболее благоприятным для микроорганизмов является соотношение C : N = 20. Однако для образования антибиотика такое соотношение не всегда оптимально. Поэтому для каждого продуцента необходимо подбирать соответствующее соотношение углерода и азота.

Методы выращивания бактерий на полужидких средах

Полужидкая среда содержит гелеобразующее вещество в низкой концентрации и имеет мягкую желеподоб-ную консистенцию. Такая среда пригодна для культивирования микроаэрофильных бактерий, а также для изучения подвижности клеток и хемотаксиса.

Микроаэрофильным бактериям присуще аэробное дыхание, т. е. в качестве конечного акцептора электронов они используют кислород. Но они не растут в атмосфере с таким содержанием кислорода, как в воздухе (21%). Например, лучше всего растет в атмосфере, содержащей 6% кислорода. Некоторые азотфиксирующие бактерии могут расти в аэробных условиях при наличии соединений азота (например, сульфата аммония), но в безазотистых средах ведут себя как микроаэрофилы. Например, в условиях фиксации N2 лучше всего растет в атмосфере, содержащей 1 % кислорода. Это происходит из-за инактивации избытком кислорода нитрогеназного комплекса, катализирующего процесс азотфиксации.

При условии низкого содержания кислорода микроаэрофилы можно выращивать и в жидких, и на твердых средах, но в этом условии нет необходимости при ис­пользовании полужидкой среды с 0,1—0,4% агара. Геле-образующие вещества расслаивают среду таким образом, что конвекционные потоки не способны смешивать богатые кислородом верхние слои среды с нижними. Единственным путем для проникновения кислорода в более глубокие слои пробирки с полужидкой средой является диффузия. Таким образом, в пробирках с полу­жидкой средой создается градиент кислорода, где поверхность среды является местом наиболее высокого содержания кислорода. При инокуляции среды путем укола петлей микроаэрофилы начинают расти несколько ниже поверхности, где концентрация кислорода для них наиболее благоприятна. Рост начинается в форме тонких дисков, которые заметны на расстоянии нескольких миллиметров или сантиметров от поверхности. По мере роста диски становятся более плотными и перемещаются ближе к поверхности. В конце концов клетки образуют очень плотный диффузный слой непосредственно под поверхностью среды. Анаэробы, напротив, начинают расти в нижней части полужидкой среды, но впоследствии могут также расти по всей среде, если создаются анаэробные условия.

Микроаэрофил из легко культивировать в пробирках с полужидкой средой для бруцелл (бульон для бруцелл, содержащий 0,15—0,3% агара. Азотфиксирующие клетки хорошо растут в полужидкой среде с малатом, дефицитной по азоту. В литровых бутылях РУ, содержащих слой полужидкой среды, можно получать большие биомассы этой бактерии для физиологических исследований.

Если пробирки с полужидкой средой хранятся долгое время, кислород может диффундировать в глубь среды. Градиент кислорода удается восстановить после того, как такие пробирки помещают на несколько минут в кипящую водяную баню, а затем дают возможность пробиркам остыть, а среде затвердеть.

Полужидкие среды можно также использовать для определения подвижности бактерий. Для этого пробирку со средой для определения подвижности (бульон, содержащий 0,4% агара) инокулируют уколом прямой иглой до середины агарового слоя. В процессе роста подвижные бактерии мигрируют от линии инокуляции, образуя диффузную мутную зону в окружающей среде, тогда как неподвижные бактерии растут только по уколу (линии инокуляции).

Этот метод можно модифицировать следующим образом. В полужидкую среду помещают открытую с обоих концов и предварительно простерилизоваиную стеклянную трубочку, в которую вносят инокулят. Подвижные микроорганизмы мигрируют вниз, выходят из нижнего конца трубочки и затем начинают двигаться вверх к поверхности среды, где усиленно растут. Этот метод пригоден также для селекции высокоподвижных организмов, используемых для приготовления Н-антиге-нов при иммунизации.

Полужидкую среду используют, кроме того, при изучении хемотаксиса. Например, Адлер использовал полужидкую среду, содержащую окисляемое соединение углерода как источник энергии, для исследования положительного хемотаксиса. При внесении большого инокулята в центр чашек Петри со средой клетки Е. соН мигрируют к периферии в форме расходящегося круга и по мере продвижения используют весь окисляемый субстрат. При добавлении к среде двух окисляемых соединений углерода образуются два кольца из клеток, мигрирующих с различными скоростями. В отличие от методов изучения хемотаксиса в капиллярных трубках в данном случае запас кислорода в чашках с агаризо-ванной средой никогда не истощается; поэтому мигрирующие кольца клеток по­являются только в ответ на сформированный этими клетками градиент субстрата, а не на самопроизвольный градиент кислорода.

С помощью полужидкой отрицательный хемотаксис суспендируют в среде в концентрации, достаточной для того, чтобы появилось заметное помутнение. Затем инокулированную среду разливают в чашки Петри. После того как среда приоб­ретает гелеобразную консистенцию, в нее вносят кусочек твердого 2%-пого агара, содержащего предполагаемое репеллентное вещество. Если вещество действительно является репеллентом, то окружающие его бактерии мигрируют в стороны от кусочка агара и оставляют за собой прозрачный след, который становится видимым примерно через 30 мин.

Использование полужидкой среды позволяет также осуществлять селекцию мутантов, не способных к хемотаксису. В случае положительного хемотаксиса эти мутанты (а также неподвижные мутанты) не реагируют на сформированный клетками градиент субстрата и остаются в центре чашки Петри, откуда их можно из­влечь для субкультивирования и очистки. В случае отрицательного хемотаксиса мутанты, не способные к хемотаксису, можно выделить из прозрачной зоны, окру­жающей кусочек твердого агара.