Выделение и характеристика кДНК гена поли (АДФ-рибоза) Полимеразы 2 ARABIDOPSIS THALIANA (стр. 5 )

Как видно из рисунка 7Б в присутствии активированной ДНК АtPARP2 может катализировать реакцию авто-поли-АДФ-рибозилирования путем многократного переноса ADP-рибозных групп из НАД+ на себя, на что указывает дополнительные бэнды с высокомолекулярными белками в Вестерн блоттинге с моноклональными анти-PAR антителами. В присутствие ингибитора PARP 3-AB в дозе 5 мкМ, АДФ-рибозилирование аtPARP2 значительно блокируется.

Необходимо отметить, хроматографически очищенный АtPARP2 частично АДФ-рибозилирован и в отсутствии, и в присутствии активирующей ДНК и 3-AB, так как распознается анти-PAR антителами. Можно предположить, что очищенные АtPARP2 авто-АДФ-рибозилированы до хроматографической очистки, т. е. во время экспрессии в E. cоli.

Заключение

В результате проведенных работ нами был выделен АtPARP2 кДНК ген методом ОТ-ПЦР и и успешно экспрессирован в E. coli под контролем T7 промотора. Анализ ДСН-ПААГ показал, что АtPARP2 представляет собой основной белок, продуцируемый в E. coli с молекулярной массой 72,2 кДа, что соответствует массе белка предсказанной на основе аминокислотной последовательности. MALDI-TOF масс-спектрометрия предполагаемого рекомбинантного белка и его анализ с использованием NCBI BLAST показали, что фермент содержит предполагаемые консервативные домены присущие PARP2 A. thaliana. Для обнаружения белка AtPARP2 в растениях на основе очищенного рекомбинантного AtPARP2 были получены поликлональные антитела к AtPARP2.

Определение автомодифицирующей активности рекомбинантный AtPARP2 с применением полученных нами поликлональных анти-АtPARP2 и комерчески доступных моноклональных анти-PAR антител показало что AtPARP2 в присутствии активирующей ДНК может катализировать реакцию авто-поли-АДФ-рибозилирования.  Ингибитор PARP фермента 3-АВ  значительно ингибировал количество высокомолекулярных поли АДФ-рибозилированных белковых продуктов. Высказано предположение, о том что, АtPARP2 авто-АДФ-рибозилируется во время экспрессии в E. cоli.

Литература

Cadet J., Douki T., Gasparutto D., Ravanat J. L. Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features // Mutat. Res. – 2003. – Vol. 531. – P. 5-23. Foyer C. H., Noctor G. Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria // Physiol. Plant. - 2003. -  Vol. 119. - P.355–364. Weitzman M. D., Weitzman J. B. What's the damage? The impact of pathogens on pathways that maintain host genome integrity //Cell Host Microbe. -2014. - Vol.15. - №3. - P.283-294. Papamichos-Chronakis M., Peterson C. L. Chromatin and the genome integrity network // Nat Rev Genet. - 2013. - Vol. 14. - № 1. - P.62–75. Ermolaeva M. A., Schumacher B. Systemic DNA damage responses: organismal adaptations to genome instability // Trends Genet. - 2014. - Vol. 30. - № 3. - P.95–102. Schreiber V., Dantzer F., Ame J. C., de Murcia G. Poly (ADP-ribose): novel functions for an old molecule // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. - 2006. - Vol 7. - P.517–528. Kim M. Y., Zhang T., Kraus W. L. Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1: ’PAR-laying’ NAD+ into a nuclear signal // Genes Dev. - 2005. - Vol. 19. - P.1951–1967. Ameґ J-C., Spenlehauer C., de Murcia G. The PARP superfamily // BioEssays. - 2004. - Vol. 26. - P.882–893 Woodhouse B. C., Dianov G. L. Poly ADP-ribose polymerase-1:  an international molecule of mystery // DNA Repair. - 2008. - Vol. 7. - P.1077–1086. Kraus W. L., Hottiger M. O. PARP-1 and gene regulation: progress and puzzles // Mol. Aspects Med. - 2013. - Vol. 34. - P.1109–1123. Caldecott K. W. Mammalian single-strand break repair: mechanisms and links with chromatin // DNA Repair. - 2007. - Vol. 6. - P.443–453. Shieh W. M., Ame J. C., Wilson M. V., Wang Z. Q., Koh D. W., JacobsonM. K., Jacobson E. L. Poly(ADP-ribose) polymerase null mouse cells synthesize ADP-ribose polymers // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273. - P.30069–30072. de Murcia G., Menissier de Murcia J. Poly(ADP-ribose)polymerase: a molecular nick-sensor // Trends Biochem. Sci. - 1994. - Vol. 19. - P.172–176. Tanaka Y., Yoshihara K., Itaya A., Kamiya T., Koide S. S. Mechanism of the inhibition of Ca2+, Mg2+-dependentendonuclease of bull seminal plasma induced by ADP-ribosylation // J. Biol. Chem. - 1984. - Vol. 259. - P.6579–6585. Satoh M. S., Poirier G. G. and Lindahl T. Dual function forpoly(ADP-ribose) synthesis in response to DNA strand breakage // Biochemistry. - 1994. - Vol. 33. - P.7099–7106. Caldecott K. W. Protein ADP-ribosylation and the cellularresponse to DNA strand breaks // DNA Repair. - 2014. - Vol. 19. - P.108–113. Briggs A. G., Bent A. F. Poly(ADP-ribosyl)ation in plants // Trends Plant Sci. - 2011. - Vol. 16. - № 7. - P.372–80. Lamb R. S., Citarelli M., Teotia S. Functions of the poly(ADP-ribose) polymerase superfamily in plants // Cell Mol Life Sci. - 2012. - Vol. 69. - № 2. - P.175–89. Briggs A. G., Bent A. F.  Poly(ADP-ribosyl)ation in plants // Trends in Plant Science. - 2011. - Vol. 16. - № 7. - P.360-1385. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227. - № 000. – P. 680-685. Bradford M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding // Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72. – P. 248-302. Vainonen J. P., Shapiguzov A., Vaattovaara A., Kangasjдrvi J.  Plant PARPs, PARGs and PARP-like Proteins // Current Protein and Peptide Science. – 2016. – Vol. 17. - P.713-723 Hinz J. M., Rodriguez Y., Smerdon M. J. Rotational dynamics of DNA on the nucleosome surface markedly impact accessibility to a DNA repair enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. - 2010. - Vol. 107. - P.4646–4651. Odell I. D., Barbour J. E., Murphy D. L., Della-Maria J. A., Sweasy J. B., Tomkinson A. E., Wallace S. S.,  Pederson D. S. Nucleosome disruption by DNA ligase III-XRCC1 promotes efficient base excision repair // Mol. Cell. Biol. - 2011. - Vol. 31. - P.4623–4632. Zhang F., Wang Y., Wang L., Luo X., Huang K., Wang C., Du M., Liu F., Luo T., Huang D., Huang K. Poly(ADP-ribose) Polymerase 1 Is a Key Regulator of Estrogen Receptor б-dependent Gene Transcription // J. Biol. Chem. – 2013. -  Vol. 288. - № 16. – P. 11348–11357.

References

Ameґ J-C., Spenlehauer C., de Murcia G. (2004) The PARP superfamily. BioEssays, vol. 26, pp. 882–893. Briggs A. G, Bent A. F. (2011) Poly(ADP-ribosyl)ation in plants. Trends Plant Sci., vol. 16 (7), pp.372–80. Briggs A. G., Bent A. F. (2011) Poly(ADP-ribosyl)ation in plants. Trends in Plant Science., vol. 16 (7), pp.360-1385. Bradford M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., vol. 72, pp. 248-54. Cadet J., Douki T., Gasparutto D., Ravanat J. L. (2003) Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features. Mutat. Res., vol. 531, pp. 5-23. Caldecott K. W. (2007) Mammalian single-strand break repair: mechanisms and links with chromatin. DNA Repair., vol. 6, pp.443–453. Caldecott K. W. (2014) Protein ADP-ribosylation and the cellularresponse to DNA strand breaks. DNA Repair, vol. 19, pp.108–113. de Murcia G., Menissier de Murcia J. (1994) Poly(ADP-ribose)polymerase: a molecular nick-sensor. Trends Biochem. Sci., vol. 19, pp.172–176. Ermolaeva M. A., Schumacher B. (2014) Systemic DNA damage responses: organismal adaptations to genome instability. Trends Genet., vol. 30 (3), pp.95–102. Foyer C. H., Noctor G. (2003) Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts, peroxisomes and mitochondria. Physiol. Plant, vol. 119, pp. 355–364. Hinz J. M., Rodriguez Y., Smerdon M. J. (2010) Rotational dynamics of DNA on the nucleosome surface markedly impact accessibility to a DNA repair enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A., vol. 107, pp.4646–4651. Kim M. Y., Zhang T., Kraus W. L. (2005) Poly(ADP-ribosyl)ation by PARP-1: ’PAR-laying’ NAD+ into a nuclear signal. Genes Dev., vol. 19, pp.1951–1967. Kraus W. L., Hottiger M. O. (2013) PARP-1 and gene regulation: progress and puzzles. Mol. Aspects Med., vol. 34, pp.1109–1123. Laemmli U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, vol. 227 (5259), pp. 680-685. Lamb R. S., Citarelli M., Teotia S. (2012) Functions of the poly(ADP-ribose) polymerase superfamily in plants. Cell Mol Life Sci., vol. 69 (2). - P.175–89. Odell I. D., Barbour J. E., Murphy D. L., Della-Maria J. A., Sweasy J. B., Tomkinson A. E., Wallace S. S.,  Pederson D. S. (2011) Nucleosome disruption by DNA ligase III-XRCC1 promotes efficient base excision repair. Mol. Cell. Biol., vol. 31, pp.4623–4632. Papamichos-Chronakis M., Peterson C. L. (2013) Chromatin and the genome integrity network. Nat Rev Genet., vol. 14 (1), pp.62–75. Schreiber V., Dantzer F., Ame J. C.,  de Murcia, G. (2006) Poly(ADP-ribose): novel functions for an old molecule // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., vol 7, pp.517–528. Shieh W. M., Ame J. C., Wilson M. V., Wang Z. Q., Koh D. W., JacobsonM. K., Jacobson E. L. (1998) Poly(ADP-ribose) polymerase null mouse cells synthesize ADP-ribose polymers. J. Biol. Chem., vol. 273, pp.30069–30072. Satoh, M.S., Poirier, G.G. and Lindahl, T. (1994) Dual function forpoly(ADP-ribose) synthesis in response to DNA strand breakage. Biochemistry, vol. 33, pp.7099–7106. Tanaka Y., Yoshihara K., Itaya A., Kamiya T., Koide S. S. (1984) Mechanism of the inhibition of Ca2+, Mg2+-dependentendonuclease of bull seminal plasma induced by ADP-ribosylation. J. Biol. Chem., vol. 259, pp.6579–6585. Vainonen J. P., Shapiguzov A., Vaattovaara A., Kangasjдrvi J.  (2016) Plant PARPs, PARGs and PARP-like Proteins. Current Protein and Peptide Science., vol. 17, pp.713-723 Weitzman M. D, Weitzman J. B. (2014) What's the damage? The impact of pathogens on pathways that maintain host genome integrity. Cell Host Microbe, vol.15 (3), pp. 283-294. Woodhouse B. C., Dianov G. L. (2008) Poly ADP-ribose polymerase-1:  an international molecule of mystery. DNA Repair., vol. 7, pp.1077–1086. Zhang F., Wang Y., Wang L., Luo X., Huang K., Wang C., Du M., Liu F., Luo T., Huang D., Huang K. (2013) Poly(ADP-ribose) Polymerase 1 Is a Key Regulator of Estrogen Receptor б-dependent Gene Transcription. J. Biol. Chem., vol. 288 (16), pp. 11348–11357.