Без имени (стр. 6 )

ДНК полимераза не может начать синтез, а только удлиняет уже имеющийся полинуклеотидный фрагмент. Для начала синтеза необходима особая РНК-полимераза – праймаза, синтезирующая праймеры (затравки). ДНК-полимеразные реакции протекают на протяжении всей матрицы: образуется комплементарная молекула ДНК. РНК-полимеразы действуют только на определенных участках нити ДНК – от промоторов до терминаторов (промоторы указывают на начало транскрипции, терминаторы - на ее окончание).

Образующаяся молекула ДНК является готовым продуктом, а продукт действия РНК-полимераз – только первичный транскрипт (высокомолекулярный предшественник зрелой РНК). После его синтеза происходит целая серия реакций посттранкрипционной модификации РНК. Осуществляется тремя группами ферментов:

Специфические эндонуклеазы. Их действие приводит к фрагментации первичноготранскрипта. Ферменты, способные образовывать 3’,5’-фосфодиэфирные связи – лигазы, которые сшивают фрагменты.

Действие специфических эндонуклеаз и лигаз обозначается термином «сплайсинг».

Затем вступает в действие фермент, присоединяющий к каждой молекуле и-РНК «кэп»-фрагмент – 3-метил ГТФ, а также фермент полиаденилатполимераза, присоединяющий АТФ к 3'-концу молекулы (полиаденилирование).

Ферменты, которые осуществляют преобразование азотистых оснований в составе РНК (метилированиеаденина, гуанина, восстановление урацила до дигидроурацила, дезаминирование азотистых оснований. Модифицированные таким образом продукты известны как минорные азотистые основания. Они служат как для защиты РНК от действия нуклеаз, так и для формирования высших структур РНК. В  наибольшем количестве минорные азотистые основания находятся в составе транспортной-РНК (т-РНК). Минорные азотистые основания не образуют комплементарных пар, поэтому наблюдается образование петель.

В организме человека встречаются следующие полимеразы:

ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ:

- альфа-ДНК-полимеразы отвечают за синтез основной цепи;

- бета-ДНК-полимеразы восстанавливают поврежденные участки ДНК;

- гамма-ДНК полимеразы - митохондриальные ферменты, содержатся в митохондиях и осуществляют репликацию митохондриальной ДНК.

РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ:

I - участвуют в синтезе транспортной РНК (т-РНК). При синтезе транспортной РНК (т-РНК) к концу каждой молекулы присоединяется последовательность из трех мононуклеотидов: ЦМФ-ЦМФ-АМФ (ЦЦА). Эта последовательность необходима для присоединения аминокислоты к т-РНК.

II - участвуют в синтезе информационной (матричной) РНК(и-РНК, м-РНК);

III - участвуют в синтезе остальных видов РНК.

Ингибитором РНК-полимеразы-II является пептид L-амонитин. Встречается в ядовитых грибах Amonyta(бледная поганка).

Синтез ДНК называется репликацией. Направление фосфодиэфирных связей одной из синтезируемых полинуклеотидных цепей ДНК совпадает с направлением синтеза (5'--->3'), поэтому она синтезируется непрерывно и сразу целиком. А у другой - не совпадает (3'--->5'). Поэтому она синтезируется частями. Эти части  называются "фрагменты Оказаки". Синтезировать фрагменты Оказакиdenovo (с нуля) ДНК-полимеразы не могут, поэтому для синтеза каждого фрагмента нужна "затравка" - праймер. Праймер - это кусочек цепи РНК. Синтез праймеров катализируют специальные ферменты - праймазы (это один из вариантов РНК-полимераз). Синтез РНК происходит на определенных участках молекулы ДНК и называется транскрипцией. В цепи ДНК существуют специальные участки. При транскрипции образуется высокомолекулярный предшественник РНК - первичный транскрипт. Затем здесь же, в ядре клетки, идет постсинтетическая модификация РНК - сплайсинг. Этот процесс катализируют ферменты эндонуклеазы - из первичноготранскрипта вырезаются интроны. Оставшиесяэкзоны сшиваются РНК-лигазами. Далее к 5'-концу молекулы РНК присоединяется 7-метил-ГТФ (КЭП-фрагмент) - этот процесс называется "кэпирование". К 3'-концу присоединяется полиадениловый "хвост" (полиАМФ) - реакцию катализирует.

Особенностью посттранскрипционной модификации рибосомальной РНК (р-РНК) является метилирование азотистых оснований.

Модуль 2. Методы генетической инженерии в биотехнологии и информационные методы 

ЛЕКЦИЯ № 6. Методы генетической инженерии в биотехнологии

С помощью современных генетических методов биологи научились превращать бактерии в своеобразные «биологические фабрики» по производству белковых препаратов (например, рестрицирующих эндонуклеаз), различных химических соединений, аминокислот, антибиотиков и т. д. Клонируя в бактериальных клетках специфические гены, они создают новые пути биосинтеза для получения уникальных метаболитов, применяют клонированные гены болезнетворных микроорганизмов в качестве зондов для диагностики заболеваний человека и домашних животных, используют изолированные гены для получения безопасных и эффективных вакцин.

Методами генной инженерии можно усиливать природную способность определенных видов бактерий к осуществлению специфических биологических процессов. Например, уже получены штаммы бактерий, которые более эффективно разрушают токсичные отходы, загрязняющие окружающую среду, способствуют ускорению роста сельскохозяйственных культур, эффективно расщепляют целлюлозу до низкомолекулярных углеродных соединений, уничтожают вредных насекомых. Часто думают, что выращивание больших количеств микроорганизмов представляет собой рутинную процедуру. Однако для успешного производства рекомбинантных белков в промышленных масштабах необходимо контролировать множество параметров, от которых зависит рост синтезирующих их микроорганизмов и чистота получаемых продуктов.

Молекулярная диагностика

Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов (табл.1). Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydiatrachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.

Таблица 1. Сравнение некоторых методов диагностики инфекционных заболеваний, вызванных паразитическими микроорганизмами

Метод	Преимущества	Недостатки
Mикроскопическое исследование.	Простота. Прямое выявление паразитических микроорганизмов. Возможность разграничения микроорганизмов по морфологическим признакам.	Трудоемкость, длительность. Низкая чувствительность. Невозможность азграничения сходных микроорганизмов. Необходимость высокой квалификации для интерпретации результатов.
Культивирование invitrou иммунизация мышей.	Обнаружение только жизнеспособных паразитических микроорганизмов. Возможность определения вирулентности и инфекционности.	Длительность анализа, высокая стоимость. Разные породы животных дают разные ответы. Потеря жизнеспособности в организме животного. Использование животных.
Определение антител в сыворотке.	Простота, непродолжительность анализа. Возможность автоматизации. Возможность тестирования большого числа образцов.	Не всегда специфичен. Невозможность разграничения острой и латентной форм инфекции.
Гибридизация и ПЦР.	Быстрота, высокие чувствительность и Специфичность. Прямое обнаружение паразитических микроорганизмов. Возможность разграничения разных видов. Независимость результатов от предыдущих инфекций. Не требуют жизнеспособности паразитов. Возможность автоматизации.	Высокая стоимость анализов, многоэтапность. Невозможность различить живые и мертвые микроорганизмы. Возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм - или молекулу-мишень, чувствительный — обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.

ЛЕКЦИЯ № 7. Иммунологические методы в биотехнологии

Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения. Если молекулой-мишенью является белок. То необходимо обеспечить экспрессию детермипирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирование или блокирование сайта связывания с антителом. Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантирование обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антиген-антитело.