НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРОВЕДЕНИЯ КЭ
«Исследование возможности формативной трехмерной биофабрикации тканевых конструкций, осуществляемой методом программируемой самосборки живых тканей и органов в условиях микрогравитации посредством магнитного поля»
Шифр «МАГНИТНЫЙ 3D-БИОПРИНТЕР»
1. Сущность исследуемой проблемы
Долговременное пребывание в условиях невесомости, а также космическая радиация негативно влияют на организм человека особенно при космических полетах за пределами защитной магнитосферы Земли. Методы тканевой инженерии уже на протяжении нескольких десятилетий используются для изучения влияния невесомости и космической радиации на человеческие ткани. Биофабрикацию довольно просто организованных человеческих тканей (например, гиалиновый хрящ) возможно осуществлять в космосе в специальных биореакторах. Разработанный коллективом ученых и инженеров компании 3Д Биопринтинг Солюшенс магнитный биопринтер позволит печатать более сложные по строению человеческие ткани и органы, в том числе чувствительные к радиации органы-сентинелы, такие как, щитовидная железа, в условиях невесомости в космосе.
2. Краткая история и состояние вопроса в настоящее время
Тканевая инженерия уже несколько десятилетий успешно используется в медико-биологических исследованиях влияния факторов космического полета на человеческие ткани. Одним из первых экспериментов по тканевой инженерии в космосе была работа американских ученых из Массачусетского Института Технологии, выполненных под руководством профессора Роберта Лангера на российской космической станции МИР [1].
В данной работе тканеинженерный хрящ был изначально получен из трехмерного биодеградируемого полимерного скаффолда и бычьих клеток хряща в ротационном биореакторе Synthecon, после чего он созревал 3 месяца на Земле и затем был отправлен на 4 месяца в космос в том же биореакторе. Было показано, что как в космосе, так и на Земле образовалась трехмерная тканевая конструкция хряща, содержащая экстраклеточный матрикс, представленный типичными для натурального хряща протеогликанами и коллагеном второго типа. При этом по сравнению с контрольным хрящом, находящемся на Земле, хрящ выращенный в условиях невесомости на космической станции был круглее, меньше по размерам и механически слабее. В данной работе по сути изучалось переживание в условиях невесомости тканевой конструкции хряща, уже созданной на Земле и не изучались эффекты космической радиации.
В настоящее время безусловным мировым лидером в проведении тканеинженерных экспериментов в космосе является группа немецкой ученой Даниелы Гримм, работающей в Дании [2]. Ее группа систематически проводит космические эксперименты на ракетах, запускаемых Европейским Космическим Агентством, на Международной Космической Станции и на космических аппаратах Китайской Народной Республики. В частности, используя монослой опухолевых клеток щитовидной железы, Д. Гримм обнаружила уникальный морфогенетический феномен, заключающийся в способности раковых клетки щитовидной железы образовывать тканевые сфероиды в условиях невесомости [3].
Стоит отметить, что тканевые сфероиды в качестве строительных блоков занимают важное место в современной концепции биопечати, в том числе разрабатываемых нами подходов, что определяется их фундаментальным биологическим свойством слияния и последующей самосборки в органные конструкты [4]. Полученные экспериментальные данные о том, что в невесомости из монослоя клеток образуются тканевые сфероиды может быть объяснена тем, что невесомость создает более благоприятные условия не только для формирования сфероидов из клеток, но и слияния тканевых сфероидов между собою, которое опосредуется усиленной адгезией контактирующих клеток соседних сфероидов. Таким образом, можно предположить, что созревание напечатанных тканевых и органных конструкций из плотно прилегающих тканевых сфероидов в условиях невесомости в космосе будет происходить намного быстрее и эффективнее.
В отличие от используемой в условиях земной гравитации аддитивной или послойной биопечати, в космосе необходимо обеспечить направленную подачу и желаемое пространственное распределение тканевых сфероидов. Одним из возможных подходов является использование магнитного поля и тканевых сфероидов, сформированных из клеток, меченных магнитными наночастицами, или «магнитная биопечать». Ранее несколькими научными группами была продемонстрирована возможность получения тканевых сфероидов из клеток меченых магнитными наночастицами оксида железа с последующим паттернированием их в желаемую геометрическую форму с помощью постоянных магнитов, расположенных у дна чашек Петри, что легло в основу разработки принципов использования нанотехнологий для биофабрикации и биопечати сложных тканей и органов [5-6]. В апреле 2017 г. американская компания BioServe Space Technologies совместно с NASA запустила 6-месячный космический эксперимент на МКС по изучению возможностей культивирования клеточных 3D агрегатов в условиях невесомости. В данном эксперименте использована технология техасской компании Nano3D Biosciences, Inc., позволяющая получать тканевые сфероиды при помощи ферромагнитных наночастиц и постоянных магнитов [7].
Несмотря на ряд преимуществ для эффективной манипуляции магнитными тканевыми сфероидами требуется довольно высокая концентрация магнитных наночастиц в каждой клетке, которая способна вызывать цитотоксический эффект [8]. Кроме того, в случае подсаживания сформированных таким способом тканевых конструктов в организм, наночастички из окиси железа со временем накапливаются в печени и селезенке человека и способны вызывать развитие заболеваний по типу гемосидероза [9].
В нашем эксперименте мы используем принципиально новый подход к магнитной трехмерной биопечати, не требующий использования внутриклеточных магнитных меток и частиц. Для повышения магнитной восприимчивости предварительно сформированных тканевых сфероидов мы используем химические соединения (соли гадолиния Gd3+) в культуральной среде, что позволяет в значительной степени усилить диамагнитные свойства, присущие живым биологическим объектам. Будучи помещенными в неоднородное магнитное поле тканевые сфероиды в парамагнитной среде перемещаются и вступают в плотные контакты в области наименьшей напряженности поля («магнитной яме»), задание геометрических параметров которой в конечном итоге определяет форму и размеры образующегося тканевого конструкта. Данный способ, впервые предложенный американской группой исследователей под руководством У. Демирчи для единичных клеток [10] и адаптированный нами для тканевых сфероидов, позволяет осуществлять эффективную трехмерную биофабрикацию с формативным фактором в виде магнитного поля.
3. Обоснование необходимости проведения КЭ в условиях космического пространства
Проведение КЭ в условиях микрогравитации на МКС, согласно предварительным расчетам, позволит существенно снизить используемые на Земле умеренно токсичные концентрации парамагнетика гадолиния в составе культуральной среды, что повысит жизнеспособность органных конструктов. Кроме того, в ходе проведения КЭ будет изучаться влияние различных факторов космического полета (микрогравитации, радиации и др.) на тканевой метаболизм сформированных конструктов.
4. Описание КЭ (порядок проведения, принципиальные требования к условиям проведения КЭ, определяющие качество получаемой научной информации, технические особенности НА и т. п.).
В ходе КЭ должны быть проведены следующие сеансы:
- сеанс, связанный с размещением и приведением в рабочее состояние на РС МКС комплекта НА и биологического материала, в том числе установка 3D-МБП на прочную ровную платформу и помещение кювет с заключенными в гидрогель жизнеспособными сфероидами в термостатируемую камеру с температурой +37°С; проводится в первые сутки после доставки оборудования.
- 12 сеансов магнитной биофабрикации, проводятся на 2 и 3-й дни (по 6 сеансов в каждый из дней) после доставки и размещения комплекта НА. Сеансы включают подготовку кювет с заключенными в термообратимом гидрогеле сфероидами из хондроцитов и их охлаждение до +4-8°С непосредственно перед началом эксперимента для перевода содержимого из твердой фазы в жидкую. Затем каждую из 6 кювет последовательно помещают в рабочую область 3D-МБП для обеспечения сборки растворенных сфероидов в магнитном поле. В ходе выполнения КЭ будет проводиться фото/видео регистрация процесса биофабрикации посредством встроенной в принтер цифровой камеры. После проведения каждого сеанса магнитной биофабрикации кюветы совместно с принтером помещают на 24 часа в термостатируемый инкубатор с температурой +37°С для слияния сфероидов в составе сформированного. Таким образом, в ходе КЭ будет получено 6 конструктов хрящевой ткани и 6 конструктов щитовидной железы в 12 отдельных кюветах для биофабрикации с различными концентрациями соли гадолиния (10 и 50 мМ) в 2 биологических повторах для каждой концентрации.
- на завершающем этапе (3-и сутки) КЭ проводят гистологическую фиксацию полученных конструктов. Фиксацию сформированных тканевых конструктов проводят посредством 4% р-ра ПФА, содержащегося в отдельном резервуаре кюветы для биофабрикации. Дальнейшее хранение биологических образцов осуществляется при температуре +21-25°С.
- сеанс по подготовке к возвращению на Землю полученных путем биофабрикации зафиксированных тканевых и органных конструктов, а также носителей информации (SD-карта) с фото/видео камеры проводится за 1-2 суток до посадки. Возвращенный груз является срочным, поэтому его получение требуется на месте посадки. Строгие требования к температурному режиму во время возвращения и наземной транспортировки груза не предъявляются, однако он должен находиться в диапазоне от +18 до +37°С.
Замораживание возвращаемых биологических образцов недопустимо. Максимальное время от посадки до передачи результатов постановщику КЭ не должно превышать двух суток.
КЭ рассчитан на проведение в течение одной непродолжительной экспедиции (желательно, не более 3 месяцев).
5. Новизна, оценка качественного уровня по сравнению с аналогичными отечественными и зарубежными исследованиями
Основным фактором новизны предлагаемого исследования будут являться впервые в мире проведенные сеансы магнитной биопечати тканевыми сфероидами на МКС. Подобные эксперименты ранее не проводились в космосе. Все предшествовавшие работы зарубежных и отечественных исследователей ограничивались либо получением самих сфероидов в космосе, либо кондиционированием предварительно созданных на Земле органных конструктов. Кроме того, отдельным достижением будет являться совершенствование новой технологии трехмерной биопечати без использования экструдеров, скаффолдов и магнитных меток (nozzle-scaffold-label free bioprinting).
8. Ожидаемые результаты и их предполагаемое использование
Результаты исследований позволят создать принципиально новую технологию трехмерной магнитной биопечати или технологию формативной биофабрикации, в которой вместо традиционных твердых биодеградируемых скаффолдов в качестве полевого скаффолда будут использоваться магниты и создаваемое ими магнитное поле. Разработанный магнитный биопринтер позволит на новом технологическом уровне изучать физиологию тканеинженерных конструктов, а также печатать сложные по строению человеческие ткани и органы, в том числе чувствительные к радиации органы-сентинелы, в условиях невесомости в космосе. Результаты КЭ могут быть использованы в целях поддержания жизнедеятельности участников длительных космических экспериментов, в том числе при реализации программы пилотируемого полета на Марс.
Список цитируемой литературы
Freed LE, Langer R, Martin I, Pellis NR, Vunjak-Novakovic G. Tissue engineering of cartilage in space. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Dec 9;94 (25):13885-90. Grimm D, Wehland M, Pietsch J, Aleshcheva G, Wise P, van Loon J, Ulbrich C, Magnusson NE, Infanger M, Bauer J. Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 2014 Dec;20(6):555-66. doi: 10.1089/ten. TEB.2013.0704. Kopp S, Warnke E, Wehland M, Aleshcheva G, Magnusson NE, Hemmersbach R, Corydon TJ, Bauer J, Infanger M, Grimm D. Mechanisms of three-dimensional growth of thyroid cells during long-term simulated microgravity. Sci Rep. 2015 Nov 18;5:16691. Mironov V, Visconti RP, Kasyanov V, Forgacs G, Drake CJ, Markwald RR. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 2009 Apr;30(12):2164-74. Frasca G, Du V, Bacri JC, Gazeau F, Gay C, Wilhelm C. Magnetically shaped cell aggregates: from granular to contractile materials. Soft Matter. 2014;10(28):5045-54. Rezende R. A., Azevedo F. S., Pereira F. D., Kasyanov V., Wen X., Silva J. V.L., Mironov V. Nanotechnological Strategies for Biofabrication of Human Organs. Journal of Nanotechnology Volume 2012, Article ID 149264. Сайт NASA [Электронный ресурс]. www. nasa. gov/mission_pages/station/research/experiments/1929.html Mazuel F, Espinosa A, Luciani N, Reffay M, Le Borgne R, Motte L, Desboeufs K, Michel A, Pellegrino T, Lalatonne Y, Wilhelm C. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 2016 Aug 23;10(8):7627-38. D. Singh, J. M.M. McMillan, A. V. Kabanov, M. Sokolsky-Papkov, H. E. Gendelman, “Bench-to-bedside translation of magnetic nanoparticles”, Nanomedicine, vol. 9, no. 4, pp. 501–516, 2014. S. Tasoglu, C. H. Yu, V. Liaudanskaya, S. Guven, C. Migliaresi, U. Demirci, “Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication,” Adv. Healthc. Mater., vol. 4, no. 10, pp. 1469–1476, 2015.