L-Аспарагиновая кислота ФС
Аспарагиновая кислота
Acidum asparticum Вводится впервые
(2S)-2-Аминобутандиовая кислота
C4H7NO4 | М. м. 133,10 |
Cодержит не менее 98,5 % и не более 101,5 % L-аспарагиновой кислоты C4H7NO4 в пересчете на сухое вещество.
Описание. Белый или почти белый кристаллический порошок или бесцветные кристаллы.
Растворимость. Растворим или легко растворим в 10 % растворе хлористоводородной кислоты и 10 % растворе гидроксида натрия, мало растворим в воде, практически нерастворим в спирте 96 %.
Подлинность. 1. ИК-спектрометрия. Инфракрасный спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом, в области от 4000 до 400 см-1 по положению полос поглощения должен соответствовать спектру стандартного образца L-аспарагиновой кислоты.
2. Тонкослойная хроматография. Определение проводят во время испытания «Родственные примеси, 2. Вещества, окрашивающиеся нингидрином».
Основная зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора Б по совокупности величины и интенсивности поглощения должна соответствовать зоне адсорбции на хроматограмме раствора стандартного образца.
Удельное вращение. От +24,5 до +26,0 в пересчете на сухое вещество (8 % раствор субстанции в 6 М растворе хлористоводородной кислоты, ОФС «Поляриметрия»).
Прозрачность раствора. Раствор 0,5 г субстанции в 10 мл 1 М растворе хлористоводородной кислоты должен быть прозрачным (ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей»).
Цветность раствора. Раствор, полученный в испытании «Прозрачность раствора», должен выдерживать сравнение с эталоном BY6 (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2).
pH. От 2,5 до 3,5 (0,5 г субстанции растворяют в 100 мл кипящей воды и охлаждают, ОФС «Ионометрия», метод 3).
Родственные примеси.
1. Фумаровая кислота. Определение проводят методом ВЭЖХ.
Подвижная фаза (ПФ). 0,2 М раствор дигидрофосфата калия доводят до pH 3,0 концентрированной фосфорной кислотой.
Испытуемый раствор. Около 25,0 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в ПФ и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.
Раствор сравнения. Около 20,0 мг фумаровой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в ПФ и доводят объём раствора тем же растворителем до метки. 1,0 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.
Раствор для проверки хроматографической системы. Испытуемый раствор–раствор сравнения 1:1.
Хроматографические условия
Колонка | 25 Ч 0,46 см, силикагель октадецилсилильный для хроматографии (С18), 5 мкм; |
Температура колонки | 40 °С; |
Скорость потока | 1,0 мл/мин; |
Детектор | спектрофотометрический, 215 нм; |
Объём пробы | 20 мкл; |
Хроматографируют испытуемый раствор, раствор сравнения и раствор для проверки хроматографической системы.
Относительные времена удерживания. Аспарагиновая кислота – 1 (около 5 мин); фумаровая кислота – около 2,0.
Пригодность хроматографической системы: на хроматограмме раствора для проверки хроматографической системы:
– разрешение (R) между пиками аспарагиновой и фумаровой кислот должно быть не менее 3,0;
– фактор асимметрии пика (AS) фумаровой кислоты должен быть не более 2,5;
– эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная по пику фумаровой кислоты, должна составлять не менее 4000 теоретических тарелок;
– относительное стандартное отклонение площади пика фумаровой кислоты должно быть не более 1,0 % (6 определений).
Допустимое содержание примесей. На хроматограмме испытуемого раствора площадь пика фумаровой кислоты не должна превышать площадь основного пика на хроматограмме раствора сравнения (не более 0,4 %).
2. Вещества, окрашивающиеся нингидрином. Определение проводят методом ТСХ.
Пластинка. ТСХ пластинка со слоем силикагеля.
Подвижная фаза (ПФ). Ледяная уксусная кислота–вода–бутанол 20:20:60.
онцентрированный раствор аммиака–вода 1:9.
онцентрированный раствор аммиака–вода 1:30.
Испытуемый раствор А. 50,0 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в растворителе А и доводят объём тем же растворителем до метки.
Испытуемый раствор Б. 10,0 мг субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в растворителе Б и доводят объём тем же растворителем до метки.
Раствор сравнения. 1,0 мл испытуемого раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 20 мл и доводят объём водой до метки. 1,0 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят объём водой до метки.
Раствор стандартного образца. 10,0 мг стандартного образца аспарагиновой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл растворителя Б и доводят объём водой до метки.
Раствор для проверки хроматографической системы. 10,0 мг стандартного образца аспарагиновой кислоты и 10,0 мг стандартного образца глутаминовой кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл растворителя Б и доводят объём водой до метки.
На линию старта пластинки наносят 10 мкл испытуемого раствора А (50 мкг), 5 мкл испытуемого раствора Б (1 мкг), 5 мкл и 10 мкл раствора сравнения (0,125 мкг и 0,25 мкг), 5 мкл раствора стандартного образца (1 мкг) и 5 мкл раствора для проверки хроматографической системы.
Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе в течение 5 мин, помещают в камеру с ПФ и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт ПФ пройдет около 80–90 % длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей, выдерживают при температуре 100–105 °С в течение 5 мин. Пластинку опрыскивают 0,2 % раствором нингидрина, сушат на воздухе в течение 10 мин и при 100–105 °С в течение 15 мин и просматривают при видимом свете.
Хроматографическая система считается пригодной, если:
– на хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы чётко видны две зоны адсорбции;
– на хроматограмме 5 мкл раствора сравнения чётко видна зона адсорбции.
Зона адсорбции любой примеси на хроматограмме испытуемого раствора А по совокупности величины и интенсивности поглощения не должна превышать зону адсорбции на хроматограмме 10 мкл раствора сравнения (не более 0,5 %). Суммарное содержание примесей не должно превышать 2,0 %.
Потеря в массе при высушивании. Не более 0,5 % (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Для определения используют около 1,0 г (точная навеска) субстанции.
Аммоний. Не более 0,02 % (ОФС «Аммоний»). 1,5 г субстанции взбалтывают с 15 мл воды свободной от аммиака в течение 5 мин и фильтруют. Для определения используют 10 мл фильтрата.
Железо. Не более 0,001 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Железо», в зольном остатке, метод 2, полученном после сжигания 1,0 г (точная навеска) субстанции.
Сульфаты. Не более 0,03 % (ОФС «Сульфаты», метод 1) 0,5 г субстанции растворяют в 4 мл 2 М раствора хлористоводородной кислоты, разбавляют водой до объёма 15 мл и фильтруют. Для определения используют 10 мл фильтрата.
Хлориды. Не более 0,02 % (ОФС «Хлориды»). 0,25 г субстанции растворяют в 3 мл 12,5 % раствора азотной кислоты, доводят объём раствора водой до 25 мл и фильтруют. Для определения используют 10 мл фильтрата.
Сульфатная зола. Не более 0,1 % (ОФС «Сульфатная зола»). Для определения используют около 1,0 г (точная навеска) субстанции.
Тяжёлые металлы. Не более 0,001 %. Определение проводят в соответствии с ОФС «Тяжёлые металлы», метод 2, в зольном остатке, полученном после сжигания 1,0 г субстанции, с использованием эталонного раствора 1.
Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».
*Аномальная токсичность. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС «Аномальная токсичность»). Тест-доза – 7,5 мг субстанции в 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида на мышь, внутривенно в течение 30 с. Срок наблюдения 48 ч.
*Бактериальные эндотоксины. Не более 0,067 ЕЭ на 1 мг субстанции (ОФС «Бактериальные эндотоксины»).
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
Количественное определение. Определение проводят методом титриметрии.
Около 0,1 г (точная навеска) субстанции растворяют при нагревании в 50 мл воды и титруют 0,1 М раствором гидроксида натрия до перехода жёлтой окраски в синюю (индикатор – 0,1 мл 0,05 % раствора бромтимолового синего)
1 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия соответствует 13,31 мг L‑аспарагиновой кислоты C4H7NO4
Хранение. В плотно закрытой упаковке в защищённом от света месте при температуре не выше 25 °С.
