ОПТИЧЕСКАЯ РЕГИСТРАЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАНОЧАСТИЦ КОЛЛОИДНОГО ЗОЛОТА
1, 1, 1, 1,
1, 2
1ФКУЗ Росcийский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, г. Саратов,
E-mail: *****@***ru
2ФГБОУ ВО «Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени » Министерства образования и науки Российской Федерации
Для индикации и идентификации возбудителей инфекционных болезней наряду с молекулярно-генетическими и бактериологическими методами применяют иммунологические методы диагностики, основанные на реакции взаимодействия специфических антител с антигенами микроорганизмов и выявлении образовавшихся иммунных комплексов [1]. Для оптической и визуальной регистрации специфической иммунологической реакции традиционно применяют антитела c ферментными, флуоресцентными метками или иммобилизованные на различных видах носителей (эритроцитарных, латексных) [2-3]. В настоящее время представляет интерес использование различных видов наноматериалов для выявления антигенов микроорганизмов, характеризующиеся высокой стабильностью и устойчивостью к воздействию различных факторов, изменяющих свои оптические свойства при образовании иммунных комплексов [4].
Цель данной работы – оценка возможности применения антител, меченных коллоидным золотом, для оптической регистрации образования иммунных комплексов; оптимизация способов выявления специфической реакции; определение критериев дифференциации специфического взаимодействия от неспецифических изменений в результате агрегации и седиментации частиц.
В работе использовали иммуноглобулины чумные меченые наночастицами коллоидного золота (Ig-Au) диаметром 15 нм, синтезированных по методу G. Frens [5]. Иммуноглобулины конъюгировали с наночастицами коллоидного золота согласно Л. Дыкману [6]. В качестве антигенов использовали взвеси бактерий чумного микроба Yersina pestis EV НИИЭГ и туляремийного микроба Francisella tularensis 15 НИИЭГ Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» в концентрации 1 Ч 108 м. к./мл, обеззараженных в соответствии с СП 1.3.3118-13 [7]. Измерения спектральных характеристик образовавшихся комплексов проводили с использованием спектрометра HR-4000 (Ocean Optics, США) в диапазоне длин волн от 200 до 1100 нм. Измерение оптических характеристик (спектра поглощения) исследуемых взвесей осуществляли до инкубации c антителами и после инкубации в течение 30 мин при температуре 37 оС (рис. 1).
1 – IgAu + Y. pestis 0 мин, 2- IgAu + Y. pestis 30 мин, 3 – IgAu + F. tularensis 0 мин, 4 - IgAu + F. tularensis 30 мин
Рис. 1. Спектры поглощения взвесей микроорганизмов Y. pestis и F. tularensis при инкубации с иммуноглобулинами чумными мечеными коллоидным золотом (IgAu)
В результате исследований установлено изменение оптических характеристик взвеси Y. pestis при инкубации с гомологичными антителами и его отсутствие при инкубации F. tularensis с гетерологичными (чумными) антителами. Для количественной оценки изменений применяли три способа: графический, статистический и с использованием специализированной программы анализа.
При графическом анализе изменений установлено, что при инкубации с гомологичными антителами максимальное изменение оптической плотности составляет 0,15-0,2 ОЕ, при инкубации с гетерологичными антителами – 0-0,05 ОЕ (рис. 2).
Рис. 2. График изменений спектров поглощения взвесей Y. pestis (1), F. tularensis (2) после инкубации с иммуноглобулинами чумными мечеными коллоидным золотом
Для определения достоверности разности двух спектров (до инкубации и после инкубации с антителами) определяли критерии Стьюдента (t). Разность изменений в обоих случаях (при специфическом и неспецифическом взаимодействии) была достоверной с вероятностью безошибочного прогноза 95%. Однако критерий достоверности при специфической реакции был выше в 13 раз, чем при неспецифической (
=54,2 и 
=4,08, соответственно).
Анализ полученных спектров с использованием программы по учету и анализу результатов на базе оптоволоконного спектрометра (свидетельство о государственной регистрации г.) показал наличие специфического взаимодействия в случае с гомологичными антителами и отсутствие – с гетерологичными антителами.
На основании полученных данных, можно сделать вывод, что данный методический прием является альтернативой традиционным иммунологическим методам идентификации возбудителей. В отличие от иммуноферментного анализа, при использовании наночастиц коллоидного золота, сокращается время проведения анализа, отсутствует необходимость дополнительного этапа инкубации с антивидовыми конъюгатами и субстратного проявления комплексов антител с антигеном.
При анализе спектров оптимальным является использование специализированных компьютерных программ. Критериями наличия специфического взаимодействия может служить изменение оптической плотности более 0,1 ОЕ. В то же время, статистический анализ показал, что изменения оптических характеристик, обусловленные агрегацией и седиментацией частиц, могут происходить и при неспецифическом взаимодействии.
Библиографический список
1. Иммунология. – М.: Медицина, 1987. – 416 с.
2. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство / Под ред. акад. РАН , акад. РАН . – 2-е изд.,переработанное и дополненное. – , 2014. – 284 с.
3. Композитный диагностикум для выявления антител к видоспецифическому антигену чумного микроба (фракция 1) методом дот-иммуноанализа / , // Биотехнология. – 2016. – Т. 32. – №4. – С.49-55.
4. Золотые наноструктуры с плазмонным резонансом для биомедицинских исследований / , // Российские нанотехнологии. – 2007. – Т. 2. – № 3–4. – С. 69-86.
5. Frens G. Preparation of gold dispersions of varying particle size: Controlled nucleation for the regulation of the particle sise in monodisperse gold suspensions / G. Frens // Nature Phys Sci. – 1973. –V. 241, – N 1. – P. 20–22.
6. Применение дот-анализа и иммунозолотых маркеров для экспресс-диагностики острых кишечных инфекций / , // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 1999. – № 4. – С. 93–94.
