Результаты по преобладанию в нашей коллекции МКА, специфичных к матриксному VP40 филовирусов, совпадают с данными авторов (A. Lucht et al., 2000), описавших коллекцию из 12 гибридных клеточных линий, девять из которых синтезируют МКА к VP40 инактивированного ВЭ-Заир.
Исследование специфичности полученных МКА указывают на возможность их использования как для анализа антигенной структуры филовирусных белков, так и для конструирования диагностических тест – систем для выявления антигенов ВМ и ВЭ.
Таблица 1
Свойства МКА (первая коллекция), специфичных к вирусу Эбола
№ п/п
Назва-ние гибри-домы и МКА
Класс IgG
Белок-ми-шень
в ИБ
Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр. величины)
Концент-рация очищен-ных IgG (мг/мл)
Константа аффин-
ности
Ка, М-1
Культу-ральная среда
Асцити-ческая жидкость
Очищенный препарат
МКА
1
10A8
IgG2b
NP
900
218700
218700
7,2
1,4 x108
2
1E5
IgG2b
NP
2700
218700
218700
6,3
2,5 x108
3
4A8
IgG2b
NP
8100
2187000
2187000
8,0
2,8 x108
4
10B4
IgG2a
NP
8100
2187000
2187000
9,0
2,5 x108
5
7E1
IgG2a
NP
300
24300
24300
3,1
2,5 x108
6
6G8
IgG2a
NP
300
8100
24300
6,8
0,7 x108
7
4B9
IgG2b
NP
8100
656100
656100
7,4
9,0 x108
8
2H9
IgG1
NP
900
72900
72900
6,0
2,5 x108
9
6A8
н. о.
NP
900
27000
72900
4,3
2,9 x108
10
9G11
IgG2a
NP
8100
2187000
2187000
6,0
2,5 x108
11
9A7
IgG2b
NP
900
24300
24300
4,3
1,7 x108
12
1C7
IgG2a
VP35
8100
729000
2187000
7,8
3,1 x108
13
6F7
IgG2a
VP35
8100
656100
729000
8,3
2,8 x108
14
7B11*
н. о.
NP
н. о.
512000
512000
7,2
н. о.
Примечания: МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения
(автор ).
Выявление иммунодоминатных белков вирусов Марбург и Эбола
Полученные гибридные клеточные линии продуцируют МКА, для которых белки-мишени определены: к белку VP35 - 7 линий, к VP4линий и к NP - 16 линий (см. табл. 1, 2). Эти результаты показывают наличие антигенной структуры на внутренних белках VP35, VP40 и NP инактивированных вирионов ВМ и ВЭ. Вклад каждого белка в иммуногенность вирусного препарата по количеству полученных видов МКА оценить сложно, так как отбор положительных гибридом (продуцирующих МКА) проводили эмпирически, отбирая их в ТИФА по результатам сигнала ОП (>1,0) субстратно-индикаторной смеси в лунках с тестируемой культуральной средой от растущих гибридных клонов. Белок-мишень для полученных МКА можно определить, имея не менее 1 мл культуральной среды и достаточно АГ для переноса на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы протестировать большое количество гибридных клонов, но это рутиная и затратная процедура.
Таблица 2
Свойства МКА (вторая коллекция), специфичных к вирусу Эбола
№ п/п
Название гибридомы
и МКА
Cпеци-фичность к АГ
Класс IgG
Белок-мишень
в ИБ
Титры МКА против ВЭ в ТИФА (обр. величины)
Концент-
рация
очищен-
ных IgG (мг/мл)
Куль-туральная среда
Асцити-ческая жидкость
Очищен-ный препарат МКА
1
4A2
ВЭ-IS
IgG1
VP40
24300
6561000
6561000
7,7
2
5C10/H5
ВЭ-IS
IgG1
VP40
8100
72900
24300
6,3
3
3F6/E9/H8
ВЭ-IS
н. о.
VP40
900
24300
24300
4,3
4
2E12
ВЭ-IS
IgG2a
VP40
300
8100
8100
4,1
5
2G9/E12
ВЭ-IS
н. о.
VP40
900
24300
24300
2,5
6
2A3/C6
ВЭ-IS
н. о.
VP40
100
8100
н. о.
1,2
7
3E3/D8
ВЭ-IS
н. о.
VP40
100
2700
н. о.
0,5
8
4C4/E11/G12
ВЭ-IS
н. о.
VP40
900
24300
8100
2,8
9
3C7/D9
ВЭ-IS
IgG1
VP40
300
24300
24300
6,5
10
1B2
ВЭ-IS
IgG1
NP
8100
6561000
2187000
8,9
11
1B1
ВЭ-IS
н. о.
NP
100
8100
н. о.
н. о.
12
3B12
ВЭ-IS
н. о.
VP40
100
8100
н. о.
н. о.
13
4G8
ВЭ-IS
н. о.
VP40
300
8100
н. о.
н. о.
14
2H5
ВЭ-IS
н. о.
VP40
100
8100
н. о.
н. о.
15
1C1
ВЭ-8МС
IgG1
VP40
8100
6561000
6561000
14,5
16
1E6/A3
ВЭ-8МС
IgG1
VP40
8100
729000
729000
1,5
17
1B5
ВЭ-8МС
IgG2a
VP40
8100
218700
72900
5,7
18
3D9/C2
ВЭ-8МС
IgM
VP40
8100
729000
729000
7,0
19
3C12/G2
ВЭ-8МС
IgG2a
VP40
900
72900
72900
3,5
20
1G4
ВЭ-8МС
н. о.
VP40
300
н. о.
н. о.
н. о.
21
2H4
ВЭ-8МС
н. о.
VP40
100
н. о.
н. о.
н. о.
22
3F8
ВЭ-8МС
н. о.
н. о.
100
н. о.
н. о.
н. о.
23
3F6
ВЭ-8МС
н. о.
VP40
100
н. о.
н. о.
н. о.
24
7D12
ВЭ-8МС
н. о.
н. о.
100
н. о.
н. о.
н. о.
25
6A12
ВЭ-8МС
н. о.
н. о.
100
н. о.
н. о.
н. о.
Примечания: н. о. – не определяли; ВЭ-IS – исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС – штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (V. E. Volchkov et al., 2000).
Кроме того, для иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов были использованы инактивированные вирусные АГ, что могло повлиять на антигенную структуру вирусных белков.
Исследование антигенного состава любого патогена необходимо для совершенствования дифференцирующей диагностики на специфические маркеры, а также для разработки эффективных вакцин и противовирусных препаратов. По литературны данным, основными белками филовирусов, вызывающими иммунный ответ организма, являются NP, VP40 и белок VP35. Это было выявлено методом ИБ при исследовании сывороток крови обезьян различных пород из возможного ареала распространения филовирусов и cывороток крови реконвалесцентов (S. Becker et al., 1992).
Исследование спектра АТ, продуцируемых организмом в ответ на иммунизацию или инфицирование животных ВМ и ВЭ проводили методом ИБ. В инактивированных вирусных препаратах были выявлены вирусные белки-иммуногены, взаимодействующие с АТ сывороток крови от иммунизированных и инфицированных животных (табл. 3). Это белки - GP, NP, VP40, VP35, VP30 и VP24, формирующие антигенную структуру филовирусного вириона и распознаваемые иммунной системой макроорганизма при инфицировании или иммунизации. Белки NP, VP40, VP35 ВМ выявлялись АТ исследуемых сывороток в виде мажорных полос. Эти результаты свидетельствуют, что белки инактивированных вирусных АГ не теряют своих иммуногенных свойств, то есть сохраняются антигенные детерминанты. Особый интерес для данного исследования представляют результаты взаимодействия белков инактивированных вирусов с АТ инфицированных морских свинок, с IgG лошадей и АТ сыворотки реконвалесцента ( и др., 1994).
У морских свинок, переболевших экспериментальной ГЛМ, несмотря на одинаковую дозу заражения и одинаковое количество прошедших суток на день взятия крови, варьировал титр АТ и диапазон специфичности к вирусным белкам. Тем не менее, доминирующие полосы при ИБ соответствовали белкам - NP, VP40 и VP35 (см. табл. 3). В ТИФА был обнаружен титр 1/218700 для препарата IgG лошадей. Особенность получения данных препаратов состоит в том, что лошади не восприимчивы к филовирусным инфекциям, но вырабатывают нейтрализующие АТ в титре 1/2048. По данным и соавт. (2008) введение морским свинкам, полученного таким образом препарата, через 1 - 2 часов после заражения ВМ в дозе 20-50 ЛД50, защищало от гибели 88-100 % животных.
Противовирусные АТ сыворотки крови реконвалесцента выявляют эти белки в вирусном препарате методом ИБ так же в виде мажорных полос (см. табл. 3, рис. 1), что говорит о том, что внутренние структурные белки ВМ, так же как и наружные, презентируются иммунной системе организма индивидуально, обладают высокой иммуногенностью как в нативном, так и в инактивированном состоянии. Титр антивирусных АТ в сыворотке крови реконвалесцента составлял 1/24300. Такой же уровень антител наблюдался в сыворотке крови мышей (№ 2), иммунизированных инактивированным ВМ.
Так же в табл. 3 представлены результаты специфического взаимодействия в ТИФА белков ВЭ с противовирусными АТ. Наиболее высокий титр АТ (1/2187000 и 1/729000) был выявлен в сыворотках крови мышей (от гибридизаций № 5 и № 4), иммунизированных инактивированным АГ ВЭ.
Несмотря на то что, ВМ и ВЭ являются представителями одного семейства, по антигенной характеристике они имеют заметные отличия. На это обратили внимание K. M. Johnson соавт. (1977), пытаясь сравнить впервые выделенный ВЭ с уже известным ВМ. Дальнейшие исследования филовирусов подтвердили их антигенные различия (M. P. Kiley, 1988; E. D. Johnson et al., 1996). Но в работе S. Becker cоавт. (1992) отмечается, что при исследовании сывороток крови от людей, переболевших ГЛМ в 1967 г., регулярно наблюдалась кросс-реактивность с АГ ВЭ в реакции иммунофлюоресценции. Аминокислотная последовательность, определенная для NP ВМ и ВЭ, показывает высокую степень их гомологии 400 N-концевых а. о. (A. Sanchez et al., 1993), что позволяет предположить наличие антигенного перекреста. При сравнении аминокислотной последовательности белков VP35 ВЭ и ВМ также были обнаружены у них гомологичные участки (A. Bukreyev et al., 1993).
В исследовании было обнаружено, что в сыворотках крови животных ПАТ имеют перекрестную активность с гетерологичными антигенами в ТИФА (см. табл. 3). Методом ИБ ранее были показаны белки для перекрестных взаимодействий ПАТ мышей, иммунизированных ВЭ – это NP и VP35 ВМ (, 2002). Возможно, что при инактивации вирионов открылись гомологичные а. о. последовательности филовирусных белков.
Для исключения не специфического взаимодействия противовирусных АТ с гетерологичными вирусными белками использовали для исследования аффинно-очищенные рек. белки, полученные в результате экспрессии полноразмерных филовирусных генов в клетках E.coli.
Получение рекомбинантных белков филовирусов в экспрессионной системе E.coli и исследование их свойств с помощью противовирусных антител
Для наработки и очистки филовирусов необходим 4 уровень биозащиты, персонал со специальной подготовкой и надежная инактивация вирусных препаратов. Есть данные, что рек. NP ВЭ и ВМ, экспрессированные в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в E.coli, обладали антигенностью и были использованы в ИФА в качестве АГ для обнаружения IgG в сыворотках реконвалесцентов. Специфичность определения IgG была 100 %-ной, без ложноположительных результатов. Кроме того, было обнаружено, что рек. NP ВЭ, полученный на основе гена NP ВЭ-Заир, можно использовать для выявления IgG к другим штаммам ВЭ - Судан, Рестон и Берег Слоновой Кости (M. Saijo et al., 2001). Рек. VP40 ВЭ использовали в качестве положительного контроля на АГ в лабораторной тест-системе (G. Kallstrom et al., 2005). Так же рек. VP40 ВЭ был использован в ИБ для точного определения специфичности МКА, полученных к инактивированному ВЭ-Заир (штамм Mayinga) (A. Luch et al., 2003).
Таблица 3
Исследование спектра филовирусных белков-иммуногенов и перекрестного взаимодействия поликлональных антител с филовирусными антигенами в ТИФА
Источник
антител
Сутки взятия крови от начала иммуниза-ции
Иммуноген
Титры антител в ИФА
(обратные величины)
Белки-иммуногены, выявляемые
в ИБ на гомологичном инактивированном антигене
Антигены
инакт.
ВМ
инакт. ВЭ
мышь № 1
14
инакт. ВМ
8100
<100
NP, VP35, VP40
мышь № 2
21
инакт. ВМ
24300
300
GP, NP, VP35, VP40,VP30,VP24
кролик
нет данных
инакт. ВМ
24300
<100
NP, VP40, VP35, VP30,VP24
IgG лошади
нет данных
инф. ВМ
218700
<100
GP, NP, VP35, VP40,VP30
ЧС
нет данных
инф. ВМ
24300
900
GP, NP, VP35, VP40,VP30,VP24
морская свинка
нет данных
инакт. ВМ
900
<100
NP, VP40, VP35
морская свинка* (6.4; 7.2)
14
инф. ВМ
200; 200
NP
морская свинка* (2.2; 4.2;6,3)
14
инф. ВМ
6400; 6400; 12800
GP, NP, VP40, VP35
морская свинка* (2.1;4.1;5.1; 6.1; 6.2)
14
инф. ВМ
1600; 800; 800; 400; 6400
<100
NP, VP40, VP35
морская свинка* (1.2;5.2)
14
инф. ВМ
400; 400
<100
NP, VP35
морская свинка* (1.3; 1.4)
14
инф. ВМ
400; 400
<100
NP, VP40
морская свинка* (3.1)
14
инф. ВМ
200
<100
VP40
мышь № 1
14
инакт. ВЭ-IS
2700
72900
NP, VP40, VP35,VP30, VP24
мышь № 2
14
инакт. ВЭ-IS
900
72900
NP, VP40, VP35,VP30, VP24
мышь № 3
14
инакт. ВЭ-IS
300
81000
L, GP, NP, P40,VP35,VP30,VP24
мышь № 4
21
инакт. ВЭ-IS
300
729000
L, GP,NP, VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 5
14
инакт. ВЭ-IS
300
2187000
L, GP,NP, VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 6
14
инакт. ВЭ-8МС
<100
9000
L, GP,NP, VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 7
14
инакт. ВЭ-8МС
300
243000
L, GP,NP, VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 8
14
инакт. ВЭ-8МС
300
72900
L, GP,NP, VP40,VP35,VP30,VP24
мышь № 9
14
инакт. ВЭ-8МС
300
72900
L, GP,NP, VP40,VP35,VP30,VP24
кролик
нет данных
инакт. ВЭ-IS
2700
72900
NP, VP40, VP35,VP30, VP24
крыса
14
инакт. ВЭ-IS
8100
72900
NP
IgG лошади
26-42
инф. ВЭ
24300
218700
NP, VP40, VP35
морская свинка
нет данных
инакт. ВЭ-IS
<100
900
NP
морская свинка
нет данных
инф. ВЭ
<100
900
GP, NP
контроли
без антигена
<100
<100
-
Примечание к табл. 3: инакт. – инактивированный вирусный препарат; инф. – инфекционный вирус; *- сыворотки от выживших морских свинок, инфицированных ВМ (условное обозначение каждого животного); ЧС - сыворотка реконвалесцента (человек переболел ГЛМ) ( и др., 1994); нормальные сыворотки - мыши, кролика, крысы, лошади, морской свинки и человека использовались в качестве отрицательного контроля; № 1 - 9 – сыворотки мышей, представляющие собой каждая пул сывороток от 3 мышей – доноров иммунных спленоцитов, используемых для гибридизаций; NP, VP40, VP35 – жирным шрифтом выделены белки, образующие доминирующие полосы при ИБ.
Рис. 1. Иммуноблоттинг. Выявление белков вируса Марбург антителами сыворотки реконвалесцента
1 – нормальная сыворотка человека в разведении 1/1000;
2 – сыворотка человека, переболевшего ГЛМ ( и др., 1994),
в разведении 1/1000;
Стрелками обозначено местоположение белков ВМ на нитроцеллюлозной мембране.
Оценку степени чистоты рек. белков, полученных в настоящем исследовании оценивали по результатам ПААГ-ЭФ с SDS (рис. 2, 3, 4). Были исследованы свойства рек. белков ВМ и ВЭ: антигенные - по выявлению специфических антивирусных АТ реконвалесцента и АТ иммунизированных животных; и иммуногенные – по взаимодействию АТ, полученных к рек. белкам, с вирусными АГ методами ТИФА и ИБ. Серопозитивная сыворотка крови рековалесцента оказалась ценным препаратом для исследования рек. белков, так как содержит противовирусные АТ, которые наглядно отражают распознавание антигенных детерминант ВМ иммунной системой человека в течение естественной инфекции. Результаты тестирования, представленные в табл. 4 и табл. 5 демонстрируют, что рек. аналоги вирусных белков GP, NP, VP35, VP40,VP24 ВМ и VP35, NP, VP40 ВЭ обладают иммуногенностью - вызывают синтез антител в организме иммунизированных беспородных мышей и выявляют в ТИФА антивирусные антитела, то есть обладают антигенными свойствами.
Рис. 2. Электрофореграмма. Анализ
белков, синтезирующихся под контролем
рекомбинантной плазмиды pQE-VP35
вируса Эбола в клетках
E.coli
1 – лизат E.coli – pQE;
2,3 – лизат E.coli – pQE-VP35 ВЭ;
4 – препарат очищенного рек. белка VP35 ВЭ;
5 – препарат инактивированного ВЭ
(стрелкой показан вирусный белок VP35);
обозначено местоположение маркеров
молекулярной массы – 18, 29, 36, 43, 68,
97 и 116, соответственно.
Рис. 3. Электрофореграмма вирусов Марбург и Эбола и очищенных рекомбинантных белков VP40
1. Рек. белок VP40 ВМ (5 мкл);
2. препарат инактивированного ВМ (10 мкл);
3. препарат инактивированного ВЭ (10 мкл);
4. рекомбинантный белок VP40 ВЭ (5 мкл);
5. местоположение белковых маркеров молекулярной массы (Bio-Rad).
Рис. 4. Электрофореграмма
вируса Эбола и очищенного
рекомбинантного нуклеопротеина
1. рекомбинантный белок
NP ВЭ (5 мкл);
2. препарат инактивированного
ВЭ (10 мкл).
Таблица 4
Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург
№ п/п
ПАТ
Взаимодействие ПАТ с ВМ и рекомбинантными белками в ИБ
Титры рекомбинантных белков при
специфическом взаимодействии с ПАТ
(обратные величины) в ТИФА
ВМ
рек. GP
рек. NP
рек. VP40
рек.
VP35
рек.
VP24
рек. GP
рек. NP
рек. VP40
рек.
VP35
рек.
VP24
1
ЧС
(1/500)
+
-
+
+
+
+
800
12800
8100
8100
6400
2
IgG
лошади
(1/1500)
+
-
+
+
+
+
1600
72900
40500
13500
1600
3
МАС-ВМ
№ 2
(1/1000)
+
+
+
+
+
+
900
24300
8100
8100
1600
4
МАС-рек. GP
(1/1000)
+
+
-
-
-
-
72900
<100
<100
<100
<100
5
МАС-рек. NP
(1/5000)
+
-
+
-
-
-
<100
218700
<100
<100
<100
6
МАС-рек. VP35
(1/5000)
+
-
-
-
+
-
<100
<100
656100
<100
<100
7
МАС-рек. VP40
(1/10000)
+
-
-
+
-
-
<100
<100
<100
1087500
<100
8
МАС-рек. VP24
(1/5000)
+
-
-
-
-
+
<100
<100
<100
<100
202400
Примечания: ПАТ – поликлональные антитела иммунных сывороток; r – рек. белок;
ЧС - сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (разведение); МАС-ВМ № 2 - пул сывороток от 3 мышей, иммунизированных АГ ВМ и используемых для гибридизации на 21-е сутки от начала иммунизации в разведении ; МАС-рек. - сыворотки мышей, иммунизированных рек. белками GP, NP, VP40, VP35, VP24 ВМ.
Таблица 5
Исследование антигенных и иммуногенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола
Источник антител
Титры специфических антител (обратные величины) и взаимодействие
в ИБ
Антигены (концентрация для ТИФА 1 мкг/мл )
Инактивирован-ный ВЭ
рек. VP35
рек. VP40
рек. NP
рQE
ИФА
ИБ
ИФА
ИБ
ИФА
ИБ
ИФА
ИБ
ИФА
ИБ
IgG лошади - ВЭ
656100
+
121500
+
656100
+
656100
+
<100
-
МАС - ВЭ
218700
+
218700
+
218700
+
656100
+
<100
-
АС крысы - ВЭ
218700
+
24300
+
218700
+
218700
+
<100
-
АС кролика - ВЭ
218700
+
218700
+
218700
+
656100
+
<100
-
МАС – рек. VP35
729000
+
729000
+
<100
-
<100
-
<100
-
МАС – рек. VP40
656100
+
<100
-
1968300
+
<100
-
<100
-
МАС – рек. NP – ВЭ
656100
+
<100
-
<100
-
1968300
+
<100
-
отрицательные контроли**
<100
-
<100
-
<100
-
<100
-
<100
-
Примечание: МАС – мышиные антисыворотки; рQE – лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков); * – проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических МАС в присутствии 1 %-го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37 0С; ** – в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки лошади, мыши, крысы и кролика.
Изучение возможности использования инактивированного вируса Марбург и рекомбинантных белков для выявления специфических иммуноглобулинов класса IgG в сыворотках крови животных и человека
Описанные выше исследования рек. белков - GP, NP, VP35, VP40 и VP24 ВМ показали сходство их антигенных свойств с природными вирусными белками, что указывает на возможность использования данных препаратов в тест-системах для выявления специфических АТ.
Для анализа уровня АТ к каждому вирусному белку использовали в качестве АГ отдельные рек. белки. Это позволило определить уровень и спектр АТ к отдельным белкам ВМ (табл. 6). Наиболее высокая концентрация специфических АТ в сыворотке крови реконвалесцента была зарегистрирована к NP (1/24300) и, по убывающей, к VP40 (1/8100) и к VP35 (1/2700). Уровень специфических АТ к GP был ниже, чем к другим белкам и вообще не определялся в сыворотке, взятой у пациента через шесть лет после болезни. Такая же тенденция, по уровню АТ к индивидуальным белкам, была обнаружена и для АТ в сыворотках крови иммунизированных животных.
В случае применения в качестве АГ комбинации четырех рек. белков ВМ - GP, NP, VP35 и VP40, повышался уровень титров выявления специфических АТ исследуемых сывороток по сравнению с использованием инактивированного АГ ВМ.
Таблица 6
Использование рекомбинантных белков в качестве антигена в ТИФА для выявления IgG, специфичных к вирусу Марбург
Источник
антител
Титры специфических IgG (обратные величины)
Антигены (концентрация нг/лунку)
вирус
Марбург
(200)
рек. GP
(200)
рек. NP
(200)
рек. VP40
(200)
рек. VP35
(200)
рек. белки
(400)***
рQE
(400)
ЧС (1990 г.)
24300
900
24300
8100
2700
24300
<100
ЧС (1996 г.)
200
<100
400
400
<100
800
<100
IgG лошади
218700
13500
121500
40500
13500
364500
<100
МАС–ВМ № 1
8100
<100
2700
2700
<100
8100
<100
МАС-ВМ № 2
24300
900
24300
24300
8100
72900
<100
МАС–рек. GP*
8100
656100
<100
<100
<100
72900
<100
МАС–рек. NP*
72900
<100
72900
<100
<100
24300
<100
МАС–рек. VP35*
24300
<100
<100
<100
656100
218700
<100
МАС–рек. VP40*
72900
<100
<100
1968300
<100
218700
<100
отрицательные
контроли**
<100
<100
<100
<100
<100
<100
<100
Примечание: ЧС – сыворотка человека, переболевшего ГЛМ (в скобках указана дата забора крови); МАС – мышиные антисыворотки; рQE – лизат E.coli (отрицательный контроль для рек. белков);
* – проводили обработку (истощение) исследуемых моноспецифических МАС в присутствии 1 %-го раствора лизата E.coli клеток 20 мин при 37 0С; ** – в качестве отрицательного контроля использовали нормальные сыворотки человека (5 сывороток), лошади (1 сыворотка), мыши (5 сывороток); *** – смесь рек. белков GP, NP, VP35, VP40 по 100 нг/лунку каждого.
Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Марбург с помощью панели МКА
По исследованию рек. белков ВМ имеется два сообщения - об использовании рек. NP, экспрессированного в виде полноразмерных копий в бакуловирусной системе и в виде С-концевых фрагментов в E.coli, для выявления противовирусных АТ в сыворотках крови реконвалесцентов людей (M. Saijo et al., 2001) и о получении МКА, специфичных к этому рек. белку и выявляющих вирусный АГ в реакции иммунофлюоресценции (M. Saijo et al., 2005).
Для изучения рек. белков NP, VP35, VP40 ВМ, получили панель гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Панель содержит - 3 вида МКА к NP, 3 вида МКА к белку VP35 и 9 видов МКА к VP40 (табл. 7). Для одного вида МКА 3А5 белок-мишень в ИБ не определялся, хотя он имел высокий титр в ТИФА, видимо эпитопы для этого вида МКА имеют конформационную структуру.
Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками ВМ оценивали в ТИФА и ИБ. Как видно из представленных данных (см. табл. 7), большинство МКА активно взаимодействовали с рек. белками – аналогами вирусных белков в ТИФА. Специфическое взаимодействие рек. белков с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 5-7. Так же было показано, что МКА, специфичные к ВМ, не имеют перекрестного взаимодействия с рек. белками гетерологичного ВЭ в ИБ и ТИФА, в отличие от данных по перекрестному взаимодействию противовирусных ПАТ с гетерологичными вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).
Рис. 5. Иммуноблоттинг рекомбинантных белков NP вируса Марбург с МКА, специфичными к вирусному нуклеопротеину
Цельная мембрана, содержащая:
1 – лизат клеток 293 (отрицательный контроль);
2 - лизат клеток 293, инфицированных vTF7-3 (отрицательный контроль);
3 – инактивированный ВМ;
4 – рек. NP, экспрессированный в эукариотических клетках 293;
5 – рек. NP, экспрессированный в прокариотических клетках E.coli;
6 – лизат клеток E.coli (отрицательный контроль);
обработана смесью МКА 5F1, 5H7 и 9С7 в разведении 1/1000 каждого.
Рис. 6. Иммуноблоттинг рекомбинантного белка VP40 с МКА, специфичными к матриксному вируса Марбург, обработан МКА 7Н10 (положительный контроль);
2 - препарат ВМ, обработан МКА 7D8 (положительный контроль);
3 – рек. белок VP40, обработан МКА 7Н10;
4 – рек. белок VP40, обработан МКА 7D8;
5 - препарат ВЭ, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль);
6 - препарат ВЭ, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль);
7 - лизат E.coli, обработан МКА 7Н10 (отрицательный контроль);
8 - лизат E.coli, обработан МКА 7D8 (отрицательный контроль); МКА использовали в разведении (1/500).
Таблица 7
Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Марбург
№
п/п
Назва-
ние
МКА
Иммуно-ген
Вирусный белок-
мишень
в ИБ
Взаимо-
действие
с рек.
белком-
аналогом
в ИБ
Титры антител в ТИФА с вирусными антигенами
и рекомбинантными аналогами
вирус
Марбург
рек. NP –
ВМ
рек. VP40-
ВМ
рек. VP35-
ВМ
1
3F9
ВМ
VP35
+
656100
-
-
729000
2
9D8
ВМ
VP35
+
729000
-
-
656100
3
8G3
ВМ
VP35
-
218700
-
-
72900
4
5G9
ВМ
VP40
+
729000
-
72900
-
5
7H10
ВМ
VP40
+
729000
-
729000
-
6
9G6
ВМ
VP40
+
218700
-
218700
-
7
6B7
ВМ
VP40
+
656100
-
656100
-
8
1C12
ВМ
VP40
+
24300
-
24300
-
9
10E11
ВМ
VP40
+
24300
-
24300
-
10
7D8
ВМ
VP40
+
2187000
-
243000
-
11
5G8
ВМ
VP40
+
656100
-
656100
-
12
7С4
ВМ
VP40
+
2187000
-
729000
-
13
5F11
ВМ
NP
+
2187000
24300
-
-
14
9C7
ВМ
NP
+
6561000
6561000
-
-
15
5H7
ВМ
NP
+
2187000
2187000
-
-
16
3A5
ВМ
NP (?)
-
218700
-
-
-
Примечания: для иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов был использован инактивированный ВМ; NP (?) – белок – мишень не определяется этим видом МКА в ИБ и не взаимодействует с рек. белком, но по результатам КИФА имеет сродство к NP ВМ (, 2002); + есть реакция в данном методе; - нет реакции в данном методе; 100 нг/лунка – концентрация антигенов.
Рис. 7. Иммуноблоттинг с вирусных и рекомбинантных белков VP35 вируса Марбург с моноклональными антителами
1 – препарат ВМ (10 мкл), стрелкой обозначен вирусный белок VP35;
2 - препарат ВЭ (отрицательный контроль на антиген);
3 – лизат E.coli. (отрицательный котроль для рек. белка);
4 – очищенный рек. белок VP35 ВМ (10 мкл) обозначен стрелкой;
все полоски мебраны обработаны препаратом очищенных МКА 3F9 в разведении 1/500;
5 – значения молекулярной массы белковых маркеров.
Изучение антигенных свойств рекомбинантных белков вируса Эбола с помощью МКА
Рек. белки VP35, NP и VP40 ВЭбыли исследованы с помощью панели гибридомных МКА, специфичных к гомологичным вирусным белкам. Специфическое взаимодействие МКА с рек. белками VP35, NP и VP40 ВЭ оценивали в ТИФА и ИБ (табл. 8). Специфическое взаимодействие рек. белков NP и VP40 ВЭ с МКА в ИБ для примера представлено на рис. 8, 9.
Было выявлено, что МКА, специфичные к ВЭ, не имели перекрестного взаимодействия с рек. белками ВМ в ИБ и ТИФА, в отличие от перекрестного взаимодействия ПАТ с вирусными белками, как это было показано ранее (см. табл. 3).
Так как вирусные белки, с которыми взаимодействовали АТ, выявляли методом ИБ, это позволо предположить, что данные эпитопы являются конформационно стабильными и, видимо, представлены “линейной” структурой как на вирусных белках, так и на их рек. аналогах. Для того чтобы выяснить, существуют ли подобные антигенные структуры на белках вириона исследовали взаимодействие МКА с инфекционным вирусным препаратом в ТИФА в условиях 4 уровня биозащиты (табл. 9). Результаты проведенного анализа демонстрируют наличие исследуемых эпитопов на белках VP35 и NP очищенных вирионов ВЭ и сохранность этих эпитопов после инактивации. Высокая специфичность взаимодействия АТ иммунной сыворотки против рек. VP35 ВЭ с очищенными инфекционными вирионами, подчеркивает подобие эпитопов рек. белка и природного VP35 ВЭ.
До начала исследований всей панели МКА методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” для выявления не конкурирующих за антигенные эпитопы МКА, пригодных для конструирования тест-ситемы по выявлению филовирусных АГ, пара МКА (4А8 и 6F7 из первой коллекции), были использованы при разработке метода экспресс-выявления антигена ВЭ ( и др., 2007). Основой тест-системы служит нитроцеллюлозная мембрана с нанесенными на нее МКА 4А8 (в концентрации 0,1 мг/мл) для захвата антигена. МКА 6F7, сорбционно связанные с коллоидным золотом, служили детектирующими. Было показано выявление АГ ВЭ на вторые сутки после инфицирования в сыворотке крови сотрудника, фатально заболевшего при лабораторной аварии. Чувствительность выявления вирусного АГ составила 3 нг/мл, при титре вирусемии в сыворотке крови 105 БОЕ/мл. Эти данные служат достаточным основанием использования МКА, которые строго специфичны к внутренним вирусным белкам NP, VP40 и VP35 ВЭ и не имеют перекрестной активности c гетерологичным АГ, для разработки ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
