Таблица 8
Анализ специфичности рекомбинантных белков вируса Эбола
№
п/п
Назва-
ние
МКА
Специ-
фич-
ность
(вирус)
Белок-
мишень
Взаимо-
действиес рек.
белком-
аналогом
в ИБ
Титры антител в ТИФА с вирусными антигенами и
рекомбинатными аналогами
вирус
Эбола
рек. VP35-ВЭ
рек. NP - ВЭ
рек. VP40-ВЭ
1
1C7
ВЭ-IS
VP35
+
2187000
729000
<100
<100
2
6F7
ВЭ - IS
VP35
+
729000
218700
<100
<100
3
1B2
ВЭ-IS
NP
+
2187000
<100
2187000
<100
4
7B11*
ВЭ-IS
NP
+
512000
<100
656100
<100
5
1E5
ВЭ-IS
NP
+
218700
<100
243000
<100
6
4B9
ВЭ-IS
NP
+
656100
<100
2187000
<100
7
9A7
ВЭ-IS
NP
+
24300
<100
72900
<100
8
4А8
ВЭ-IS
NP
+
2187000
<100
121500
<100
9
10В4
ВЭ-IS
NP
+
2187000
<100
729000
<100
10
6G8
ВЭ-IS
NP
+
24300
<100
243000
<100
11
6A8
ВЭ-IS
NP
+
72900
<100
40500
<100
12
10A8
ВЭ-IS
NP
+
218700
<100
218700
<100
13
1C1
ВЭ-8МС
VP40
+
6561000
<100
<100
6561000
14
4A2
ВЭ-IS
VP40
+
6561000
<100
<100
6561000
15
1E6
ВЭ-8МС
VP40
+
72900
<100
<100
656100
16
3D9
ВЭ-8МС
VP40
+
729000
<100
<100
218700
17
1B5
ВЭ-8МС
VP40
+
72900
<100
<100
656100
18
5С10
ВЭ-IS
VP40
+
24300
<100
<100
13500
19
2E12
ВЭ-IS
VP40
+
24300
<100
<100
24300
Примечания: ВЭ-IS – исходный штамм ВЭ-Заир; 8МС – штамм ВЭ-Заир, адаптированный к морским свинкам, на 8 пассаже вызвал гибель животных (V. E. Volchkov et al., 2000) МКА 7B11* - продукт секреции гибридомы крысиного происхождения (автор гибридомы ); + есть реакции в данном методе; 100 нг/лунка – концентрация антигенов.
Рис. 8. Иммуноблоттинг. Выявление вирусного белка VP35 в составе вирусного препарата ПАТ мышиной моносыворотки, специфичной к рек. белку VP35 ВЭ
1 - очищенный препарат ВЭ обработан моносывороткой к рек. VP35;
2 – рек. белок VP35 обработан нормальной АС мыши (отрицательный контроль);
3 – рек. белок VP35 обработан моносывороткой к рек. VP35 (положительный контроль);
антитела использовали в разведении (1/3000).
Рис. 9. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных к вирусному белку VP40 с рекомбинантным белком-аналогом вируса Эбола
1 - препарат ВЭ, обработан МКА 4А2;
2 - препарат ВЭ, обработан МКА 1С1;
3 – рек. белок VP40, обработан МКА 4А2;
4 – рек. белок VP40, обработан МКА 1С1;
5 - препарат ВМ, обработан МКА 4А2 (отриц. контроль);
6 - препарат ВМ, обработан МКА 1С1 (отриц. контроль);
7 - лизат E.coli., обработан МКА 4А2 (отриц. контроль);
8 - лизат E.coli., обработан МКА 1С1 (отриц. контроль);
МКА использовали в разведении (1/10000).
Рис. 10. Иммуноблоттинг. Взаимодействие МКА, специфичных
к вирусному нуклеопротеину вируса Эбола с рекомбинантным белком: 1 - препарат ВЭ, обработан МКА 1В2;
2 - препарат ВЭ, обработан МКА 7В11;
3 – рек. NP, обработан МКА 1В2;
4 – рек. NP, обработан МКА 7В11;
5 - препарат ВМ, обработан МКА 1В2
(отриц. контроль);
6 - препарат ВМ, обработан МКА 7В11
(отриц. контроль);
7 - лизат E.coli, обработан МКА 1В2 в разведении 1/500
(отриц. контроль);
8 - лизат E.coli, обработан МКА7В11 в разведении
(отриц. контроль); МКА использовали в разведении (1/500).
Таблица 9
Взаимодействие МКА, специфичных к инактивированному вирусу Эбола с нативными вирионными белками
Источник антител
Титр антител
Очищенный ВЭ*
(до инактивации)
Инактивированный ВЭ**
МКА 1С7 – VP35
н. о.
2187000
МКА 6F7 – VP35
н. о.
729000
Cмесь МКА к VP35 (1С7+6F7)
1562500
312500
МАС – рек. VP35
3125000
729000
Cмесь МКА к NP (10А8 + 4B9+10В4+1Е5+6А8)
3125000
3125000
МКА 10А8
н. о.
218700
4В9
н. о.
656100
10В4
н. о.
2187000
1Е5
н. о.
218700
6А8
н. о.
72900
Примечания: Данный эксперимент провел доктор в условиях 4 уровня биозащиты; МАС - рек. VP35 – сыворотка мыши, иммунизированной рек. белком VP35 ВЭ; ВЭ* - инфекционный вирусный препарат; ВЭ** - вирусный АГ инактивирован 1 %-ным раствором SDS; сорбция антигенов в концентрации 100 нг/лунку; н. о – не определяли.
Отбор парных МКА не конкурирующих за антигенные эпитопы вирусных и рекомбинантных белков вируса Марбург и Эбола
Метод ИФА в формате “сэндвич” с ПАТ применяли при разработке лабораторных ИФА тест-систем для выявления ВМ в работах ( и др., 1991; , 1993). В одной работе описаны МКА, специфичные к GP, которые были использованы в качестве “индикаторных” для выявления вирусного АГ ( и др., 2001), а в другой (M. Saijo et al., 2005) для “захвата” АГ использовали МКА, специфичные к определенным перекрывающимся эпитопам (634-647 а. о. и 643-695 а. о.) рек. NP ВМ.
При разработке первых лабораторных ИФА тест-систем для выявления АГ ВЭ применяли метод ИФА в формате “сэндвич” в основном с ПАТ разных видов животных ( и др., 1995; T. G. Кsiazek et al., 1992) или сочетано с МКА, специфичными к вирусному белку VP40 (G. Kallstrom et al., 2005) или рек. NP (M. Niikura et al., 2001). В недавней работе зарубежных исследователей показано практическое применение двух видов МКА, специфичных к матриксному белку VP40, при исследовании проб сывороток крови, мочи, слюны и пота людей, собранных при вспышке ГЛЭ в Республике Конго в 2003 г. (A. Lucht et al., 2007). Принцип метода иммунофильтрации состоит в “сэндвиче” из МКА, один вид которых нанесен на матрицу колонки с открытым сужающимся дном, что обеспечивает хорошую промывку. Второй вид МКА, меченных биотином, реагирует с конъюгатом стрептовидина и пероксидазы. Иммунохимическую реакцию АТ с АГ проявляли раствором ТМБ. Для учета ОП реакции используют портативный фотометр или учитывают результат визуально. Данный метод для выявления вирусного АГ пригоден для полевых испытаний без использования электричества и дорогого оборудования. Время проведения анализа составляет 30 минут. Чувствительность выявления нативного вирусного АГ составила 105 БОЕ/мл. Инактивация исследуемых проб с 1 % SDS, повышашало чувствительность системы до 104 БОЕ/мл.
Создание представительной панели МКА, специфичных к трем филовирусным белкам – NP, VP40 и VP35, позволило использовать метод двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” для выявления МКА, не конкурирующих за антигенные эпитопы, то есть способных эффективно “захватывать” вирусный или рек. АГ из исследуемой пробы.
МКА, имеющие высокий титр в ТИФА в виде культуральной жидкости от гибридных культур клеток, наработали in vivo. Асцитические жидкости очищали каприловой кислотой (H. Bazin et al., 1990) с последующим высаливанием 50 %-ным раствором сульфата аммония и оценивали степень чистоты полученных препаратов МКА в ЭФ. На рисунке 11, для примера, представлены несколько из использованных в исследовании очищенных МКА. Данный метод позволяет получать очищенные МКА с четко выраженными на электрофореграмме тяжелыми (на уровне 50-55 кДа) и легкими (20-25 кДа) цепями IgG. Хорошая очистка МКА важна для исключения неспецифического фона при иммунохимических взаимодействиях, для сорбции на полистироловую поверхность планшетов большего количества IgG, несущих специфические паратопы для АГ и приготовления универсальных конъюгатов с ферментами.
Рис. 11 Электрофореграмма МКА,
очищенных каприловой кислотой
1 - белковые маркеры молекулярной массы
(10 мкл), (Bio-Rad);
2,3.4 - препараты очищенных мышиных
МКА 3F9, 7D8, 7H10,
специфичные к ВМ (по 1 мкл);
5,6,7 – препараты очищенных мышиных
МКА 1C1, 4A2, 1В2,
специфичные к ВЭ (по 1 мкл);
стрелками обозначены цепи IgG.
Методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич” было исследовано 16 видов МКА, специфичных к белкам. На их основе было сформировано 224 сочетания пар МКА. Из 74 пар МКА, выявляющих инактивированный АГ ВМ (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0пар МКА выявляли рек. белки: 11 пар выявляли рек. VP40 и 4 пары – рек. VP35 (табл. 10).
Так же был исследован 21 вид МКА, специфичных к белкам ВЭ – два к VP35; девять к VP40; десять к нуклеопротеину. Из них было сформировано 399 различных сочетаний пар МКА. Инактивированный антиген ВЭ удовлетворительно выявляли 115 пар МКА (при ОП субстратно-индикаторной смеси в тестируемых лунках >1,0), из них 29 пар МКА выявляли рек. белки: 17 пар выявляли рек. VP40 и 14 пар – рек. NP (см. табл. 10).
Интересен был факт выявления инактивированных АГ парами МКА, специфичных к разным вирусным белкам. Эти данные предполагают высокое белок - белковое взаимодействие вирусных протеинов в вирионе, несмотря на жесткую инактивацию. По литературным данным, при исследовании структуры филовирусов методом электронной микроскопии было зафиксировано, что NP и VP40 ВЭ-Заир тесно связаны в течение вирусного морфогенеза, что является важной деталью при постановке диагноза филовирусных заболеваний (T. W. Geibert et al., 1995). При исследовании вклада филовирусных белков в формирование вирусоподобных частиц (VLPs) было показано, что NP ВЭ самостоятельно, без помощи VP40, не выходит из клеток и поэтому была предположена важная связь между этими белками (J. Licata et al., 2004).
Использование рек. белков позволяет более точно определять чувствительность выявления индивидуальных АГ. Так, по литературным данным, очищенный АГ ВЭ выявляли парой МКА, специфичных к белку VP40, до концентрации 1-2 нг/мл, что соответствовало инфекционному титру 103-104 БОЕ/мл (A. Luch et al., 2003). При использовании МКА для “захвата” АГ была показана чувствительность выявления рек. VP40 ВЭ в концентрации 2 нг/100 мкл (G. Kalstrom et al., 2005) и рек. NP в концентрации 30 нг/100 мкл (M. Niikura et al., 2001).
В данном исследовании чувствительность выявления рек. АГ разными парами МКА находилась в диапазоне концентраций от 150 до 1 нг/мл). Были выбраны четыре пары МКА, которые наиболее эффективно выявляли как очищенные вирусные АГ, так и рек. белки с чувствительностью 1 нг/мл. Это пара МКА 1В2 и 7В11, специфичные к NP ВЭ (рис. 12) и пара МКА 4А2 и 1С1, специфичные к белку VP40 ВЭ (рис. 13). Для белка VP40 ВМ это пара МКА очищенных 7D8 и меченных биотином 7H10 (рис. 14).
МКА 3F9, специфичные белку к VP35, можно одновременно эффективно использовать как в качестве “захватывающих” АГ, так и в качестве меченных биотином МКА для выявления АГ VP35 ВМ (рис. 15). В двух известных коллекциях мышиных гибридом, продуцирующих МКА к ВМ, штамм Musoke (M. Hevey et al., 1997) и штамм Рорр ( и др., 2001), отсутствуют гибридомы, продуцирующие МКА к белку VP35. Это делает МКА 3F9, специфичные к VP35 ВМ особенно перспективными для дальнейшего практического использования.
Выбранные пары МКА строго специфичны к внутренним структурным вирусным белкам NP, VP40 и VP35 филовирусов, не имеют перекрестной реактивности с гетерологичными вирусными и рек. АГ. Кроме того, по результатам двухцентрового ИФА все эти 7 видов МКА, специфичные к структурным внутренним филовирусным белкам NP, VP40 и VP35, конкурируют с IgG лошадей, иммунизированных инфекциоными вирусами, за антигенные эпитопы вирусных и рек. белков. В связи с этим, показана ценность препаратов МКА при использовании их в качестве диагностических реагентов для выявления маркеров филовирусов.
Исследование иммунохимических свойств рек. белков NP, VP40 и VP35, полученных в результате экспрессии полноразмерных генов NP, VP35 и VP40 в клетках E.coli методами ИФА и ИБ, показало, что они антигенно схожи с нативными вирусными АГ и могут быть успешно применены для конструирования иммунодиагностических тест-систем в качестве положительного контроля на антиген.
Таблица 10
Данные по количеству пар МКА, исследованных в двухцентровом ИФА формата “сэндвич” для выявления антигенов вирусов Марбург и Эбола
Общее количество исследован-ных видов МКА
Коли-чество исследо-ванных
сочета-ний
пар
Количество пар МКА, выявляю-щих инактиви-рованный АГ
Количество пар МКА, выявляю-щих рекомбинант-ный VP40 ВМ (совпадающих
по выявлению
АГ ВМ)
Количество пар МКА, выявляющих рекомби-нантный VP35 ВМ (совпадаю-щих по выявлению АГ ВМ)
Количество пар МКА, выявляю-щих рекомби-нантный VP40 ВЭ (совпадаю-щих по выявлению АГ ВЭ)
Количество пар МКА, выявляю-
щих рекомби-нантный NP ВЭ
(совпадаю-щих по выявлению АГ ВЭ)
Из 16 видов МКА, специфич-ных к вирусу Марбург:
3 – к белку VP35;
9 - к белку VP40;
3 – к NP;
1 – NP (?)
224
74
33 (11)
5 (4)
-
-
Из 21 вид МКА, специфич-ных к вирусу Эбола:
2 – к белку VP35;
9 - к белку VP40;
10 – к NP
399
115
-
-
51 (17)
42 (14)
Рис. 12. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного нуклеопротеина парой МКА 1B2 и 7B11*
Примечания: исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7B11* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 9С7 и 5F11*, специфичных к NP ВМ; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Рис. 13. Титрование антигена вируса Эбола и рекомбинантного белка VP40
парой МКА 4А2 и 1С1*
Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1 мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 1C1* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 7D8 и 7Н10*, специфичные к белку VP40 ВМ; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторныхМКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Рис. 14. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP40 парой МКА 7D8 и 7H10*
Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 7H10* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали пару МКА 4A2 и 1C1*, специфичные к белку VP40 ВЭа; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином – 1 мкг/мл.
Рис. 15. Титрование антигена вируса Марбург и рекомбинантного белка VP35 парой МКА 3F9 и 3F9*
Примечания: Исходная концентрация препаратов антигенов по СФ 1мг/мл, первая точка титрования в разведении 1/400 соответствует концентрации 2500 нг/мл; 3F9* - индикаторные МКА меченные биотином; в качестве отрицательного контроля использовали захватывающие антиген МКА 1С7, специфичные к белку VP35 ВЭ; концентрация МКА для “захвата” антигенов – 10 мкг/мл; концентрация индикаторных МКА, меченных биотином - 1мкг/мл.
Применение МКА и антигенов в иммунодиагностике лихорадки Западного Нила
В серодиагностике ЛЗН используют метод ИФА для выявления специфических АТ ( и др., 2007; S. Feinstein et al., 1985; W. R. Hogrefe et al., 2004). Но выраженные перекрестные реакции между ВЗН и ВКЭ, ареалы которых в России перекрываются ( и др., 2000; и др., 2004; и др., 2006), затрудняют его иммунохимическую диагностику ( и др., 2007). Методы выявления вируса на культуре клеток москитов или Vero (I. Samina et al., 1986; K. A. Bernard et al., 2001; R. S Nasci. et al., 1999) или внутримозговым заражением новорожденных мышей (, 2000; I. Samina et al., 1986), а так же ПЦР для выявления вирусной РНК (, 2000; и др., 2004; и др., 2006; R. S. Lanciotti et al., 2000; G. L. Surtherland et al., 2007) требуют много времени и/или дороги.
Для наблюдения вирусной активности в естественных циклах передачи и предотвращения инфекции у людей Hunt A. R. и соавт. (2002) предлагают проводить выявление вирусного АГ методом ИФА в лабораториях, не имеющих оборудования для выполнения ПЦР. Для захвата антигена в этой системе использованы МКА, специфичные к южно-африканскому штамму ВЗН, полученные T. G. Besselaar и соавт. (1988), а для детекции - группоспецифические к флавивирусам МКА, конъюгированные с пероксидазой. Чувствительность выявления очищенного АГ ВЗН (штамм NY99) в этой системе составила 320 пг/мл, а в пуле лабораторно инфицированных москитов и мозговой суспензии мышей-сосунков 103-104 PFU/мл.
В России в настоящее время выпускается только одна коммерческая тест-система ИФА на основе ПАТ для выявления АГ ВЗН (, Московская область, г. Электрогорск).
Получение и характеризация МКА, специфичных к российскому штамму вируса Западного Нила (LEIV—VLhuman)
Для получения гибридом, продуцирующих МКА специфичные к структурным белкам ВЗН, было проведено 3 гибридизации и в результате наблюдения в световой микроскоп было выявлено 853 лунки с гибридами, размножающимися на селективной среде ГАТ. Из них 771 гибридная популяция была оценена в ТИФА и после 2-кратного тестирования было выявлено 119 позитивных популяций гибридом, растущих в лунках. Методом предельных разведений было проведено клонирование 75 гибридом. Заморожена позитивная популяция 32 гибридом. Выход позитивных клонов гибридом, после клонирования, составил 24 гибридомы. Позитивные клеточные линии, по данным ИФА, были размножены (1-3 клона) и заложены в жидкий азот на хранение.
Препаративные количества очищенных 15-ти видов МКА, полученные из асцитических жидкостей мышей с привитыми гибридомными клетками, тестировали методом ТИФА с использованием в качестве АГ очищенного ВЗН (штамм Vlg). Результаты анализа представлены в табл. 11. Все исследованные препараты содержали высокий уровень специфических МКА. Методом ИБ показана специфичность полученых МКА (рис. 16).
Проведенные ранее исследования показали, что эти МКА позволяют нейтрализовать семь штаммов ВЗН (LEIV-VLGhuman; LEIV-VLGhuman; LEIV-Turticks; LEIV-Az70-72-ticks; LEIV - Aznuthatch; Ast63-94-ticks; Eg101) на культуре клеток Vero (Razumov I. A., Каzachinskaia E. I. et al., 2005). Использование РНК из мышиных гибридом, продуцирующих самые активные МКА 9Е2, позволило создать нашим коллегам в США химерную конструкцию МКА мышь/IgG1 человека, способную к протективному действию у мышей, зараженных американским штаммом NY-99 (A. Pereboev et al., 2008).
Таблица 11
Свойства МКА, специфичных к вирусу Западного Нила
№ п/п
МКА
Белок-мишень
в ИБ
Субтип IgG
Титр МКА в ТИФА
Концентрация очищенных МКА (мг/мл)
В асцитных жидкостях
В очищенных препаратах
1
9Е2
Е (53 кДа)
IgG1
>
14,3
2
5Н6
н. о.
IgG1
729000
656100
6,0
3
4D10
н. о.
IgG1
243000
72900
7,0
4
7E6
Е (53 кДа)
IgG3
243000
243000
8,3
5
5F11
67 кДа
IgG3
243000
243000
8,9
6
11G3
Е (53 кДа)
IgG3
729000
810000
5,0
7
7B9
Е (53 кДа)
IgG2b
729000
729000
6,3
8
3A9
Е (53 кДа)
IgG1
72900
72900
4,5
9
5F7
н. о.
IgG1
72900
24300
1,7
10
4F11
Е (53 кДа)
IgG3
243000
243000
5,7
11
3F4
Е (53 кДа)
IgG2b
656100
656100
6,5
12
1B7
Е (53 кДа)
IgG3
656100
243000
4,5
13
2G12
Е (53 кДа)
IgG3
24300
24300
2,5
14
7G9
Е (53 кДа)
IgG3
>
2430000
13,5
15
7B2
Е (53 кДа)
IgG1
24300
24300
2,5
16
АС мыши*
Е (53 кДа); 67 кДа
все
729000
2430000
н. о.
17
АС здоровой мыши
<100
<100
н. о.
Примечания: в качестве АГ в ТИФА использован очищенный препарат ВЗН (штамм Vlg); * сыворотка мышей, клетки селезенки которых были взяты для гибридизации; н. о. – не определяется.
Рис. 16. Иммуноблоттинг.
Исследования белков
очищенного вируса Западного Нила (штамм Vlg) с применением:
1 - сыворотки мышей, иммунизированных инфекционным вирусом;
2, 3, 4 – сывороток мышей, иммуннизированных
инактивированным вирусным препаратом,
селезенки которых были взяты в гибридизацию;
5 – 10 – очищенных препарататов МКА 9Е2,7G9, 11G3,
7F9 и 7B9, соответственно;
11, 12 - очищенных препаратов МКА 5H6 и 4D10.
Справа приведены обозначения молекулярной массы
по маркерам (Life technology).
Все антитела использовали в разведении (1/1000); cтрелками показаны белки вирусного препарата.
Изучение антигенных свойств препаратов ВЗН с применением МКА
МКА были получены при иммунизации мышей-доноров иммунных спленоцитов очищенным вирусным препаратом из мозговой ткани инфицированных ВЗН мышей-сосунков.
Приготовление очищенного АГ трудоемкий и затратный процесс, так на приготовление 1 мг АГ было использовано 40 животных. Чтобы исключить наработку вирусного препарата на инфицированных животных, для дальнейших исследований использовали концентрированный АГ из инфицированных клеток Vero. С монослоя инфицированных клеток Vero (до появления явного ЦПД вируса в виде лизиса инфицированных клеток) удаляли поддерживающую среду, а клеточный дебрис в небольшом объеме среды без сыворотки осаждали низкоскоростным центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок клеток в объеме 1 мл среды без сыворотки обрабатывали ультразвуком при 50 Вт в течение 30 секунд на тающем льду. Лизат клеток освобождали от осадка клеточных мембран центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. К аликвотам полученного лизата клеток или очищенного вирусного препарата добавляли 50 % глицерина и 1 % Nonidet P40. Супернатанты для учета инфекционного титра вируса на культуре клеток Vero получали центрифугированием (при 10000 об/мин, 4 0С) трехкратно замороженной и размороженной среды вместе с клетками, после наблюдаемого не менее 80 % ЦПД вируса на монослой зараженных клеток. Работа с инфекционным ВЗН проводилась в изолирующем боксе, так как он относится к агентам II группы патогенности по биобезопасности.
Оценку эффективности взаимодействия МКА с белками очищенного и неочищенного АГ проводили методами ТИФА и ИБ. Результаты титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток Vero в ТИФА с МКА 9Е2 приведены на рис. 17. В лизате инфицированных клеток белок Е выявляется методом ИБ с МКА без фоновых полос, так же как и в очищенном вирусном препарате (рис. 18). МКА, специфичные к ВЗН не выявляли этот белок в препаратах ВКЭ и ВЯЭ.
Данные ИБ и данные титрования очищенного вируса и лизата инфицированных клеток в ТИФА свидетельствуют о высокой специфичности МКА к белку Е и возможности использования неочищенного вирусного препарата в качестве положительного контроля на АГ. Высокий уровень урожая вируса при наработке на культуре клеток Vero позволяет не использовать животных.
Рис. 17. Титрование вирусных препаратов в ТИФА с МКА 9Е2
Примечания: ВЗН – вирус Западного Нила;ВКЭ – вирус клещевого энцефалита; ВЯЭ – вирус японского энцефалита.
Рис. 18. Иммуноблоттинг препаратов
вируса Западного Нила с МКА 9Е2
1. очищенный, концентрированный вирусный
препарат в градиентах 30 % глицерина – 40 %
тартрата калия - натрия, приготовленный из гомогената мозга мышей,
2. инфицированных ВЗН (штамм LEIV-VLGhuman); лизат клеток Vero, инфицированных ВЗН
(штамм Eg101);
3. лизат не инфицированных клеток Vero;
4. очищенный, концентрированный препарат ВКЭ;
5. очищенный, концентрированный препарат ВКЭ.
Все полоски мембраны обработаны очищенными МКА 9Е2 в разведении (1/500).
Выбор пар МКА для эффективного выявления антигена ВЗН
Оценку конкуренции МКА за эпитопы белка Е проводили в двухцентровом ИФА формата “сэндвич”. На очищенные для “захвата” АГ МКА, сорбированные на полистироловую поверхность микропланшета наносили вирусный препарат и затем вторые МКА меченные биотином (индикаторные). После отмывки выявляли связанную биотиновую метку конъюгатом стрептавидина с пероксидазой. Результаты представлены в табл. 12. Выявлено несколько пар МКА специфичных к удаленным друг от друга эпитопам и не конкурирующих между собой за места связывания с АГ: 9Е2+5Н6*; 9Е2+7G9*; 5H6+7G9*; 5H6+7E6*; 7E6+5H6*; 7E6+7G9* (звездочками обозначены индикаторные антитела). По результатам титрования АГ разными парами МКА, наиболее перспективной для использования в иммунохимических тестах представлялась пара МКА 9Е2+5Н6*, которая и была использована в дальнейших экспериментах.
Иммунохимическое выявление вируса Западного Нила в биопробах
С использованием пары МКА (9Е2 для захвата АГ и 5Н6, связанных с биотином для детекции и конъюгата стрептавидина с пероксидазой) исследован ряд вируссодержащих субстанций с целью оценки эффективности данных АТ для выявления АГ ВЗН. На рис. 19 представлены результаты выявления очищенного антигена и лизата инфицированных клеток. Очищенный АГ ВЗН (с концентрацией по белку 1 мг/мл) эта система достоверно определяет в разведении 1/51200. Таким образом, лимит выявления АГ составляет 1 - 2 нг/мл. Выбранная пара МКА позволяет выявлять в ростовой среде инфицированных клеток Vero вирусный АГ семи исследованных штаммов ВЗН, выделенных от разных хозяев – людей, птиц и нескольких видов клещей в разное время (рис. 20).
Для оценки эффективности обнаружения АГ ВЗН в биопробах от животных была моделирована ЛЗН (штамм Египет-101) на белых беспородных мышах при внурибрюшинном заражении, как описано и соавт. (2007). Биологический материал забирали в разгар заболевания (активность резко снижена, шерсть взъерошена, живот асцитный, паралич задних конечностей). Животным под эфирным наркозом проводили декапитацию и забор биологического материала проводили с соблюдением требований инструкций, разработанных для работы с вирусами II группы патогенности и правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Из крови получали сыворотку, а из органов готовили 10 %-е гомогенаты мозга, печени, селезенки, почек, легкого и сердца. В качестве положительного контроля на АГ использовали ростовую среду от инфицированных клеток Vero. Результаты представлены на рис. 21. По данным титрования было выявлено, что в цельной крови АГ практически не обнаруживается, а наибольшее его количество сконцентрировано в мозговой ткани и клетках печени. В клетках сердца, селезенки, почек и легкого мышей ВЗН так же продуктивно реплицируется, что говорит широком диапазоне его тропности.
На основании этих данных совместно с ЗАО “Вектор-Бест” была разработана экспериментальная тест-система “ВектоНил-антиген”. Для “захвата” АГ использовались иммобилизованные высокоспецифичные МКА 9Е2, а в качестве конъюгата применялись меченые пероксидазой хрена МКА 5Н6. Сотрудниками лаборатории ООИ ФГУЗ «ЦГиЭ в Волгоградской области» были проведены полевые испытания этой тест-системы. Результаты представлены в табл. 13. Было исследовано 264 пробы из внешней среды на наличие антигена АГ ВЗН, в том числе суспензии из органов 62-х птиц (видовой состав – грачи, вороны, дрозды), 114 комаров (рода Aedes, Culex, Anopheles); 36 клещей (виды H. Morginatum и D. Reticulatum), органов 52–х мелких мышевидных грызунов. Положительный результат на АГ был получен в 15 пробах (5,6 %): комаров –,2 %) и клещей – 1 (2,7 %). Комары рода Aedes и Culex пойманы в Камышинском районе Волгоградской области и г. Волгограде. Клещ H. morginatum был снят с грача (Октябрьский район Волгоградской области).
Таким образом, разработанная на основе двух видов МКА, тест-система “ВектоНил-антиген”, может применяться при проведении эпидемиологических исследований на присутствие АГ ВЗН в биологических образцах, собранных в природе.
Таблица 12
Результаты оценки МКА, специфичных к разным эпитопам белка Е вируса Западного Нила методом двухцентрового ИФА в формате “сэндвич”
№
МКА захвата
Индикаторные МКА, меченные биотином
9Е2
5Н6
4D10
7E6
5F11
11G3
4F11
3F4
7G9
1
9Е2
0,23
3,83
0,56
0,84
0,66
0,06
0,78
0,60
2,51
2
5Н6
0,55
0,80
2,53
2,72
3,17
0,99
0,94
0,89
3,09
3
4D10
0,04
0,48
0,62
0,03
1.03
0,06
0,66
0,61
0,54
4
7E6
0,01
3,57
0,65
0,19
0,86
0,04
0,79
0,67
3,20
5
5F11
0,05
0,43
0,70
0,01
0,97
0,03
0,51
0,64
0,45
6
11G3
0,01
0,43
0,84
0,05
1,45
0,04
0,62
0,52
0,38
7
7B9
0,01
0,29
0,94
0,01
1,64
0,02
0,44
0,51
0,27
8
3A9
0,01
0,41
1,64
0,09
3,30
0,05
0,79
0,49
0,33
9
5F7
0,09
0,24
1,19
0,06
2,60
0,03
0,42
0,70
0,47
10
4F11
0,08
0,19
1,53
0,09
2,80
0,07
0,38
0,53
0,31
11
3F4
0,09
0,27
1,33
0,09
2,63
0,07
0,43
0,53
0,33
12
1B7
0,10
0,09
0,43
0,09
0,62
0,05
0,39
0,54
0,21
13
2G12
0,08
0,08
0,52
0,09
0,62
0,05
0,39
0,54
0,21
14
7G9
0,06
0,99
1,04
0,24
1,62
0,02
0,52
0,57
0,81
15
7B2
0,07
0,11
0,71
0,05
1,19
0,05
0,48
0,52
0,29
16
АС мыши*
0,16
1,49
1,50
0,79
2,71
0,21
0,67
0,62
1,88
17
контроли
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
<0,1
Примечание: В качестве антигена использован лизат клеток Vero инфицированных ВЗН (штамм Eгипет-101); МКА для сорбции в ячейках планшета использовали в концентрации 10 мкг/мл; ндикаторные МКА использовали в концентрации 1 мкг/мл; жирным шрифтом выделены результаты для неконкурирующих МКА, т. е. активно “захватывающих” АГ; АС мыши* - сыворотка мыши, иммунизированной инфекционным вирусом. В качестве отрицательных контролей использовали лизат не инфицированных клеток Vero и очищенные препараты вирусов клещевого и японского энцефалитов.
Рис. 19. Результаты исследования серий двукратных разведений вирусных препаратов в двухцентровом ИФА с использованием пары МКА 9Е2 для захвата и 5Н6 для детекции
Рис. 20. Титрование антигена в вируссодержащей ростовой среде от инфицированных клеток Vero в двухцентровом ИФА парой МКА 9Е2 и 5Н6*
Примечания: стрелками обозначен диапазон чувствительности ИФА при сравнении инфекционного титра вируса в супернатантах при параллельном их титровании на культуре клеток Vero. Разведение супернтанта (-3) соответствует в данном эксперименте 100 ТЦД50/100 мкл; Eg -101 – штамм Египет 101, выделен в 1951г. в Египте из сыворотки больного ребенка; Hp-94 – штамм Ast63-94-ticks, выделен в 1963 г. из клещей Hyalomma marginatum в дельте Волги (Астраханская область); Vlg-27924 – штамм LEIV-VLGhuman, выделен в 2000 г. в г. Волгограде из мозга человека 74 лет, погибшего от ЛЗН; А-72 – штамм LEIV-Az70-72-ticks, выделен в 1970 г. из клещей Ornithodoros capensis в Азербайджане; Vlg-27889 – штамм LEIV-VLGhuman, выделен в 1999 г. в г. Волгограде из мозга человека 15 лет, погибшего от ЛЗН; А-1640 – штамм LEIV-Aznuthatch, выделен в 1967 г. из мозга птицы Sitta europaea в Азербайджане; Tur-2914- штамм LEIV-Turticks, выделен в 1973 г. из клещей Hyalomma detritum в Туркмении.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
