На правах рукописи
ПОПОВ
Сергей Владимирович
Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях экспериментального перитонита
03.01.04 – Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Челябинск - 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель: | доктор биологических наук, профессор
|
Официальные оппоненты: | заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России
|
доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры» Минспорттуризма России
|
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени » Минздрава России.
Защита состоится «____»_________2013г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации ( 4).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии
Автореферат разослан "____" ____________ 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
Согласно современным представлениям при септическом перитоните часто происходит делокализация воспалительного очага, что сопровождается интоксикацией, развитием SIRS - синдрома и генерализацией воспалительного процесса (Weinert C., Meller W., 2007; Boer R. et al., 2008; , 2010). Проявления системного воспаления могут быть в значительной степени модифицированы хроническим стрессом (Handa et al., 2008).
Ранее было показано, что предварительные ежедневные эпизоды одночасового иммобилизационного стресса влияют на процессы свободно-радикального окисления, как в воспалительном очаге, так и во внутренних органах при септическом перитоните (, 2011). Однако использованная в этом исследовании экспериментальная модель стресса не воспроизводит состояние длительного ограничения двигательной активности. Можно предположить, что длительная гипокинезия оказывает значительное влияние на динамику системного воспаления. Поэтому клинические проявления системного воспаления у больных, длительное время находящихся на строгом постельном режиме (тяжелые травмы, патология центральной и периферической нервной системы, кома различной этиологии), зачастую модифицированы, что значительно затрудняет их своевременное выявление и лечение (Hunter J. D., Doddi M., 2010). Кроме того, развитие сепсиса, как осложнения перитонита, приводит к ограничению двигательной активности, что отражено в термине «гиподинамическая фаза сепсиса» (Yang S. L. et al., 1997).
Вместе с тем, изменение динамики системного воспалительного процесса в условиях хронического стресса во многом реализуется за счет влияния на процессы свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и во внутренних органах (Zhu H., Li Y. R., 2012). Имеются данные о причастности процессов свободно-радикального окисления к развитию осложнений при воспалительной патологии (Zhang R. et al., 2002). Известно, что с усилением свободно-радикального окисления во внутренних органах связано развитие полиорганной недостаточности (, 1999).
К сожалению, остаётся не исследованным влияние предварительной гипокинезии на особенности свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и во внутренних органах при экспериментальном септическом перитоните.
Цель работы:
Установить особенности модифицирующего влияния 30 - суточной гипокинезии на уровень липопероксидации и карбонилирования белков в очаге воспаления, органах системы крови, печени и головном мозге при экспериментальном перитоните.
Задачи исследования:
1. Определить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии и ложной операции.
2. Определить особенности свободно-радикального окисления в органах системы крови, печени и головном мозге животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии и ложной операции.
3. Исследовать особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при экспериментальном септическом перитоните.
4. Изучить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при септическом перитоните, воспроизводимом на фоне 30 - суточной гипокинезии.
5. Изучить состояние свободно-радикального окисления в головном мозге и печени в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.
6. Изучить состояние свободно-радикального окисления в органах системы крови в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.
Научная новизна
Впервые установлено, что 30 - суточная гипокинезия сопровождается увеличением содержания гептанофильных продуктов ПОЛ при неизменном уровне окислительной модификации белков в перитонеальных смывах. Установлено, что хирургический стресс, осуществляемый на фоне 30 - суточной гипокинезии, приводит к приросту содержания продуктов ПОЛ не только в перитонеальных смывах, но и в тимусе, селезенке и печени. Установлено, что при септическом перитоните угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов ассоциируется со снижением липопероксидации и усилением карбонилирования белков в перитонеальных смывах. Установлено, что предварительное воздействие 30 - суточной гипокинезии усугубляет окислительную деструкцию белков в перитонеальных смывах, вызванную септическим перитонитом. Обнаружено, что при септическом перитоните соотношение между липопероксидацией и окислением белков имеет органоспецифический характер: в тимусе усилилось ПОЛ при снижении ОМБ, в селезенке наоборот снижение ПОЛ и усиление ОМБ. В костном мозге усиление ПОЛ. Увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге сопряжено с увеличением активности церебральной МАО-Б. Септический перитонит на фоне гипокинезии сопровождается приростом содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в головном мозге.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты уточняют свободно-радикальные механизмы развития воспалительных осложнений в условиях длительного ограничения двигательной активности. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых путей фармакологической коррекции септического перитонита, предусматривающих использование антиоксидантов. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России.
Положения, выносимые на защиту:
1. Длительное ограничение двигательной активности приводит к усилению свободно-радикального окисления в брюшине и вызывает органо-специфичные изменения свободно-радикального окисления во внутренних органах.
2. Предварительная гипокинезия усугубляет снижение липопероксидации и повышение карбонилирования белков в брюшине, вызванные септическим перитонитом, усиливая при этом нейтрофильную инфильтрацию воспалительного очага.
3. Предварительная гипокинезия модифицирует соотношение между липопероксидацией и карбонилированием белков во внутренних органах при септическом перитоните.
Апробация работы
Основные положения работы изложены и представлены на 2nd European congress of Immunology «Immunity for life Immunology for health» (Berlin, 2009); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора (Челябинск, 2009); на XXXVI International Congress of Physiological Sciences (IUPS2009) Function of Life: Elements and Integration (Kyoto, Japan, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 – в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Уральской медицинской академической науки).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 220 источников: 102 – на русском языке и 118 – иностранных. Работа содержит 10 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование изучаемых состояний
Исследование выполнено на 210 беспородных лабораторных крысах обоего пола. Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре на стандартной диете.
Гипокинетический стресс моделировали путём помещения крыс в специальные клетки-пеналы, ограничивающие подвижность животных, при свободном доступе к пище и воде. Применялась 30-суточная модель гипокинетического стресса (, , 1980; В., 1984; , 1990; Миллер E., Mrowicka M., 2007).
Для создания экспериментального перитонита нами использована модель лигирования и последующего однократного пунктирования слепой кишки – cecal ligation and perforation (CLP) (Wichterman K. A., 1980).
Биохимические методы
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике и др. (1989). Содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов, определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ производили спектрофотометрическим методом по с соавт. (1998). Окислительную модификацию белков оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов по методу (1995). Активность моноаминоксидазы - Б в гомогенатах органов определяли спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстрата солянокислый бензиламин (, 1991).
Гематологические и иммунологические методы
Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (, , 1992). Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза. Кариоциты костного мозга и лимфоидных органов (также как и лейкоциты крови) подсчитывали в камере Горяева после ресуспендирования в 0,1% растворе метиленового синего в 3% уксусной кислоте. Изучение способности нейтрофилов к захвату частиц проводили на модели поглощения частиц латекса (, , 1990) и контрольных штаммов микроорганизмов. Исследование внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов осуществлялось при помощи НСТ-теста. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (, 1998). Раздел работы по изучению внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов выполнен совместно со старшим преподавателем кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития, к. м.н. .
Статистический анализ результатов
Для обработки результатов исследований использовали пакет прикладных программ “Statistica 6.0 for Windows”. Статистически значимые различия между несколькими группами определялись с помощью критерия Краскелла-Уолиса (Kruskal-Wallis). Для определения статистически значимых различий между двумя сравниваемыми группами использовали критерии Манна-Уитни (U). Различия считали значимыми при р£0,05. Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (Rs) и Кенделлу (rk).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах при 30 - суточной гипокинезии
После завершения 30 - суточной гипокинезии (ГК30) наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов, Шиффовых оснований, а также вторичных изопропанол-растворимых продуктов перекисного окисления липидов в перитонеальных смывах животных (таблица 1).
Таблица 1
Влияние 30 - суточной гипокинезии на свободно - радикальное окисление в перитонеальных смывах
Показатель | Контроль (n=8) | ГК30 (n=12) |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. | 0,685±0,14 | 0,735±0,19 |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и. | 0,111±0,01 | 0,127±0,02 P=0,017U |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и. | 0,013±0,02 | 0,026±0,002 P=0,014U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,798±0,015 | 0,822±0,04 |
Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,146±0,03 | 0,189±0,03 P=0,014U |
Шиффовы основания изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,039±0,02 | 0,082±0,022 |
Окислительная модификация белка мкмоль/г белка | 0,805±0,023 | 0,668±0,034 |
Примечание: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400/Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
После завершения ГК30 в вилочковой железе наблюдалось увеличение содержания гептан - растворимых диеновых конъюгатов (таблица 2).
Таблица 2
Влияние 30 - суточной гипокинезии на свободно - радикальное окисление во внутренних органах
Показатель | Контроль (n=8) | ГК30 (n=12) |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. Тимус | 0,908±0,07 | 0,979±0,068 P=0,015U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и. Головной мозг | 0,896±0,08 | 0,882±0,1 P=0,022U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкмоль /г белка Селезёнка | 70,91±3,48 | 81,93±1,13 P=0,021U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкмоль /г белка Печень | 66,31±4,32 | 48,08±2,11 P=0,017U |
Окислительная модификация белка мкмоль/г белка Костный мозг | 4,41±0,51 | 2,58±0,35 P=0,017U |
Примечание: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
Для головного мозга характерно снижение содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. В селезёнке наблюдалось увеличение уровня Fe+2/H2O2 - индуцированного карбонилирования белков. Для печени, напротив, характерно снижение Fe+2/H2O2 - индуцированного карбонилирования белков. В костном мозге обнаружено снижение базального уровня карбонилирования белков. Таким образом, для ГК30 изменения уровня свободно-радикального окисления имеют органо-специфичный характер.
Установлено, что 30-суточная гипокинезия (ГК30) сопровождалась появлением нейтрофилов в перитонеальных смывах (количество нейтрофилов составило 3,4±0,01 х109/л, Р=0,033U). В цитологических препаратах контрольных животных не обнаружена эта разновидность лейкоцитарных клеток. При этом отмечено увеличение спонтанного (с 37,85±2,78 до 68,3±3,44%, P=0,017U) и индуцированного (с 39,42±1,37 до 55,2±2,97%, P=0,017U) НСТ - теста при одновременном снижении активности фагоцитоза (с 44,57±3,33 до 21,1±1,97%, P=0,017U).
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах ложнооперированных животных
У ложнооперированных животных, как и при гипокинезии, в перитонеальных смывах зарегистрировано статистически значимое увеличение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряжённых триенов, а также Шиффовых оснований. При этом содержание изопропанол - растворимых продуктов ПОЛ не претерпело статистически значимых изменений (таблица 3).
В перитонеальных смывах ложнооперированных животных наблюдалось снижение базального уровня окислительной модификации белка при увеличении уровня окислительной модификации белка в ответ на индукцию Fe2+ / Н2О2.
Таким образом, ложная операция характеризовалась реципрокными отношениями между перекисным окислением липидов и карбонилированием белков в перитонеальных смывах.
Таблица 3
Влияние процедуры ложной операции на свободно-радикальное окисление в перитонеальных смывах
Показатель | Контроль (n=8) | Ложная операция (n=12) |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. | 0,685±0,09 | 0,765±0,02 Р=0,027U |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и. | 0,113±,0,004 | 0,154±0,01 Р=0,027U |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и. | 0,013±0,006 | 0,0843±0,02 Р=0,027U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,798±0,059 | 0,777±0,015 |
Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,148±0,03 | 0,141±0,03 |
Шиффовы основания изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,039±0,005 | 0,035±0,002 |
Окислительная модификация белка мкмоль /г белка | 0,551±0,62 | 0,191±0,391 Р=0,034U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкмоль /г белка | 2,55±10,23 | 3,22±0,618 Р=0,034U |
Примечание: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В большинстве исследованных органов ложнооперированных животных наблюдалось изменение значений различных показателей свободно-радикального окисления (таблица 4).
Таблица 4
Влияние процедуры ложной операции на свободно-радикальное окисление во внутренних органах животных
Показатель | Контроль (n=8) | Ложная операция (n=12) |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и., Тимус | 0,900±0,08 | 1,005±0,08 Р=0,016U |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. , Костный мозг | 0,692±0,03 | 0,724±0,04 Р=0,023U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е. о.и.,Костный мозг | 2,355±0,074 | 2,12±0,08 Р=0,023U |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и., Печень | 0,542±0,04 | 0,515±0,048 Р=0,016U |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и., Печень | 0,29±0,009 | 0,515±0,048 Р=0,016U |
Шиффовы основания изопропанольная фаза, е. о.и,Печень | 0,079±0,005 | 0,033±0,002 Р=0,016U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е. о.и., Печень | 1,119±0,101 | 0,716±0,096 Р=0,015U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус | 1,25±0,102 | 2,48±0,98 Р=0,016U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Костный мозг | 3,96±3,47 | 11,35±0,976 Р=0,006U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка | 3,81±0,533 | 2,34±0,352 Р=0,016 U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Печень | 5,92±0,43 | 2,25±0,38 Р=0,016U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка, Печень | 18,81±2,95 | 9,41±3,03 Р=0,016U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг | 0,572±0,063 | 0,382±0,028 Р=0,037U |
Примечания: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В селезёнке отмечено снижение содержания карбонилированных белков. В тимусе и в костном мозге наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также карбонилированных белков. Таким образом, в этих органах развитие операционного стресса сопровождалось усилением свободно-радикального окисления.
Для печени характерно снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов, при одновременном снижении уровня изопропанол-растворимых Шиффовых оснований. Кроме того, в органе наблюдалось снижение содержания уровня Fe+2 / H2O2 - индуцированного карбонилирования белков.
В головном мозге ложнооперированных животных наблюдалось статистически значимое ограничение ОМБ по сравнению с контролем (таблица 4).
Полученные результаты свидетельствуют об органо-специфичных изменениях свободно-радикального окисления при ложной операции, что отражает особенности хирургического стресса. Поэтому активация ПОЛ в брюшине, а также в тимусе, костном мозге может быть связана со стрессорными гормонами. Усиление карбонилирования белков в тимусе и в костном мозге может быть связано с глюкокортикоид - зависимой активацией протеолиза.
У ложнооперированных животных, как и при гипокинезии, в перитонеальных смывах зарегистрировано появление нейтрофильных гранулоцитов (до 9,3±4,19 % от общего количества лейкоцитов, Р=0,014U). Уместно обратить внимание на положительную корреляционную зависимость между количеством нейтрофилов, инфильтрировавших брюшину, и уровнем гептан - растворимых Шиффовых оснований (Rs=0,576; P=0,034). Отмечено увеличение показателей спонтанного (с 37,85±2,78 до 63,75±3,29, Р=0,014U) и индуцированного (с 39,42±1,37 до 63,75±4,28, Р=0,014U) НСТ-теста при одновременном снижении активности фагоцитоза (с 44,57±3,33 до 29,12±3,16, Р=0,014U).
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и во внутренних органах при ложной операции на фоне длительного ограничения двигательной активности
Установлено, что ложная операция на фоне 30 - суточной гипокинезии характеризовалась увеличением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в перитонеальных смывах. Одновременно повышалась устойчивость к Fe+2/H2О2 - индуцированному карбонилированию белков (таблица 5).
Операционный стресс после ГК30 привёл к усилению липопероксидации при одновременном снижении карбонилирования белков в вилочковой железе (таблица 5).
Усиление ПОЛ в тимусе проявлялось в повышении содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ.
Таблица 5
Влияние предварительной гипокинезии на липопероксидацию и карбонилирование белков в перитонеальных смывах и внутренних органах при ложной операции
Показатель | Ложная операция (n=8) | ГК30 + Ложная операция (n=8) |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и., Перитонеальные смывы | 0,777±0,072 | 0,826±0,084 Р=0,028U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка, Перитонеальные смывы | 2,25±0,201 | 1,66±0,12 Р=0,032U |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и., Тимус | 1,005±0,07 | 1,019±0,068 Р=0,017U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е. о.и., Костный мозг | 2,12±0,007 | 2,34±0,004 Р=0,015U |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и., Селезенка | 0,588±0,058 | 0,657±0,058 Р=0,042U |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и. Селезенка | 0,012±0,009 | 0,015±0,005 Р=0,025U |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и., Селезенка | 0,008±0,002 | 0,018±0,005 Р=0,016U |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и., Печень | 0,515±0,022 | 0,536±0,01 Р=0,017U |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и., Печень | 0,174±0,0041 | 0,22±0,03 Р=0,024U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус | 0,249±0,008 | 0,141±0,006 Р=0,018U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Костный мозг | 1,13±0,11 | 2,3±0,05 Р=0,027U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка | 1,922±0,321 | 2,268±0,98 Р=0,042U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка, Селезенка | 6,602±1,245 | 7,477±2,123 Р=0,045U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг | 0,215±0,04 | 0,208±0,05 Р=0,009U |
Примечания: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
Активация свободно-радикального окисления в селезёнке проявлялась в увеличении содержания всех категорий гептан-растворимых продуктов ПОЛ, а также повышения содержания карбонилированных белков. В костном мозге, в отличие от селезёнки, наблюдалось снижение карбонилирования белков.
В печени животных, подвергнутых ложной операции после ГК30 наблюдалось увеличение содержания неполярных продуктов ПОЛ. В головном мозге (таблица 5), отмечено снижение содержания карбонилированных белков на базальном уровне.
Таким образом, осуществляемый после завершения ГК30 операционный стресс характеризовался увеличением содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ во внутренних органах и органо - специфичным изменением уровня карбонилирования белков.
Ложная операция на фоне 30 - суточной гипокинезии характеризовалась уменьшением количества нейтрофилов в перитонеальных смывах (с 9,3±1,19% в группе «ложная операция» до 3,6±0,31% в группе «ГК30 + ложная операция», P=0,044U), при неизменной функциональной активности. Отмечено наличие положительной корреляционной зависимости между уровнем изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов и количеством нейтрофилов в перитонеальных смывах (Rs=0,745; P=0,018).
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах при CLP - перитоните
В перитонеальном экссудате животных с CLP - перитонитом наблюдалось снижение содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ при одновременном увеличении содержания изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов, а также базального уровня окислительно модифицированных белков и уровня Fe+2/H2O2 индуцированного карбонилирования (таблица 6).
В исследованных внутренних органах специфично менялось соотношение между липопероксидацией и окислением белков (таблица 7).
Так, в вилочковой железе наблюдалось снижение содержания гептан - растворимых диеновых конъюгатов при одновременном увеличении содержания диеновых конъюгатов в изопропанольной фазе. В тимусе также снижался уровень карбонилированных белков.
Для селезёнки характерно увеличение содержания карбонилированных белков и гептан-растворимых Шиффовых оснований. Для костного мозга характерно снижение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований на фоне увеличения уровня Fe+2/аскорбат индуцированного ПОЛ. Таким образом, среди иммунных органов наиболее эффективной антиоксидантной защитой при CLP - перитоните обладает костный мозг.
Таблица 6
Содержание продуктов липопероксидации и карбонилирования белков в перитонеальных смывах при CLP – перитоните
Показатель | Ложная операция (n=8) | Перитонит (n=12) |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. | 0,765±0,04 | 0,691±0,09 P=0,014U |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и. | 0,154±0,01 | 0,113±0,02 P=0,027U |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и. | 0,084±0,02 | 0,016±0,002 P=0,014U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и. | 0,778±0,015 | 0,812±0,04 P=0,027U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка | 0,584±0,023 | 0,999±0,054 P=0,044U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка | 7,17±0,201 | 7,37±0,201 P=0,022U |
Примечания: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В печени по сравнению с ложнооперированными животными было обнаружено увеличение уровня Fe+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ. Кроме того, в органе снижалось содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов и увеличилось содержание гептан-растворимых диеновых конъюгатов (таблица 7).
Одновременно снижалась активность печёночной МАО-Б с 3,92±0,48 нМ / мг белка / мин (n=9) до 1,42 ±0,21нМ / мг белка / мин (n=9;P=0,021U). В связи с этим интересно отметить положительную корреляционную связь между активностью МАО-Б и содержанием изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов (Rs=0,714; P=0,023).
При экспериментальном перитоните по сравнению с ложнооперированными животными наблюдалось увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге в ответ на индукцию в системе Фэнтона. Кроме того, по сравнению с ложнооперированными животными снижалось содержание общего белка в органе. Это даёт основание предполагать, что усиленное карбонилирование белков является механизмом активации протеолитических процессов в органе. Усилению карбонилирования белков в органе сопутствовало увеличение активности церебральной МАО-Б. В связи с этим заслуживают внимания положительные корреляционные зависимости между содержанием карбонилированных белков и уровнем активности церебральной МАО-Б (Rs=0,639; P=0,025).
Таблица 7
Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков во внутренних органах при CLP - перитоните
Показатель | Ложная операция (n=9) | Перитонит (n=9) |
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и., Тимус | 0,900±0,07 | 0,975±0,101 Р=0,027U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и., Тимус | 0,851±0,072 | 1,07±0,085 Р=0,028U |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и., Селезенка | 0,08±0,004 | 0,025±0,007 Р=0,026 U |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и., Костный мозг | 0,031±0,009 | 0,019±0,002 Р=0,017U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е. о.и., Костный мозг | 0,956±0,087 | 1,98±0,11 Р=0,017U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и., Головной мозг | 0,730±0,061 | 2,94±0,191 Р=0,02WW |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е. о.и., Головной мозг | 1,037±0,92 | 0,906±0,102 Р=0,027WW |
Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е. о.и., Головной мозг | 1,243±0,154 | 0,875±0,081 Р=0,017U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е. о.и., Печень | 0,612±0,043 | 0,56±0,024 Р=0,026 U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е. о.и., Печень | 1,588±0,12 | 1,96±0,098 Р=0,026 U |
Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е. о.и., Печень | 6,15±0,36 | 8,64±0,42 Р=0,026 U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус | 0,2496±0,098 | 0,1981±0,012 Р=0,027 WW |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка | 1,9±3,321 | 2,47±1,12 Р=0,017U |
Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг | 0,157±0,014 | 0,345±0,029 Р=0,044U |
Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / H2O2), мкМ/г белка, Головной мозг | 3,294±2,28 | 6,69±3,123 Р=0,044U |
Примечания: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В перитонеальном экссудате животных с CLP - перитонитом наблюдалось увеличение содержания нейтрофилов до 38,6±9,31 %, P=0,014U (в сравнении с группой «ложная операция»). Прирост содержания нейтрофилов сопровождался снижением их фагоцитарного числа (с 0,96±0,15 до 0,651±0,04, P=0,038 U).
Влияние предварительной гипокинезии на свободно-радикальное окисление в перитонеальных смывах и во внутренних органах при септическом перитоните
CLP – перитонит, воспроизводимый после завершения ГК30, характеризовался относительным снижением содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований и увеличением окислительной модификации белка в перитонеальных смывах (таблица 8).
Таблица 8
Свободнорадикальное окисление в перитонеальных смывах
при CLP – перитоните, воспроизводимом на фоне гипокинезии
Показатель | 1 Ложная перация (n=8) | 2 Перитонит (n=12) | 3 ГК30 +Перитонит (n=12) |
Шиффовы основания гептановая фаза, е. о.и. | 0,084±0,02 | 0,016±0,002 P1,2=0,014U | 0,008±0,0003 P2,3=0,024U |
Окислительная модификация белка, мкМ/г белка | 0,147±0,023 | 0,491±0,034 P1,2=0,044U | 1,22±0,072 P2,3=0,044U |
Примечания: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
При этом снижается уровень липопероксидации в печени, что проявляется в более низком уровне гептан-растворимых диеновых конъюгатов. В костном мозге снижено содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Одновременно наблюдалось увеличение эффективности антиоксидантной защиты костного мозга. Так, в группе «ГК30+перитонит» отмечен более высокий уровень Fe+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ, что свидетельствует об увеличении окисляемости ацильных радикалов в полярных липидных фракциях (таблица 9).
В головном мозге, напротив, в группе «ГК30+перитонит» повышено содержание вторичных гептан-растворимых продуктов ПОЛ. В тимусе повышено содержание как гептан-растворимых диеновых конъюгатов, так и изопропанол - растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов. В селезёнке также повышено содержание гептан-растворимых диеновых конъюгатов (таблица 9).
Таблица 9
Показатели свободнорадикального окисления во внутренних органах при моделировании перитонита у стрессированных животных (M±m)
Показатель | 1 Ложная операция (n=11) | 2 ГК30 + Ложная операция (n=32) | 3 Перитонит (n=23) | 4 ГК30+ Перитонит (n=11) |
Головной мозг | ||||
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и. | 0,012±0,04 | 0,010±0,01 | 0,012±0,02 | 0,018±0,05 Р3,4=0,006U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е. о.и., | 1,23±0,15 | 1,15±0,33 | 1,15±0,05 | 1,39±0,07 Р3,4=0,006U |
Печень | ||||
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. | 0,515±0,084 | 0,536±0,09 | 0,547±0,03 | 0,523±0,04 Р3,4=0,028U |
Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е. о.и. | 0,174 ±0,02 | 0,22±0,01 | 0,19±0,01 | 0,13±0,02 Р3,4=0,006U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е. о.и., | 1,59±0,08 | 1,97±0,04 | 1,96±0,06 | 2,36±0,19 Р3,4=0,017U |
Костный мозг | ||||
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза е. о.и. | 0,48±0,06 | 0,47±0,1 | 0,51±0,03 | 0,45±0,09 Р3,4=0,0035 U |
Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е. о.и., | 2,12±0,34 | 2,34±0,56 | 2,38±0,09 | 1,98±0,04 Р3,4=0,01U |
Селезёнка | ||||
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. | 0,588±0,15 | 0,657±0,2 | 0,567±0,07 | 0,670±0,03 Р3,4=0,01U |
Тимус | ||||
Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е. о.и. | 1,005±0,024 | 1,01±0,018 Р1,2=0,01U | 0,975±0,071 | 0,988±0,08 Р3,4=0,01U |
Примечания: е. о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
Предварительная гипокинезия существенно повлияла на клеточный состав воспалительного экссудата при CLP – перитоните (таблица 10).
Это проявлялось в увеличении количества нейтрофильных гранулоцитов при одновременном снижении количества лимфоцитов. Кроме того, гипокинетический стресс ограничивает снижение фагоцитарного числа, вызванное септическим перитонитом (таблица 10).
Таблица 10
Клеточный состав перитонеальных смывов при CLP - перитоните у стрессированных животных (M±m)
Показатель | 1 Ложная операция (n=8) | 2 Перитонит (n=7) | 3 Гипокинезия+ Перитонит (n=10) |
Лейкоциты (×109/л) | 69,17±3,96 | 74,50±4,16 | 89,46±3,81 P2,3=0,016U |
Нейтрофилы (%) | 9,3±4,19 | 38,6±9,31 P=0,014U | 62,7±2,87 P2,3=0,027U |
Лимфоциты (%) | 83,25±6,25 | 47,2±5,01 P=0,014U | 36,8±4,431 P2,3=0,019U |
Фагоцитарное число | 0,96±0,15 | 0,651±0,04 P=0,038 U | 0,894±0,005 P2,3=0,044 U |
Примечание к таблице: U - Критерий Манна – Уитни
Основным итогом выполненного исследования является обнаруженный факт усугубления воспалительного процесса в брюшной полости на фоне 30 - суточной гипокинезии. Таким образом, экспериментально показана возможность развития осложнений при перитоните в результате длительного ограничения двигательной активности, что необходимо учитывать в хирургической практике.
Прежде всего, это связано с провоспалительными эффектами ГК30 в брюшине. Их наличие может быть связано с гиперцитокинемией, характерной для гипокинезии (, 2009). Вероятно, последствием гиперцитокинемии является формирование градиентов хемоаттрактантов.
При ГК30, также как и при экспериментальном перитоните, продукты свободнорадикального окисления обладают бактерицидным действием и вносят свой вклад в элиминацию инфекционных агентов при септическом перитоните (Skau T et al.,1986). Кроме того, они выступают в роли хемоаттрактантов для лейкоцитарных клеток (,1991). Гипокинезия оказывает аддитивное действие на перитонит-зависимое усиление окислительной модификации белков в воспалительном очаге. Вполне возможно, что это способствует реализации провоспалительных эффектов стресса применительно к экспериментальному перитониту.
ВЫВОДЫ
1. У животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии, как и у ложнооперированных животных, наблюдается увеличение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований в перитонеальных смывах, что ассоциируется с появлением в них нейтрофильных гранулоцитов.
2. Осуществляемый после завершения ГК30, операционный стресс характеризуется увеличением содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ во внутренних органах и органо - специфичным изменением уровня карбонилирования белков.
3. В перитонеальных смывах при септическом перитоните наблюдается усиление окислительной модификации белка, снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов и увеличение количества нейтрофилов со сниженным фагоцитарным числом.
4. Моделирование перитонита на фоне предварительной 30 – суточной привело к снижению уровня гептан-растворимых Шиффовых оснований, показателей НСТ - теста и уровня фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне увеличения их количества в перитонеальных смывах.
5. В печени и в головном мозге 30 - суточная гипокинезия с септическим перитонитом приводит к усилению Fe+2/аскорбат-индуцированного ПОЛ. При этом в печени снижается, а в головном мозге увеличивается содержание гептан-растворимых продуктов ПОЛ.
6. Сочетание 30 - суточной гипокинезии с септическим перитонитом приводит к повышению содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в тимусе и селезёнке и в снижении содержания изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов в костном мозге.
Список опубликованных работ:
1. Tseilikman, V. E. Stress-induced hepatitis and sensitivity to pro-inflammatory cytokines and glucocortikoids / V. E.Tseilikman, O. B. Tseilikman, M. I. Nusratov, S. V.Popov, D. A.Kozochkin // European journal of Immunology Supplement 1/09. Immunity for life Immunology for health Abstracts 2nd European congress of Immunology September 13-16, 2009 Berlin, Germany.
2. Tseylikman, V. E. Endocrine-immune interaction under stress conditions on hypertensive and normotensive rats / V. E. Tseylikman, O. B. Tseyliman, D. A. Kozochkin, A. I. Sinitsky, S. V.Popov, E. S. Katashinsky, A. M. Mironov // The journal of Physiological Sciences Proceedings of the XXXVI International Congress of Physiological Sciences Function of Life: Elements and Integration July 27–August 1, 2009, Kyoto, Japan.
3. Лаптева, свободнорадикального окисления в эритроцитах и во внутренних органах при гипокинетическом и иммобилизационном стрессе / , , // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Российская конференция, посвящённая 80-летию со дня рождения . Челябинск. – 2009. – С. 57.
4. Цейликман, влияние хронического стресса на реакцию лейкоцитарного звена системы крови и процессы свободнорадикального окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните / , , // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. -2010- № 2/1 (29). – С.226-227.
5. Плеханова, функционального статуса нейтрофилов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек у крыс при стрессе и его сочетании с экспериментальным перитонитом / , , // Вестник Уральской медицинской академической науки Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии, биотехнологии.- 2011.-№4/1 (38) С.145-146
6. Плеханова, функционального статуса нейтрофилов, количества нейтрофильных внеклеточных ловушек и уровня свободно-радикального окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните./ , , // Вестник Уральской медицинской академической науки№ 2/1.- С. 61 – 62.
7. Плеханова, функционального статуса нейтрофилов при экспериментальном стрессе микробной и немикробной этиологии у животных / , , // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2012.- №2 (39).- С.112-113.
8. Cтрельников, предварительной гипокинезии на глюкокортикоид-зависимые изменения поведенческой активности и свободно-радикального окисления в различных отделах головного мозга / И. В.Cтрельников, , , , // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012.- № 2.- С.113 – 114.
Список использованных сокращений:
ГК – гипокинезия
ГК30 – тридцатисуточная гипокинезия
ДК – диеновые конъюгаты
КДиСТ – кетодиеновые сопряженные с триеновыми
МАО-Б – моноаминоксидаза-Б
ОМБ – окислительная модификация белка
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ШО – Шиффовы основания
U – критерий Манна-Уитни
WW – критерий Вальда-Вольфовица
Работа проведена в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2годы, Соглашение № 000 от 01.01.2001 (НОЦ " Проблемы фундаментальной и клинической медицины ").
