Показатели противодифтерийного антитоксического иммунитета у детей и совершенствование тактики контроля дифтерии

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА

Елена Андреевна

ПОКАЗАТЕЛИ ПРОТИВОДИФТЕРИЙНОГО АНТИТОКСИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТАКТИКИ КОНТРОЛЯ ДИФТЕРИИ.

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

г. Санкт-Петербург

2012

Работа выполнена в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодская обл." href="/text/category/vologodskaya_obl_/" rel="bookmark">Вологодской области» и ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Галина Яковлевна Ценева

Официальные оппоненты:

- доктор медицинских наук, профессор, ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени », кафедра микробиологии, профессор

- доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «Научно-исследовательский институт детских инфекций Федерального медико-биологического агентства», бактериологическая лаборатория, заведующая

Ведущее учреждение:

ГБОУВПО «Северо-Западный Государственный медицинский университет имени » Министерства здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится 22 января 2013 года в 15-00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени » МО РФ ( Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени » МО РФ

Автореферат разослан «___» декабря 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Юрий Алексеевич Митин

ОБЩАЯ ХАРАКТРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время дифтерийная инфекция продолжает оставаться серьезной проблемой для здравоохранения. Несмотря на стабилизацию показателей заболеваемости дифтерией в РФ отмечаются случаи заболевания и бактерионосительства среди детского населения в отдельных регионах.

Важно отметить, что продолжают регистрироваться случаи заболеваний дифтерией среди привитых. Так, в г. Вологде и в Вологодской области в последние годы у 80 % заболевших дифтерией в крови определялись антитоксические антитела в титрах 1:40-1:80 и выше (по данным РПГА), которые согласно нормативным документам рассматриваются как обеспечивающие невосприимчивость к инфекции. Однако в последние годы показано, что метод РПГА не отражает истинного состояния невосприимчивости к дифтерии, т. к. коэффициент корреляции между результатами исследования сывороток в РПГА и классической реакции нейтрализации в культуре клеток Vero, принятой в качестве «золотого» стандарта, равен r = 0,5. В то же время этот же показатель для ИФА и РН (Vero) составил 0,95 с уровнем достоверности p < 0,05. (, 2011 г.).

Известно, что в создании устойчивого иммунитета к инфекционным заболеваниям важное значение имеет не только количество антител, вырабатываемых в результате вакцинации, но особенно их качество. Этот показатель характеризует прочность и устойчивость образованного комплекса «антиген – антитело» (авидность). Установлено, что низкоавидные антитела не могут защитить человека от заболевания в случае инфицирования (Usinger W. R., 1999). Для ряда инфекций (ЦМВ, ВИЧ, краснуха, эпидемический паротит, токсоплазмоз, шистоматоз) зарубежными производителями выпускаются коммерческие тест-системы, в которых предусмотрено определение авидности, рассчитаны критерии невосприимчивости к инфекциям управляемым вакцинопрфилактикой (Eggers M, 2000; Prince H. E., 2002; Le Guillou H. 2001; Bottiger B., 1997). В последние годы появились результаты изучения авидности противодифтерийных антитоксических антител у взрослых лиц, получивших ревакцинирующие прививки с интервалом не менее 10 лет (, 2011).

Изучение авидности антител у детского населения, получившего цикл вакцинирующих и ревакцинирующих прививок против дифтерии, равно как использование метода ИФА для контроля иммунитета, не проводилось.

Учитывая, что в постэпидемический период, особенно в период 2-ой волны подъема заболеваемости дифтерией, болели преимущественно дети, представлялось важным провести комплексное изучение состояния их противодифтерийного иммунитета с применением новых методических подходов.

Известно, что серьезную проблему представляют бактерионосители C.diphthriae, создающие опасность инфицирования возбудителем дифтерии детей особенно в организованных коллективах. Современный лабораторный диагноз базируется на традиционных приемах обнаружения возбудителя, его токсигенности и выявлении специфических антител методом РПГА. Однако они не решают проблемы экспрессной диагностики и выявления штаммов с «молчащим» геном токсигенности. Для повышения эффективности бактериологической диагностики дифтерии необходимо было оценить значение метода ПЦР для выявления C.diphthriae у детей с клиническим статусом и «так называемых» здоровых.

Изложенное определило необходимость комплексных исследований, направленных на выяснение роли высокоавидных антител в защите от инфекции у детей, их использования для контроля поствакцинального иммунитета и выявление особенностей биологических свойств C.diphthriae, циркулирующих в период вакцинопрофилактики.

Цель исследования:

Оценить показатели поствакцинального иммунитета и степень защищенности детей от дифтерии, совершенствовать тактику контроля дифтерийной инфекции.

Задачи работы:

1.  Определить защищенность от дифтерии детского населения с использованием современных методов серологической диагностики.

2.  Оценить роль высокоавидных антитоксических противодифтерийных антител в формировании устойчивого поствакцинального иммунитета у детей. Изучить особенности динамики их накопления и регрессии у детей.

3.  Определить особенности основных биологических свойств C.diphtheriae, циркулирующих в периоды подъема и спада уровней заболеваемости дифтерией.

4.  Разработать алгоритм лабораторного контроля противодифтерийного иммунитета у детей.

Научная новизна. Впервые определен уровень суммарных и высокоавидных АТ-АТ у детей, получивших комплекс вакцинирующих и ревакцинирующих прививок.

Для оценки индивидуального и коллективного иммунитета против дифтерии у детей применен метод ИФА и его модификация, определены достоверные критерии невосприимчивости.

Впервые установлена возрастная группа «риска» (9-13 лет), содержащая в крови низкие уровни АТ-АТ независимо от соблюдения графика прививок.

Выявлена особенность динамики накопления и снижения уровня высокоавидных АТ-АТ у детского населения, состоящее в более длительном сохранением высокоавидных антител, чем у взрослого населения.

Возможная причина супрессии tox-гена у штаммов C. diphtheriae, изолированных от больных с ЛОР-патологией в период подъема заболеваемости может быть связана с использованием пациентами антибактериальных препаратов для лечения основного заболевания.

Установлена высокая частота резистентности штаммов C. diphtheriae, выделенных в гг., к тетрациклину (83%) и пенициллину (59%) по сравнению с таковыми у штаммов, выделенных в гг.

Практическое значение. Апробирован и внедрен в практику простой и наиболее адекватный тест для измерения авидности противодифтерийных антитоксических антител с использованием ИФА с расчетом индекса авидности (ИА), позволяющий определять истинные протективные антитела. При коэффициенте ИА, равном 10, обследуемые являются незащищенными, при ИА, равном 30 и более, обеспечивается защита от заболевания на 95% в течении не менее 7 лет.

Данные по проведению и использованию ИФА в практических лабораториях изложены в Методических рекомендациях «Серологические методы для диагностики и мониторинга дифтерийной инфекции», утвержденных Департаментом здравоохранения Вологодской области (2012 г.).

Для унификации и повышения эффективности серологического контроля иммунитета предложен алгоритм, включающий:

1)  периодичность серологического мониторинга (не реже 1 раза в 2 года);

2)  использование ИА и определения уровня АТ-АТ в МЕ/мл;

3)  определение степени невосприимчивости обследуемых с учетом сроков сохранения высокоавидных АТ-АТ;

4)  сопоставление серологических данных с результатами изучения циркуляции C.diphtheriae (токсигенных, с «молчащим» геном), что позволит выявлять группы повышенного риска.

Разработан алгоритм микробиологического мониторинга за циркуляцией токсигенных C.diphtheriae с использованием метода ПЦР и определение чувствительности к антибактериальным препаратам.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1.  На основании данных определения поствакцинальных противодифтерийных антител методом ИФА и его вариантов установлены объективные показатели защищенности детского населения от дифтерии.

2.  Обосновано применение метода ИФА c учетом индекса авидности и определения сроков регрессии высокоавидных антител, для установления вакцинального статуса при серологическом мониторинге иммунитета к дифтерии у детей.

3.  Для мониторинга циркуляции C. diphtheriae и выявления эпидемически значимых штаммов подтверждена необходимость использования метода ПЦР.

4.  Выявленные особенности (доминирование культур с «молчащим» геном токсигенности, выраженная резистентность к антибактериальным препаратам, циркуляция рибо – и биотипов, характерных для эпидемической ситуации) биологических свойств C. diphtheriae, циркулирующих в постэпидемических период и подъема заболеваемости позволяют рассматривать их в качестве основных признаков для прогноза заболеваемости дифтерии у детей.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты работы внедрены в практическую деятельность врачей диагностических центров и микробиологических лабораторий Центров гигиены и эпидемиологии г. Вологды и Вологодской области.

Результаты исследований внедрены в учебный процесс Вологодского филиала ГБОУВПО «Северо-Западный Государственный медицинский университет имени » Министерства здравоохранения РФ.

Материалы диссертации представлены в «Руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: Коринебактерии) М. 2011.

Разработана технология получения контрольных образцов для определения индекса авидности противодифтерийных антитоксических антител с помощью ИФА тест-системы, выпускаемой филиалом » Минздравсоцразвития Россия Пермское НПО «Биомед» №09/600/22116.

Составлены методические рекомендации «Серологические методы для диагностики и мониторинга дифтерийной инфекции». Утверждены Департаментом здравоохранения Вологодской области, 2012 г.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано: 15 научных работ, в том числе 3 – в изданиях, рецензируемых ВАК.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных семинарах, конгрессах и конференциях в гг.: 7 февраля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградская обл." href="/text/category/leningradskaya_obl_/" rel="bookmark">Ленинградской области; 26 мая 2007 г. ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава. Всероссийская научная конференция «Современные проблемы медицинской микробиологии» (Хлопинские чтения); 26 февраля 2008 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 2-4 июня 2008 г. Четвертая международная конференция, посвященная 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера; 16-17 декабря 2009 г. Вологда. Пленум, посвященный 65-летию Российской академии медицинских наук и 130-летию со дня рождения академика АМН СССР ; 08 июня 2010 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 15 сентября 2010 г. Вологда. Научно-практическая конференции ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области»; 14 сентября 2012 г. Вологда. Научно-практическая конференции ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области».

Личный вклад автора. Собраны, изучены и проанализированы аналитические данные о профилактических прививках обследованных детей, и клинический статус.

Основные результаты получены лично автором, отдельные фрагменты выполнены совместно на базе лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИЭМ имени Пастера. Выделение штаммов C. diphtheriae, сбор сывороток от больных и здоровых лиц проведен в микробиологических лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии г. Вологды и Вологодской области, а также лично автором.

Микробиологические, серологические, иммунохимические, экспериментальные исследования, а также компьютерный и статистический анализ данных проведен автором в лаборатории бактериальных и паразитарных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области» и в лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИЭМ им. Пастера.

Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения.

Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 15 рисунками. Список литературы содержит 102 источника отечественных авторов и 250 источников зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В соответствии с целью и задачами исследования использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.

Таблица 1.

Объем проведенных исследований различными методами

Методы	Объем
1.  Бактериологический: 1.1.  Изучение характеристик циркулирующих штаммов C.diphtheriae. 1.2.  Сравнение методов определения токсигенности штаммов C.diphtheriae.	170 шт. 75 шт.
2.  Иммунологический: 2.1.  Сравнительная оценка методов РПГА, ИФА и его вариантов для определения защищенности от дифтерии. 2.2.  Оценка уровней АТ-АТ по международным стандартам. 2.3.  Выделение групп «риска» по возрасту. 2.4.  Оценка эффективности теста определения авидности антитоксических антител. 2.5.  Изучение динамики показателей защищенности от дифтерии	203 ОСК 110 ОСК 189ОСК. 110 ОСК 122 ОСК
3.  Молекулярно-генетический: ПЦР и риботипирование	85шт.

Методы культивирования штаммов.

Исследованы штаммы C.diphtheriae, выделенные автором и полученные из практических лабораторий г. Вологды и Вологодской областей за период гг. Всего изучено 170 штаммов[1].

Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили в соответствии с Методическими указаниями «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» (МУ 4.2.698-98), «Определителем бактерий Берджи» (1997), учебным пособием «Микробиология» под редакцией (1999), руководством по лабораторной диагностике ВОЗ «Дифтерия» (1994 г., 2009 г.), учебным пособием для врачей «Дифтерия. Лабораторная диагностика» (2009 г.), схемами идентификации коринебактерий, предложенные Guido Funke et al. (1997) и Manual of Clinical Microbiology (2 Volume Set), Patrick R. Murray (2007).

В работе использованы референс-штаммы C. diphtheriae № 000 (tox-), № 000 (tox+) и № 000 (tox+/-) из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK).

Методы определения токсигенности C. diphtheriae

Для определения токсигенности C. diphtheriae использованы 4 теста: полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммунохроматографический тест (ICS), иммунопреципитация в агаре (Elek-тест), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).

Постановку ПЦР со специфическими праймерами проводили в соответствии с инструкцией по применению тест – системы для выявления участка ДНК 360 пар нуклеотидов гена токсина коринебактерии дифтерии производства «АмплиСенс», г. Москва.

Для постановки ICS-теста использовали диагностический набор, полученный из Diphtheriae Reference Laboratory (CPHL), London, UK.

Elek-тест проводили по общепринятой методике, согласно МУ 4.2.698-98 с использованием среды ОТДМ для определения токсигенности дифтерийных микробов производства НПО «Питательные среды» г. Махачкала, Россия. Для приготовления бумажных дисков применяли «Антитоксин диагностический дифтерийный очищенный ферментолизом и специфической сорбцией, сухой» производства НПО «Биомед», г. Пермь.

Для постановки РНГА использовали диагностический набор с эритроцитарным диагностикумом (производства НИИЭМ им. Пастера, С-Петербург).

Определение чувствительности C.diphtheriae к антибиотикам проводили методом серийных разведений и диско-диффузионным методом согласно МУК 4.12.1890-04 (Москва, 2004), “Basic laboratory procedures in clinical bacteriology” (WHO, Geneva, 1991, раздел “Определение чувствительности к антимикробным препаратам”) и руководства ВОЗ "Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии" (1994). В качестве среды для постановки теста использовали бульон и агар Мюллера-Хинтона с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота. Для контроля качества сред использовали стандартные штаммы: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). В качестве контрольных штаммов для оценки чувствительности использовали Corynebacterium diphtheriae var. gravis (tox+) (NCTC 10648) и Staphylococcus aureus (ATCC 25923).

Иммунологические методы

РН (реакция нейтрализации) в культуре клеток Vero

В РН использовали токсин 0,0002 Lf/мл и антитоксин 0,032 МЕ/мл, полученные из NCTC (National Collection of Type Cultures Diphtheriae Reference Laboratory, Central Health Laboratory (CPHL), London, UK). При постановке реакций применяли культуру клеток Vero, полученную из лаборатории детских вирусных инфекций НИИЭМ им. Пастера, в концентрации 2,5·105 клеток/мл. Содержание антитоксических антител определяли от 0,000125 МЕ/мл и выше.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

Использован эритроцитарный дифтерийный антигенный жидкий диагностикум производства «Биомед» им. (Московская обл." href="/text/category/moskovskaya_obl_/" rel="bookmark">Московская обл., Красногорский район, с. Петрово-Дальнее).

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Тест-система для ИФА предназначенна для определения суммарных антитоксических антител на основе конъюгата - иммуноглобулинов (F(ab')2-фрагментов) диагностических против IgG человека, аффинноочищенных, меченных пероксидазой (производства НПО «Биомед, г. Пермь). С помощью специальной компьютерной программы, прилагаемой к набору, производили перерасчет показателей оптической плотности в показатели антитоксических международных единиц.

Для определения авидности антител использовали модифицированную тест-систему путем введения дополнительных 2-х контролей: положительный образец (К+) – сыворотка крови человека с индексом авидности 95% и отрицательный образец (К-) - сыворотка крови человека с индексом авидности 5%, а также других ингредиентов и разработанных условий проведения реакции.

Эпидемиологические методы

Анализ заболеваемости населения г. Вологды и Вологодской области проводили за период с 2000 по 2011 гг. по статистическим данным и историям болезни. Сопоставление данных о заболеваемости, привитости детей от дифтерии, а также о циркуляции выделенных штаммов C. diphtheriae предоставлены филиалами Центров гигиены и эпидемиологии на изучаемых территориях.

При определении групп «риска» среди детей по восприимчивости к дифтерии учитывали возраст, принадлежность детей к организованным и неорганизованным контингентам, наличию или отсутствию заболеваний, по прививочному статусу. Для работы использовали годовые и месячные статистические формы отчета по заболеваемости и вакцинации дифтерии (№1; 2; 5; 6).

Методы статистической обработки данных.

Для анализа и оценки явлений использованы относительные и средние величины. В работе приведены интенсивные, экстенсивные показатели и показатели наглядности. Экстенсивные показатели выражали в процентах.

Представленные результаты исследований имели критерий достоверноcти t > 3 и уровень статистический значимости p<0,05.

Математическая обработка данных выполнена на ПК с использованием стандартных статистических пакетов. Для первичной подготовки таблиц и промежуточных расчетов использовали пакет Excel.

Результаты исследований и их обсуждение

Обоснование объективного метода контроля поствакцинального иммунитета.

При анализе данных о заболеваемости дифтерией и защищенности детского населения на территории г. Вологды и Вологодской области за период с 2005 по 2010 гг. установлено, что показатели фактической защищенности не согласуются с показателями заболеваемости. Так, заболеваемость продолжала увеличиваться после постэпидемического спада в гг. В этот период регистрировались случаи дифтерии среди детей с защитными титрами антитоксических антител. При этом степень защищенности населения от дифтерии определяли фрагментарно и на основании данных РПГА. Вышеизложенное указывало на необходимость поиска причин такого несоответствия. В то же время в ряде стран с целью оценки защищенности от инфекций, в том числе от дифтерии, используют иммуноферментные методы.

Для решения вопроса об эффективности использования ИФА для контроля иммунитета к дифтерии у детей были проведены параллельные исследования 270 сывороток крови в трех используемых в нашей стране методах: в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток Vero, в РПГА и в иммуноферментном анализе (ИФА).

Полученные результаты показали, что коэффициент корреляции между результатами исследования сывороток в РПГА и классической РН в культуре клеткок Vero составил r = 0,67. Между тем, этот показатель для ИФА и РН (Vero) составил 0,96 с уровнем достоверности p < 0,05 (рис. 1).

Рис.1. Результаты исследования сывороток тремя методами

Видно, что метод ИФА по чувствительности и достоверности результатов, критериям оценки в МЕ/мл[2] наиболее близок к международному стандарту – реакции нейтрализации в культуре клеток Vero. Поэтому в дальнейших серологических исследованиях мы использовали ИФА.

Мониторинговые исследования уровней противодифтерийных антител у детей г. Вологды и Вологодской области проведены в 3 периода:гг.;гг.;гг.. Исследовано 962 образца сыворотки крови. Такое разделение на периоды обусловлено различиями в структуре иммунитета у детей в разные годы (рис.2).

Рис. 2. Результаты определения противодифтерийных антитоксических антител в разные годы постэпидемического периода

Видно, что в гг. доля детей имеющих защищенный уровень АТ-АТ от дифтерии составляла по области 88 (+0,4) %, к гг. произошло ее снижение до 64 (+0,3) %. При этом доля незащищенных детей составила 10 (+0,1) %, а группа детей, имеющих в крови антитела с некоторой степенью защиты от дифтерии, возросла и составила 26 (+0,3) %. Можно полагать, что доля незащищенных будет увеличиваться по мере утраты поствакинального иммунитета, а дети из группы защищенных будут постепенно перемещаться в группу с некоторой степенью защиты. Однако по отчетным данным ФБУЗ 95% обследованных в период гг. по результатам контроля иммунитета методом РПГА содержали высокие и средние уровни АТ-АТ.

Таким образом, использование метода (ИФА) для контроля иммунитета против дифтерии у детей позволило получить достоверные данные защищенности детского населения на территории Вологодской области.

Оценка защищенности от дифтерии детского населения разных возрастных групп.

Важными критериями при выделении групп «риска» среди обследуемого детского населения стали: наличие или отсутствие нарушений в графике профилактических прививок и возрастной показатель. Обследованию подлежали привитые против дифтерии дети и подростки трех возрастных групп (0-4 года, 9-13 лет, лет).

Среди обследуемых были выделены 2 группы: 1)привитые без нарушения графика профилактических прививок – 89 (+0,2) %; 2)привитые с нарушением графика профилактических прививок (2 дозы и менее) – 11 (+0,1) %.

Установлено, что среди всех возрастных групп 20 (+0,8) % детей привиты с нарушением графика профилактических прививок. Среди них выделяется группа детей 9-13 лет, у которых в 27 (+0,2) % случаев вакцинация и ревакцинация проведены с нарушением графика.

В результате исследования 182 образцов сывороток крови детей в 3-х возрастных группах (рис.3.) установлено, что 89 (+0,4) % детей 0-4 года и 50 (+0,1) % лиц 16-18 лет содержали АТ-АТ в количестве 1,0 и > МЕ/мл, которые по международным критериям защищенности рассматриваются как обеспечивающие стойкую длительную невосприимчивость к дифтерии. Наименьшее число лиц имеющих защитный титр выявлено в группе 9-13 лет, что составило 33 (+0,1) %.

Рис.3. Результаты определения суммарных противодифтерийных АТ-АТ у детей в разных возрастных группах (по данным ИФА)

Учитывая, что количество суммарных противодифтерийных антител не позволяет объективно оценить степень защиты от дифтерии, нами в параллельных исследованиях определены уровни высокоавидных антител и оценена их протективная значимость.

Рис.4. Результаты определения высоавидных противодифтерийных АТ-АТ у детей в разных возрастных группах (n=249).

Примечание: ИА> 30% обеспечивает высокий уровень защиты от дифтерии (с вероятностью 95%); ИА, равный 11-30%, обеспечивает некоторую степень защиты от дифтерии; ИА < 10% является нижним пороговым уровнем.

В результате исследования 249 образцов сывороток крови детей, привитых без нарушения графика профилактических прививок, в 3-х возрастных группах установлено, что у детей 9-13 лет, имеющих защитный титр суммарных АТ, определен низкий индекс авидности АТ-АТ. Он установлен у 89 (+0,4) % детей этого возраста. Данный факт характеризует низкое качество противодифтерийного иммунитета у детского населения территорий наблюдения (рис.4.)

Динамика показателей авидности антител у детского населения.

Поскольку авидность антител имеет определяющее значение при оценке защищенности от дифтерии, была определена динамика их накопления и утраты. Для этого исследовано 150 сывороток крови здоровых привитых детей (по 10-15 сывороток) на каждый срок после ревакцинации через определенные промежутки времени: через 1 месяц, через 3 месяца и так далее – до 6 лет, после этого – с интервалом 6 месяцев до 8 лет. Полученные данные сравнили с аналогичными показателями, определенными ранее у взрослых в совместных исследованиях в лаборатории бактериальных и капельных инфекций НИИЭМ им. Пастера (рис. 5).

Рис.5. Результаты определения индексов авидности противодифтерийных АТ-АТ в динамике.

Установлено, что созревание высокоавидных антител достигает максимума в среднем через год после ревакцинации. У детей, в отличие от взрослых, период регрессии более длителен, и после ревакцинации индекс авидности антител достигает минимального (критического) уровня (10%) к 7-8-му году. Однако количественное содержание антитоксических антител в эти сроки остается в пределах защитных уровней (0,1-0,5 МЕ/мл).

Таким образом, данные проведенного исследования антитоксического иммунитета показали, что характер иммунного ответа зависит в первую очередь, от адекватности полученного вакцинального комплекса, от возраста ребенка и авидности вырабатываемых антитоксических антител. В этой связи нами выделена группа детей в возрасте 9-13 лет, характеризующаяся низким уровнем защищенности от дифтерии. Эта группа представляет основной детский контингент «риска» за счет которой возможно повышение заболеваемости.

Особенности биологических свойств циркулирующих штаммов C.diphtheriaе.

На фоне снизившейся заболеваемости дифтерией в г. Вологде и Вологодской области отмечается уменьшение количества бактериологических исследований на дифтерию. Наряду с этим уменьшается показатель высеваемости C. diphtheriae, который к 2011 г. достиг значения 0,03 % от числа проведенных бактериологических исследований. Однако в гг. отмечалась высокая заболеваемость (показатель 3,3 на 100 тыс. населения), в то время как в РФ в этот период наблюдалось снижение заболеваемости до уровня 0,01 на 100 тыс. населения (рис. 6.).

Рис. 6. Заболеваемость дифтерией и высеваемость токсигенных штаммов C. diphtheriae в разные периоды эпидемического процесса в Вологде и Вологодской области (по данным ТУ Роспотребнадзора).

Видно, что высокие показатели заболеваемости регистрировали в гг. Они могут быть объяснены слабой иммунной прослойкой, что было показано выше. Особенно низкий уровень защищенности установлен в группе детей 9-13 лет. От детей этого возраста изолировано 59 (+0,5)% культур из общего числа выделенных культур C. diphtheriae (рис. 7).

Рис. 7. Структура выделенных культур C. diphtheriae от детей разного возраста (п=170).

В этот период установлено снижение доли штаммов варианта mitis до 15 (+0,5) % и значительное увеличение варианта gravis до 85 (+0,5) % от числа выделенных штаммов. При этом среди штаммов варианта gravis значительно возросла доля токсигенных штаммов – до 88 (+1,0) % .

Оценка токсигенности штаммов фенотипическими и молекулярно-генетическим методами.

Проведена количественная оценка степени токсигенности циркулирующих штаммов C.diphtheriae и изучение нетоксигенных штаммов методом ПЦР. С помощью Elek-тестa идентифицированы 75% токсигенных и 25% нетоксигенных штаммов, при этом специфичность метода составила 96,0%. Однако в Elek-тесте получено 10% ложно-отрицательных результатов.

Максимальной чувствительностью и специфичностью обладал ICS-тест: 96,2% и 99% соответственно, высокой – РНГА (96,0% и 94,5%).

В результате сравнения данных, полученных при изучении токсигенности штаммов в разных тестах, по формуле Domeika (1994) были определены наиболее эффективные фенотипические тесты (рис. 8.): ICS-тест и РНГА. Вместе с тем, исследование штаммов C.diphtheriae только в регламентированном Elek-тесте нельзя считать окончательным из-за невысокой чувствительности метода. В этой связи целесообразно проведение дополнительных контролей на токсигенность.

Рис. 8. Оценка диагностической эффективности фенотипических методов определения токсина у C. diphtheriae.

С помощью РНГА получена количественная характеристика токсигенности штаммов. Установлено, что в межэпидемический период произошло изменение степени токсигенности штаммов C. diphtheriae. Так, слаботоксигенные (Т1) и среднетоксигенные (Т2) штаммы составляли 9 (+0,2) % и 12 (+0,3) % соответственно от общего числа изолированных токсигенных культур. В то же время доля высокотоксигенных штаммов (Т3) возросла и составила 79 (+0,5) % (рис. 9.).

Рис. 9. Структура штаммов C.diphtheriae по степени токсигенности
(данные РНГА).

Все нетоксигенные в Elek-тесте штаммы были исследованы с помощью ПЦР. В межэпидемический период доля штаммов, выделенных в Вологодской области и несущих «молчащий» ген, составила 12(+0,1) %, в то время как для СЗФО она была равна 30 (+0,4) %.

Определение чувствительности штаммов C.diphtheriae к антибиотикам.

Анализ историй болезни и амбулаторных карт показал, что в межэпидемический период на территории наблюдения препаратами выбора для лечения дифтерии и санации носителей C. diphtheriae являлись пенициллины, карбапенемы, макролиды и тетрациклины. В опытах изучения чувствительности к антибиотикам использовали штаммы (n=30), изолированные в указанные периоды наблюдения.

В результате проведенных исследований установлено, что уровень минимальной подавляющей концентрации (МПК 90) наиболее эффективного в отношении C. diphtheriae антибиотика (тетрациклина) возрос с 0,064 мкг/мл в 1994 г. до 96 мкг/мл в 2010 г., т. е. в 1500 раз (таблица 3).

В последние годы в значительной степени снизилась чувствительность штаммов C.diphtheriae к тетрациклину и пенициллину. В 2010 г. такие штаммы составляли 83% и 59% соответственно. Возможно, что это объясняется более широким использованием именно этих препаратов в клинической практике, а следовательно, низким лечебным эффектом у больных и бактерионосителей.

Таблица 3.

Изменение МПК90 антибиотиков к штаммам C. diphtheriae в динамике.

Годы выделения штаммов	МПК90 антибиотиков (мкг/мл)
Рифам-пицин RI	Эритро-мицин EM	Пеницил-лин PG	Тетра-циклин TC	Кларитро-мицин CH	Азитро-мицин AZ
n=9	<0,002	<0,016	0,125	0,064	<0,016	0,016
n=7	<0,002	<0,016	0,19	0,125	0,016	0,047
2010 n=13	0,023	<0,016	0,38	96	<0,016	0,047
% устойчивости штаммов	0%	0%	59%	83%	0%	0%

Сопоставление биологических свойств C.diphtheriae с показателями иммунитета и их значение для мониторинга за дифтерийной инфекцией.

Исследования дифтерийного процесса с изучением биологических свойств возбудителя и анализ данных по заболеваемости дифтерией во время межэпидемического подъема на территории г. Вологда и Вологодской области среди детей, способствовало пониманию причины повышения заболеваемости в данный период. Одной из основных причин следует признать использование неадекватных методов контроля (РПГА) защищенности детского населения от дифтерии. В то же время ИФА и его варианты позволяют определять авидность изучаемых антител, которые играют определяющую роль в защите от дифтерии.

Данные сведения, полученные при исследовании динамики накопления и утраты антитоксических антител, созревания и регрессии среди них высокоавидных антител, дают возможность рассчитать прогноз на будущее в плане вероятности заболевания через любой отрезок времени. Их необходимо использовать для мониторинга иммунитета к дифтерии.

Таким образом, получение данные кардинально меняют подход к оценке иммунитета у детей, что особенно важно в эпидемиологической практике. На основании проведенного анализа предложен алгоритм контроля иммунитета у детей и оценка невосприимчивости к дифтерии, как отдельных лиц, так и коллективов (изложены в приложении).

Как показано выше, при подъеме заболеваемости дифтерией в межэпидемический период на территории г. Вологды и Вологодской области основную долю заболевших составили дети из организованных коллективов. В качестве профилактических мер в таких случаях может служить постоянный мониторинг циркуляции C.diphthеriae. Для подъема заболеваемости характерно доминирование варианта gravis, повышение частоты циркуляции токсигенных штаммов и штаммов с «молчащим» геном, увеличение доли штаммов с высокими уровнями токсинопродукции, а также снижение их чувствительности к антибактериальным препаратам.

Нами разработан алгоритм мониторинга циркулирующих штаммов C. diphtheriaе индикаторных групп (представлены в практических рекомендациях).

Выводы:

1  С помощью метода ИФА и его вариантов (определение высокоавидных антител и индекса авидности) установлена степень объективной защищенности детей от дифтерии. При использовании метода ИФА и его вариантов установлена группа «риска» детей в возрасте 9-13 лет имеющих низкий уровень защищенности от дифтерии.

2  Подтверждена определяющая роль высокоавидных АТ-АТ в создании невосприимчивости к дифтерии. Выявлена особенность динамики созревания высокоавидных АТ-АТ и их регрессии у детей, отличающаяся от таковых у взрослого населения: снижение индекса авидности до низкого уровня (10%) у детского населения происходит через 7-8 лет после ревакцинации в то время, как у взрослых – через 5 лет.

3  В годы подъема заболеваемости в Вологде и Вологодской области ( г. г.) от больных, бактерионосителей и больных с ЛОР-патологией в 12% случаев выделены культуры C.diphtheriae c «молчащим» геном токсигенности, определяемым методов ПЦР.

4  Установлено изменение чувствительности у штаммов C.diphtheriae, изолированных в постэпидемический период, к используемым для лечения и санации антибактериальным препаратам выбора (тетрациклину, пенициллину).

5  Предложены алгоритмы микробиологического мониторинга включающие в себя изучение групп «риска» у детей и выявление эпидемически значимых культур C. diphtheriae, в том числе c «молчащим» геном токсигенности определяемым методов ПЦР.

Практические рекомендации.

Оценка состояния коллективного иммунитета у детей требует более детальной характеристики, чем только установление серонегативных лиц, особенно при циркуляции C.diphtheriae и/или подъеме заболеваемости. Для этого следует определить структуру обследуемых с учетом данных серонегативных реакций и учета степени защищенности. Титры 1:40 и 1:80 (по данным РПГА) следует считать индикатором пограничного иммунитета, не обеспечивающего продолжительной безусловной защиты, хотя заболевание при этом протекает в легкой форме.

Адекватнее для контроля поствакцинального иммунитета использовать ИФА с расчетом индекса авидности (ИА) и критериев защищенности по уровням МЕ/мл, соответствующим международным стандартам. При коэффициенте ИА, равном 10%, обследуемые являются незащищенными, при 30 и более обеспечивается защита на 7-8 лет.

При выявлении у 50% обследованных показателей пограничного иммунитета следует рассматривать их как слабо защищенные группы, в которых с годами будет увеличиваться число незащищенных. Для эффективного контроля за состоянием коллективного иммунитета у детского населения предлагаем алгоритм серологического контроля:

·  Выбор контингента для обследования с выделением группы «риска» в возрастной категории 9-13 лет.

·  Определение количества детей, необходимого для получения достоверных результатов рассчитывать по формуле:

n=t2 *P*q/∆2

где n - число наблюдений, t – критерий достоверности, Р – доля лиц (в %), защищенных от заболевания, высчитанная в ходе предыдущих исследований или известная из литературы; q=(100%-Р); ∆- максимальный размер ошибок выборки.

·  Определение защищенности методом ИФА и оценкой по международным стандартам.

Мониторинг за циркуляцией C.diphthеriae должен быть постоянным и включать следующие этапы:

I этап: Лица, подлежащие обследованию: 1)больные ЛОР-патологией и дифтерией; 2)контактные из очагов дифтерии; 3)здоровые (случайный выбор).

II этап: Выделение C.diphtheriae, определение токсигенности с помощью ПЦР и Elek-теста, возможные варианты санации: 1) выделение C.diphtheriae определение чувствительности к антибиотикам, санация чувствительным антибиотиком; 2) если в Elek – тесте отрицательный результат, а в ПЦР – положительный, то следует проводить санацию; 3) если в Elek – тесте и ПЦР результат отрицательный, следует проводить диспансеризацию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  Алексеева токсигенности штаммов C. Diphtheria, циркулирующих в пост-эпидемический период в Северо-Западном округе РФ / , , // Материалы Всеросийской науной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии». – СПб. – 2007. – с. 82-87.

2.  Краева подходы к оценке защищенности от дифтерийной инфекции / , , // Материалы 4-ой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». – СПб. – 2008. – с. 15.

3.  Алексеева эффективности различных методов диагностики в определении токсигенности у штаммов C. diphtheria / , // Мат-лы Пленума Научн. совета, посвящ. 65-летию Росс. акад. мед. наук и 130-летию со дня рождения академика АМН СССР . – 2009. – с. 113-114.

4.  Алексеева токсигенности штаммов C. Diphtheria, циркулирующих в эпидемический период в Вологодской области / , , // Сборник научно-практической конференции Вологодской области. – 2009. – с. 22

5.  Краева высокоавидных антитоксических антител в оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекции / , , // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2011. – № 4. – с. 20-24.

6.  Алексеева высокоавидных антитоксических антител в оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекции / , , // Профилактическая и клиническая медицина. – 2011. – № 1. – с. 38.

7.  Алексеева подходы при комплексных лабораторных исследованиях на дифтерию / , , // Инфекция и иммунитет. – 2012. – № 4. – с. 23-30.

8.  Алексеева мониторинга противодифтерийного иммунитета детей в Вологодской области / , , // Материалы X Съезда ВНПОЭМП. Инфекция и иммунитет. – Москва. – 2012. - № 2. – с.77-78.

9.  Краева улучшения лабораторной диагностики при выявлении токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheria / , , // Проблемы медицинской микологии. – 2012. Т.14 - № 2. – с.100.

10.  Краева иммунитета к дифтерии у населения Северо - Западного Округа РФ и пути оптимизации мониторинга инфекции / , , // Материалы научно-практической конференции посвященной 90 лет ГСЭС Ленинградской области «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Ленинградской области». – 2012. –с. 197-200.

11.  Краева высокоавидных антитоксических антител а оценке невосприимчивости к дифтерийной инфекии / , , // Материалы научно-практической конференции посвященной 90 лет ГСЭС Ленинградской области «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия Ленинградской области». – 2012. –с. 201-205.

Список сокращений:

АТ-АТ	Антитоксические антитела
ВА АТ-АТ	Высокоавидные антитоксические антитела
ИА	Индекс авидности
ИФА	Иммуноферментный анализ
МЕ	Международные единицы
ОСК	Образцы сыворотки крови
ПЦР	Полимеразная цепная реакция
РН	Реакция нейтрализации
РНГА	Реакция непрямой гемагглютинации
РПГА	Реакция пассивной гемагглютинации
ICS	Иммунохроматографический тест

[1] Выражаем благодарность врачам – бактериологам ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Вологодской области» и его филиалов в г. Череповец, г. Тотьма, г. Великий-Устюг, г. Кириллов, г. Сокол, а также диагностических лабораторий г. Вологды, предоставившим культуры бактерий для изучения.

[2] < 0,01 МЕ/мл – обследуемый восприимчив к дифтерии; 0,01 МЕ/мл – минимальная степень защиты;

0,01-0,09 МЕ/мл – некоторая степень защиты; 0,1-0,9 МЕ/мл – защитный уровень антител;

1,0 и > МЕ/мл - стойкая длительная невосприимчивость к дифтерии.