На правах рукописи
МОНДОДОЕВ АЛЕКСАНДР ГАВРИЛОВИЧ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ
ПОВРЕЖДЕНИЙ ПОЧЕК
РАСТИТЕЛЬНЫМИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ СРЕДСТВАМИ
14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Улан – Удэ -2009
Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
доктор медицинских наук, профессор
Ведущая организация:
ГОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Защита состоится « 03 » декабря 2009 года в 10 00часов на заседании диссертационного совета ДМ 003.028.02 в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН г. Улан – Удэ, .
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН, г. Улан – Удэ.
Автореферат разослан «_____»____________________2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Актуальность поиска путей повышения эффективности фармакотерапии заболеваний органов мочевыводящей системы определяется широкой распространенностью и наблюдающимся ростом больных с нефрологическим профилем расстройств в общей структуре заболеваемости. По статистическим данным в России за 2000 г. на 100 тыс. взрослого населения приходилось 8794,6 больных с заболеваниями мочевыделительной системы, а в 2006 г - 10444,3 (Здоровье населения России, 2000; 2006). Более того, имеются данные, что латентно протекающие нефропатии в 2,0 – 2,5 раз превышают число клинически выраженных форм (Зинкевич и соавт., 2004). Социальная значимость нефрологической патологии, помимо широкой распространенности, определяется также тем обстоятельством, что в последние десятилетия отмечается ее значительное омоложение. Так, по данным (2000) заболеваемость только инфекциями мочевых путей у детей достигает 2,8%, а по данным Н. Сигела (20,7%.
Заболевания почек, как правило, характеризуются тяжелым течением, развитием рецидивов заболевания, приводящих к длительной потере трудоспособности и инвалидизации (Мухин, Тареева, Шилов, 2002; Simon et al., 2004). При этом, несмотря на использование современных методов лечения, гломерулярные и тубулоинтерстициальные заболевания почек в 1,5 % случаев приводят к развитию почечной недостаточности, при которой летальность достигает 50 % (Рябов, 2000).
Помимо широкой распространенности нозологических форм заболеваний почек, поражения их встречаются при многих патологических состояниях: интоксикациях, шоковых состояниях, заболеваниях печени, сахарном диабете, тяжелых гестозах, коллагенозах и других системных заболеваниях (Мухин, Шестакова, 2000; Рогов, Гордовская, 2000; Бурневич и др., 2002; Полонский, 2002; Parving, 2000). Особую тревогу вызывает тот факт, что в последнее время все чаще встречаются случаи лекарственной нефропатии (Астахова, 2000; Краснова, Сагинова, 2007; Taber, Mueller, 2006). К числу лекарственных препаратов, оказывающих нефротоксическое действие, относятся антибиотики, нестероидные противовоспалительные средства, рентгеноконтрастные вещества, туберкулостатики, цитостатики, Н2 – блокаторы, психотропные препараты (Полонский, 2001; Ушкалова, 2001; Справочник Vidal, 2007; Huerta et all., 2005). При этом многие лекарственные средства оказывают как прямое нефротоксическое действие, связанное с их повреждающим влиянием на метаболические и транспортные системы нефронов, так и поражения интерстиция, сосудистой и эндокринной систем почек (Тареева и соавт., 2000; Mark, Parazella, 2003).
Нередко сама медикаментозная терапия нефропатий может явиться причиной развития рецидивов заболевания. В этой связи основным требованием к нефропротекторным средствам является отсутствие токсичности и нежелательных побочных явлений при их применении. Кроме того, сложный патогенез заболеваний почек предполагает комплексное фармакотерапевтическое воздействие на разные звенья патологического процесса. Этой задаче в полной мере отвечают средства природного происхождения, с чем связано значительное повышение интереса к использованию растительных средств. Вместе с этим, выбор препаратов, оказывающих комплексное нефропротекторное влияние, весьма ограничен. В России разрешено к применению только 4 наименования растительных средств (леспенефрил, леспефлан, канефрон, фларонин) (Пронченко, 2002; Регистр…, 2007).
Учитывая широкое распространение заболеваний почек, их прогрессирующее течение, приводящее к развитию почечной недостаточности, тяжелый медико-социальный прогноз, недостаточное количество нефропротекторных препаратов, актуальной задачей остается разработка и внедрение новых эффективных и безвредных лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний почек.
В связи с этим разработаны новые нефропротекторные средства растительного происхождения в виде сухих комплексных экстрактов, условно названных нефрофит, фитоуросепт и эксабол. Нефрофит получен из листьев ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.), травы горца птичьего (Polygonum aviculare L.), листьев толокнянки обыкновенной (Arctostaphyllos uva-ursi L.), травы десмодиума канадского (Desmodium canadensis (L.) D. S.), взятых в соотношении 4,0 : 3,5 : 2,0 : 0,5 масс. частей. В состав фитоуросепта входят экстракты из следующих видов растительного сырья: горца птичьего (Polygonum aviculare L.), толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva-ursi L.), брусники обыкновенной (Vaccinium vitis idaea L.), крапивы двудомной (Urtica dioica L.) и календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), взятых в соотношении 3,0 : 2,0 : 2,0 : 1,5 : 1,5 масс. частей. Эксабол представляет собой сухой экстракт из корней и корневищ сабельника болотного (Comarum palustre.L.). На способы получения сухих экстрактов и составляющих компонентов получены патенты РФ.
Целью исследования явилось определение фармакологических свойств, фармакотерапевтической эффективности нефрофита, фитоуросепта и эксабола при повреждениях почек и выявление возможных механизмов их нефропротекторного действия.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
· определить спектр фармакологических свойств полученных фитоэкстрактов;
· оценить фармакотерапевтическую эффективность указанных фитосредств при нефропатиях ишемической, токсической, иммунной, инфекционной и лекарственной этиологии;
· выявить общие закономерности в механизме нефропротекторного действия нефрофита, фитоуросепта и эксабола, а также особенности их влияния на течение патологического процесса в почках;
· сопоставить фармакотерапевтическую эффективность исследуемых средств и препаратов сравнения – леспенефрила и канефрона при экспериментальных повреждениях почек;
· оценить безопасность разработанных фитоэкстрактов;
Научная новизна. Разработанные фитоэкстракты обладают широким спектром фармакологических свойств: гипоазотемическим, противовоспалительным, мочегонным, иммуномодулирующим, антибактериальным, фибринолитическим, спазмолитическим, ангиопротекторным, мембраностабилизирующим, антиоксидантным; стимулируют энергетический обмен и процессы регенеративной репарации, повышают активность эндогенной антиоксидантной системы и неспецифическую сопротивляемость организма. Установлено, что испытуемые фитоэкстракты обладают выраженной фармакотерапевтической эффективностью при нефропатиях, способствуя нормализации морфофункционального состояния почек животных на более ранних сроках патологического процесса. Курсовое введение животным растительных средств в экспериментально-терапевтических дозах сопровождается уменьшением выраженности азотемии и протеинурии, повышением диуреза и экскреции электролитов, ускорением клубочковой фильтрации, снижением степени деструктивных изменений в почках. На фоне их введения ограничивается ранний апоптоз в нефронах, что опосредовано повышением энергетического потенциала клеток. Указанные средства обладают также значительным иммуномодулирующим потенциалом: повышают противоопухолевую цитотоксическую активность мононуклеарных клеток крови и препятствуют спонтанной и стимулированной конканавалином - А пролиферации лимфоцитов, модулируют активность макрофагального звена иммунитета; участвуют в подавлении фактора аутоиммунной перестройки организма, сопровождающей заболевания почек. Указанные фитосредства являются практически не токсичными веществами, их длительное введение не вызывает развития нежелательных побочных эффектов.
Установлено, что общим механизмом в нефропротекторном действии испытуемых фитоэкстрактов является наличие у них базисной мембраностабилизирующей активности, реализация которой связана с антиоксидантным действием комплекса биологически активных соединений, содержащихся в составе этих средств и оказывающих как прямое антирадикальное действие, так и опосредованное, связанное с повышением активности системы антиоксидантной защиты организма. Выявлены особенности фармакотерапевтического действия фитосредств: так, нефрофит оказывает более выраженную эффективность при ишемических и токсических повреждениях почек; фитоуросепт - при нефропатии инфекционно-воспалительного генеза, эксабол - при иммунных нарушениях. В целом, в работе показана возможность и целесообразность фармакотерапии и фармакопрофилактики заболеваний почек средствами растительного происхождения в виде сухих экстрактов: нефрофит, фитоуросепт и эксабол.
Практическое значение. На основании проведенных исследований разработан новый патогенетически обоснованный подход к фармакотерапии и профилактике заболеваний почек с использованием средств растительного происхождения, обладающих широким спектром фармакологических свойств, благодаря содержанию в них комплекса биологически активных веществ. На способы получения фитоэкстрактов получены патенты РФ.
Материалы по доклиническим испытаниям нефрофита, а также сухих экстрактов из растений, входящих в его состав: толокнянки обыкновенной и десмодиума канадского, ортосифона тычиночного и горца птичьего; фитоуросепта и эксабола представлены в Фармакологический комитет Минздравсоцразвития РФ для получения разрешения на их клиническое изучение в качестве лекарственных препаратов, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний почек. На способы получения сухих экстрактов и составляющих компонентов получены патенты РФ: № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 12.г.; № 000 от 01.01.2001 г.
Нефрофит и фитоуросепт по материалам исследований разрешены к применению в виде биологически активных добавок к пище (Регистрационные удостоверения № 000.Р643.07.2003., № 000.Р643.06.2003).
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета ГОУ ВПО «Бурятский государственный университет» Федерального агентства по образованию (акт внедрения от 01.01.2001).
Положения, выносимые на защиту:
· ведущим молекулярно-клеточным механизмом нефропротекторного влияния нефрофита, фитоуросепта и эксабола является их способность ингибировать процессы свободнорадикального окисления, представляющие собой неспецифическое звено в патогенезе повреждений почек различной этиологии (ишемической, токсической, бактериальной, иммунной);
· средства растительного происхождения (нефрофит, фитоуросепт, эксабол) проявляют широкий спектр фармакологических свойств: гипоазотемическое, диуретическое, противовоспалительное, спазмолитическое, антибактериальное, фибринолитическое, гиполипидемическое, мембраностабилизирующее, а также стимулируют процессы репаративной регенерации и энергетического обмена;
· курсовое введение животным при нефропатиях указанных фитосредств в экспериментально-терапевтических дозах способствует нормализации морфофункционального состояния почек на более ранних сроках патологического процесса;
· отличия фармакотерапевтического влияния фитосредств заключаются в том, что нефрофит оказывает более выраженную эффективность при ишемических и токсических повреждениях почек; фитоуросепт - при нефропатии инфекционно-воспалительного генеза, эксабол - при иммунных нарушениях.
· фармакотерапевтическая эффективность исследуемых средств превосходит таковую препаратов сравнения – леспенефрила и канефрона.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Всероссийских научных конференциях и конгрессах: “Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов» (Томск, 1994); “Экологическая патология: вопросы биохимии, фармакологии, клиники” (Чита, 1995); “Человек и лекарство” (Москва, 1996; 1997; 1998; 2005; 2008); «Новые научные технологии в дальневосточном регионе» (Благовещенск, 1999); «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине» (Улан-Удэ, 2003); «Диетическое питание и голодание» (Улан-Удэ, ); «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006); межрегиональных научно-практических конференциях: «Медицина завтрашнего дня» (Чита, ); “Актуальные проблемы клиники и экспериментальной медицины” (Иркутск, 1995); “Сохранение биологического разнообразия в Байкальском регионе: проблемы, подходы, практика” (Улан-Удэ, 1996); «Биологически активные добавки и перспективы их применения» (Улан-Удэ, 2001); международных конференциях и конгрессах: “Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); «Тибетская медицина» (Нью-Йорк, 2004); «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005); «Интеграция систем традиционной и современной медицины» (Улан-Батор, 2005); «Химия лекарственных растений и лекарства Монголии» (Улан-Батор, 2006); «Традиционная медицина: современное состояние и перспективы развития» (Улан-Удэ, 2008).
Работа выполнена в Отделе биологически активных веществ Института общей и экспериментальной биологии СО РАН в соответствии с программой № 6.11.1.3. «Молекулярно-клеточные механизмы повреждений органов мочеполовой системы и коррекция их средствами традиционной медицины».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 73 научных работ, из них: 17 статей – в периодических изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ; 2 монографии, получены 6 патентов РФ на изобретения и 1 положительное решение на получение патента РФ.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста, иллюстрирована 25 рисунками, 136 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 339 отечественных и 156 зарубежных источников информации.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования были использованы растительные полиэкстракты: нефрофит (условное название) и фитоуросепт (условное название), а также сухой экстракт из корней и корневищ сабельника болотного - эксабол (условное название).
Нефрофит представляет собой четырехкомпонентный сухой экстракт, полученный из сырья ортосифона тычиночного (Orthosiphon stamineus Benth.), горца птичьего (Polygonum aviculare L.), толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva- ursi L.) и десмодиума канадского (Desmodium canadense (L.) D. S.), взятых в соотношении 4,0 : 3,5 : 2,0 : 0,5 масс. частей. На способы получения сухих экстрактов из указанных растений получены патенты № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 01.01.2001 г.; № 000 от 01.01.2001 г. Основным действующим началом нефрофита является полифенольный комплекс. Стандартизация нефрофита проводится по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин и кверцетин.
Фитоуросепт представляет собой сухой экстракт из следующих видов растительного сырья: горца птичьего (Polygonum aviculare L.), толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva-ursi L.), брусники обыкновенной (Vaccinium vitis idaea L.), крапивы двудомной (Urtica dioica L.) и календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), взятых в соотношении 3,0 : 2,0 : 2,0 : 1,5 : 1,5 масс. частей. На способ получения фитоуросепта получен патент РФ № 000 от 01.01.2001 г. В состав экстракта входит сумма экстрактивных веществ, представленных комплексом веществ полифенольной природы. Стандартизация его осуществлена по сумме флавоноидов и фенологликозидов в пересчете на рутин и арбутин.
Эксабол представляет собой сухой экстракт, полученный из корней и корневищ сабельника болотного (Comarum palustre L.). На способ получения эксабола получен патент РФ № 000 от 01.01.2001 г. В составе экстракта сумма полифенольных соединений, аминокислоты, полисахариды. Стандартизация осуществляется по сумме полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин.
В качестве препаратов сравнения использовали леспенефрил (Франция) и канефрон (Германия), а также другие средства по условиям эксперимента в изоэффективных дозах. Перед применением настойки деалкоголизировали путем выпаривания на водяной бане до 1/10 от исходного объема, полученный остаток доводили дистиллированной водой до исходного объема (Руководство …, 2000).
Эксперименты выполнены на 1885 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 190 – 230 г; 120 мышах линии CBA и F1 (CBA x C57 B1/6) массой 18 – 20 г. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН на обычном для указанных видов животных рационе (Приказ МЗ СССР № 000 от 10.10.83 г.). Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 000 от 12.08.77 г.) и «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом. В работе были использованы также модельные системы и культуры тканей: 1 % суспензия эритроцитов донорской крови; культура мононуклеарных лейкоцитов (Boyum, 1968); суспензия липосом из яичного желтка (Лопухин и соавт., 1983); микросомальные препараты коры больших полушарий мозга человека; культуры условно-патогенных микроорганизмов; препараты отрезков тонкого кишечника белых крыс; биохимические тест-системы.
С целью оценки функционального состояния почек животных определяли: диурез по общепринятому методу без нагрузки и с 2,5 % водной нагрузкой (Берхин, Иванов, 1972); концентрацию катионов натрия и калия в моче - методом пламенной фотометрии на приборе “Flapho 4” (Германия). Депурационную функцию почек оценивали по содержанию мочевины и креатинина в сыворотке крови и моче - унифицированными методами с использованием наборов реактивов Био-Ла-Тест “Лахема”; содержание белка в моче - реакцией с сульфосалициловой кислотой (Меньшиков и соавт., 1987); оценку скорости клубочковой фильтрации (СКФ)- по клиренсу эндогенного креатинина; интенсивность канальцевой реабсорбции - общепринятым методом (Рябов, Наточин, 1997). Функциональное состояние печени животных оценивали по активности щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АлТ) и аспартатаминотрансферазы (АсТ) в сыворотке крови (Меньшиков и соавт., 1987); содержанию гликогена в печени (Seifter, 1953).
Изучение антиэкссудативной активности указанных средств проводили на моделях острого асептического воспаления задней конечности животного и острого перитонита. Асептическое воспаление моделировали путем однократного субплантарного введения в заднюю конечность белых крыс растворов: 3% формалина (Стрельников, 1960), 6% декстрана (Лещинский, 1976), 0,5 % гистамина гидрохлорида (Александров и соавт., 1986), 1 % раствора каррагенина (Winter, 1962) в объеме 0,1 мл. Острый перитонит у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 1 мл 0,2% раствора серебра нитрата (Александров и соавт., 1986). Оценку влияния указанных фитосредств на образование фиброзно-грануляционной ткани осуществляли по методу Ф. Тринус и соавт. (1975). Для определения влияния средств на процессы альтерации воспалительный процесс моделировали по методу Menkin (Ойвин, Шетель, 1961) путем подкожного введения белым крысам в область спины 0,5 мл 9 % раствора уксусной кислоты. Определение влияния растительных средств на сосудистую проницаемость осуществляли на модели 24-х часового иммобилизационного стресса у крыс с использованием метода меченых сосудов (Горизонтова и соавт., 1975). Влияние растительных средств на скорость циклооксигеназной реакции in vitro определяли полярографически по интенсивности поглощения кислорода (Vane, 1996).
Изучение антибактериальной активности указанных средств осуществляли методом двукратных серийных разведений в жидкой среде (Першин, 1971). В качестве тест-объектов использовали музейные штаммы: Escherichia coli 408, Staphylococcus aureus 209P, Proteus vulgaris H 50, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa. Микробная нагрузка составляла 250000 клеток в 1 мл.
Исследование спазмолитической активности растительных средств проводили на изолированном отрезке тонкой кишки белых крыс (Furchgott, 1967).
Определение мембраностабилизирующей активности данных фитосредств осуществляли по степени их влияния на перекисный и осмотического гемолиз эритроцитов (Ковалев и соавт., 1986).
Иммуномодулирующее действие растительных экстрактов оценивали по их влиянию на состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета на фоне иммунодефицита, вызванного введением классического иммунодепрессанта азатиоприна в объеме 0,1 мл/мышь в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней (Лазарева, Алехин, 1985). Состояние клеточного звена иммунного ответа определяли в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Петров и соавт., 1987), гуморального - по числу антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза (Cunningham, 1965), макрофагального - в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей в отношении Staphyllococcus aureus in vitro по методике (1976).
При исследовании стресспротективной активности фитоэкстрактов использовали модель иммобилизации белых крыс на спине в течение 24 часов с определением «триады Селье» и язвенного индекса Паулса (Амосова и соавт., 1998).
Изучение анаболической активности указанных средств проводили с использованием модели односторонней нефрэктомии. В гомогенате почек определяли содержание общего белка по методу Лоури (Lowry, 1951), концентрацию РНК и ДНК – по методу Шмидта, Тангаузена в модификации (1977).
Концентрацию общего холестерина (ОХ), триацилглицеридов (ТГ), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке крови определяли на биохимическом анализаторе «DIANA» с использованием аналитических наборов фирмы «Cormay» (Польша). Коэффициент атерогенности (КА) рассчитывали по формуле: КА = (ОХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП.
Показатели периферической крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе «Абакус», влияние испытуемых средств на показатели системы гемостаза у белых крыс определяли по методике Б. Беркарда в модификации (Методы…, 1993), также по скорости образования фибринового сгустка крови на тромбоэластографе «Тромб-2» (Россия).
Влияние указанных средств на интенсивность индуцированного апоптоза определяли по активности каспазы-3 с использованием набора реактивов «Caspase assay kit» (Sigma), концентрацию белка в пробах определяли по методу Thorne (1978).
Оценку влияния растительных средств на активность “ Na+, K+-АТФазы осуществляли с использованием пара-нитрофенилфосфатного метода (Болдырев, 1986).
Антиоксидантные свойства фитосредств оценивали по их влиянию на интенсивность образования продуктов свободнорадикального окисления (СРО) и эндогенную антиоксидантную систему (АОС) организма с использованием методов in vivo и in vitro. Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли спектрофотометрически в сыворотке крови (Asakawa, 1979) и в гомогенате почек (Стальная, Гаришвили, 1977). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом (Гаврилов, Мишкорудная, 1983). В эритроцитах определяли содержание восстановленного глутатиона (ВГ) (Anderson, 1989); активность супероксиддисмутазы (СОД) (Чевари и соавт., 1985), каталазы (Королюк и соавт., 1988), глутатионпероксидазы (ГП) (Flon, 1988). Определение влияния испытуемых средств на скорость генерации супероксидного анион-радикала (О2 - ) осуществляли по Nichikimi et al. (1972) и Chen A.-S. et al. (2003). Антирадикальную активность по отношению к NO· определяли по методу Govindarajan R. еt al. (2003); связывание H2O2 - по методу Chen A.-S. et al. (2003); общую антиоксидантную активность - по методу Кузьменко-Лаптева (1999). Определение влияния испытуемых фитосредств на Fe2+-индуцированную хемилюминесценцию плазмы крови и суспензии липосом проводили на приборе «Хемилюминометр РХL–01» (Россия) по общепринятому методу (Сергеев и соавт., 1991). Хелатирующие свойства фитосредств определяли фенантролиновым методом (Методы …, 1987).
Для патоморфологических исследований почки животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и фиксаторе Буэна (Микроскопическая техника…1975). Депарафинированные гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Киселева и соавт., 1983). Для проведения морфометрических исследований и микрофотографирования использовали цифровой микроскоп Motic DMW B1-223 с использованием программного обеспечения «Motic Images-2000».
Двустороннюю ишемию почек воспроизводили путем выделения почек крыс из жировой капс9). Сулемовый некронефроз у крыс вызывали однократным внутрибрюшинным введением водного раствора сулемы в дозе 2 мг/кг (Соколова и соавт., 1975). Модель гепаторенального синдрома воспроизводили путем подкожного введения крысам 50 % (V/V) масляного раствора углерода четыреххлористого из расчета 0,4 мл/100 г 4-х кратно, 1 раз в день (Руководство …, 2000). Нефрит Хеймана моделировали по методу J. Reynolds и C. Pusey в модификации (2000) путем двукратного введения смеси адъюванта Фрейнда и гомогената коркового слоя почек крысы. Лекарственные повреждения почек у животных вызывали внутримышечным введением канамицина (300 мг/кг), бруфена (6 мг/кг) внутрижелудочно (Руководство…, 2000); комплексом туберкулостатиков - изониазида (50 мг/кг), рифампицина (50 мг/кг), пиразинамида (1,5 мг/кг) внутрижелудочно (Скакун, Табачук, 1992); урографина (10 мл/кг) внутривенно однократно (Vari et al., 1988). Острый пиелонефрит у крыс воспроизводили путем наложения лигатуры на левый мочеточник на 24 часа, после чего в хвостовую вену за 1 час до снятия лигатуры вводили 1 мл суспензии E. coli с титром 5х108 микробных тел в 1 мл (Лисица, Рудзит, 1983). Индуцированный апоптоз у крыс воспроизводили путем ишемии/реперфузии почек (Kaushal et all, 1998).
Полученные в ходе экспериментов данные статистически обработаны с применением пакета прикладных программ «Ехсеl 2003». Различия считали значимым при вероятности 95 % (Р ≤ 0,05).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В серии предварительных экспериментов было установлено, что показатели острой токсичности испытуемых средств (DL50) при внутрибрюшинном введении белым крысам составила: у нефрофита - 1466,7 ± 319,3 мг/кг, у фитоуросепта - 550,0 ± 64,0 мг/кг, у эксабола - 370,5 ± 21,3 мг/кг. При внутрижелудочном введении фитоэкстрактов в максимально возможных дозах гибели животных не наблюдали, что позволяет отнести нефрофит к группе практически нетоксичных, а фитоуросепт и эксабол к группе малотоксичных веществ (Руководство…2000).
Исследование фармакологических свойств фитосредств
Установлено, что испытуемые средства при их однократном внутрижелудочном введении интактным белым крысам оказывают мочегонное и салуретическое (Na+–уретическое) действие, повышают скорость клубочковой фильтрации (СКФ) (табл. 1).
Таблица 1
Влияние фитосредств на диурез, салурез и СКФ у интактных крыс
Группы животных | Дозы, мг/кг | Показатели функционального состояния почек крыс, % от контроля | ||
Диурез | Na-урез | СКФ | ||
Интактная | - | 100 ± 6,35 | 100 ± 4,85 | 100 ± 7,34 |
Нефрофит | 50 | 108,9 ± 7,92 | - | - |
150 | 143,0 ± 9,87* | 127,7 ± 7,38* | 190,0 ±11,53* | |
300 | 137,5 ± 8,65* | - | - | |
Фитоуросепт | 25 | 103,8 ± 8,62 | - | - |
50 | 124,5 ± 6,68* | 129,0 ± 8,47* | 149,0 ± 9,38* | |
100 | 115,1 ± 8,54 | - | - | |
Эксабол | 50 | 114,2 ± 7,56 | - | - |
100 | 127,8 ± 9,28* | 112,5 ± 10,67 | 150,8 ± 10,31* | |
150 | 117,7±8,90 | - | - |
Примечание: * - здесь и далее, значения, достоверно отличающиеся от данных контрольной группы при Р ≤ 0,05.
Как следует из данных, приведенных в таблице 1, введение животным указанных средств в малых дозах не оказывает существенного влияния на водовыделительную функцию почек белых крыс, тогда как при их введении в более высоких дозах отмечается достоверный дозозависимый диуретический эффект. В связи с тем, что наиболее выраженная диуретическая активность выявлена для нефрофита в дозе 150 мг/кг, фитоуросепта - в дозе 50 мг/кг, эксабола – в дозе 100 мг/кг указанные дозы были использованы в дальнейших экспериментах в качестве экспериментально-терапевтических. Повышение водовыделительной функции почек под их влиянием обусловлено преимущественно увеличением скорости клубочковой фильтрации, а также ускорением натрийуреза у нефрофита и фитоуросепта.
Испытуемые средства в экспериментально-терапевтических дозах проявляют выраженную противовоспалительную активность, снижая степень экссудативных и альтеративных процессов при введении провоспалительных агентов, также под их влиянием ускоряется регенерация тканей (табл. 2). При этом по ряду параметров эффективность испытуемых средств превосходила таковую у препарата сравнения – калефлона.
Кроме того, для эксабола установлено наличие анальгетической и жаропонижающей активности, сопоставимой по эффективности с натрия метамизолом.
Таблица 2
Влияние фитосредств на процессы экссудации, альтерации и регенерации при асептическом воспалении у белых крыс
Группы животных | Доза, мг/кг | % угнетения отека от контроля | Сокращение площади альтерации, % от контроля | ||||
формалин | декстран | гистамин | 2 сутки | 9 сутки | 25 сутки | ||
Нефрофит | 150 | 14,5±1,06* | 15,0±1,15* | 22,0±1.56* | - | 41,0±2,34* | 40,3±3,45* |
Фитоуросепт | 50 | 15,1±1,07* | 14,5±1,76 | 27,8±1,95* | 37,1±2,67* | 42,8±3,76* | 45,5±3,21* |
Эксабол | 100 | 26,7±1,82* | 24,0±1,67* | 31,5±2,45* | 44,6±3,17* | 42,9±2,83* | 35,2±3,05* |
Калефлон | 100 | 10,8±1,89 | 12,5±1,45 | 17,0±2,78 | 48,8±3,28 | 48,2±4,21 | 40,5±3,62 |
Также показано, что экстракт сабельника снижает скорость образования циклооксигеназы в модельной системе на 18% при его концентрации 7 мг/мл пробы. С использованием модели «меченых сосудов» установлено, что все испытуемые средства оказывают сосудоукрепляющее действие, о чем свидетельствует снижение степени импрегнации черной туши в брыжейке на фоне иммобилизационного стресса, а также уменьшение объема перитонеального экссудата и количества дегранулированных тучных клеток при асептическом перитоните у крыс.
Изучение антимикробной активности фитоэкстрактов показало, что испытуемые средства обладают антибактериальными свойствами по отношению к Staphylococcus aureus 209 p, Proteus vulgaris H50, Escherichia coli - 408, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa (табл. 3). Как следует из указанной таблицы, наиболее выраженную антибактериальную активность проявляет фитоуросепт, ингибируя рост указанных штаммов бактерий в концентрациях 0,62 - 5,00 мг/мл. Кроме того, установлено, что фитоуросепт обладает синергидным действием с антибиотиками (полусинтетическими пенициллинами и цефалоспоринами) по отношению к кишечной палочке и золотистому стафилококку.
Таблица 3
Антибактериальные свойства фитосредств
Фитосредства | Бактерицидное действие экстрактов, мг/мл | ||||
Staph. аureus | Pr. vulgaris | Esch. сoli | Str. faecalis | Ps. aeruginosa | |
Нефрофит | 25,00 | 12,50 | - | 25,00 | 25,00 |
Фитоуросепт | 1,25 | 5,00 | 1,25 | 2,50 | 0,62 |
Эксабол | 12,50 | 12,50 | 12,50 | 12,50 | 12,50 |
При исследовании спазмолитической активности указанных средств установлено, что под влиянием нефрофита сокращения препарата тонкого кишечника, индуцированные карбахолином, уменьшаются на 34% по сравнению с контролем. Для фитоуросепта и эксабола статистически значимая спазмолитическая активность не установлена (Р≥0,05).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 |
