Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию
Саратовский государственный технический университет
МИКРОБИОЛОГИЯ
Часть 2
Методические указания
к выполнению лабораторных работ и контрольные задания
по дисциплине
«Основы микробиологии и биотехнологии»
для студентов специальности 280201 «Охрана окружающей среды
и рациональное использование природных ресурсов»
Одобрено
редакционно-издательским советом
Саратовского государственного
технического университета
Саратов 2007
Лабораторная работа №5
Молочнокислое брожение. Приготовление препарата молочнокислых бактерий.
Цель занятия: поставить культуры на молочнокислое брожение, с помощью микроскопирования выявить виды молочнокислых микроорганизмов, провести качественное и количественное определение молочной кислоты в молоке качественными реакциями.
Оборудование и материалы: cСвежее молоко, колбы на 100 мл, цилиндры на 100 мл, пипетки на 5 и 10 мл; 0,.1 н. раствор NaOH, фенолфталеин, треножники с сеткой, микроскопы, воронки, фильтры, 10% - ныйй раствор AgNO3, 13% - ный раствор NH4OH, H2SO4 (плотность 1.84); 0,.2% - ный спиртовой раствор тиофена, 5% - ный раствор KMnO4, метиленовый синий.
Вводные поясненияОсновные понятия
Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения овощей, переработки молока в молочнокислые продукты и сыр; кислый вкус черного хлеба определяется молочной кислотой. Эти процессы вызывают молочнокислые бактерии.
Молочнокислые бактерии обитают на поверхности растений, в молоке, на пищевых продуктах, в кишечнике человека и животных. Они имеют общие признаки:
· способность к синтезу молочной кислоты;
· грамположительность;
· отсутствие спор;
· неподвижность;
· форма (кокки или палочки);
· требовательность к источникам азота;
· отсутствие фермента каталазы;
· способность к расщеплению перекиси водорода до воды и кислорода.
Молочнокислые бактерии можно разделить на две группы:
гомоферментативные, образующие из сахара в основном одну молочную кислоту
C6H12O6=2CH3CHOHCOOH; (5.1)
гетероферментативные, образующие наряду с молочной кислотой побочные продукты;
C6H12O6→ CH3CHOHCOOH + CH3COOH+CH3CH2OH + CO2; (5.21);
2C6H12O6=2CH3CHOHCOOH + 3CH3COOH+CH3CH2OH. (бифидобактерии) (5.3)(бифидоброжение) (2)
Молочнокислые бактерии сбраживают моно - и дисахариды. Чаще бактерии, обитающие в молоке, сбраживают лактозу, но никак не воздействуют или слабо воздействуют на сахарозу. Обычно лактоза подвергается гидролизу с образованием глюкозы и галактозы, а затем уже происходит брожение.
Источниками азота для группы молочнокислых бактерий служат пептоны, смесь аминокислот.
При изучении молочнокислого брожения лучшая питательная среда – молоко. В нем есть все необходимые для развития молочнокислых бактерий элементы. В такой среде могут развиваться и другие бактерии (гнилостные, маслянокислые), но молочная кислота быстро подавляет их рост.
Постановка опыта на молочнокислое брожение
1. Определяют начальную кислотность молока титрованием 0,.1 н. раствором NaOH.
2. Разливают молоко в колбы Эрленмейера на 100 мл по 40-50 мл и закрывают ватными пробками. Параллельно молоко в колбах ставят на асбестовые сетки и доводят молоко до кипения.
3. Колбы с кипяченым и некипяченым молоком помещают в термостат при 30ºС.
Через 10-12 ч. некипяченое молоко скисает. В колбе образуется ровный плотный сгусток без следов газа. Сгусток получается в результате реакции молочной кислоты с казеинатом кальция и выпадения казеиновой кислоты в осадок.
При кипячении молока молочнокислые бактерии, поскольку они не образуют спор, погибают, споры маслянокислых бактерий сохраняются. При инкубации в термостате они прорастают и осуществляют маслянокислое брожение лактозы. В результате реакции масляной кислоты с казеинатом кальция казеиновая кислота выпадает в осадок. В дальнейшем она подвергается пептонизации, в результате чего сыворотка приобретает кремовый цвет, неприятный запах и прогорклый вкус.
Микроскопирование молочнокислых бактерий
При хранении простокваши или рассола квашеных огурцов на поверхности образуется морщинистая пленка. Это молочная плесень – Geotrichum candidum, которая всегда сопутствует молочнокислому брожению, являясь его нежелательным спутником. Она окисляет молочную кислоту до углекислого газа и воды, снижая кислотность среды. В результате кисломолочные и квашеные продукты портятся, так как в среде происходит развитие гнилостных бактерий.
Молочная плесень – аэробная форма, поэтому развивается только на поверхности.
Для микроскопирования готовят препарат из прокисшего молока. Бактериологическую петлю вводят в сгусток и, повернув вокруг оси, извлекают, прикасаясь ею к пленке, которую образует молочная плесень. Сгусток размазывают по предметному стеклу очень тонким слоем без воды. Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с эфиром (1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая ее. При такой фиксации не только погибают и прикрепляются к стеклу бактерии, но и с помощью эфира извлекается и удерживается жир, капли которого на препарате мешают окраске и микроскопированию.
Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим 2-3 мин, промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией. Метиленовый синий – лучший краситель для молочнокислых бактерий молока, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо – клетки микроорганизмов. На препарате преобладают мелкие округлые клетки Lactococcus lactis. Это возбудитель естественного скисания молока. Оптимальная температура для ее развития Lactococcus lactis – 30 ºС. Она способствует накоплению в молоке до 1% молочной кислоты. Часто в препарате можно увидеть палочки правильной формы рода Lactobacillus. Оптимальная температура ее развития –- 40 ºС. Молочная плесень имеет прямоугольные или овальные клетки большого размера.
Качественные реакции на молочную кислоту.
Определение ее количества
Количество молочной кислоты устанавливают по разности между объемами 0.,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование молока в конце опыта, и при его постановке.
Для титрования берут 5-10 мл свежего или прокисшего молока, помещают его в колбу Эрленмейера на 100 мл, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1-2 капли фенолфталеина и титруют 0,.1 н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления устойчивой слабо-розовой окраски. Если на поверхности прокисшего молока образовалась пленка, то, прежде чем взять сгусток, ее сдвигают пипеткой или стеклянной палочкой в сторону, затем разбивают сгусток, постукивая колбой о ладонь.
Кислотность молока выражают в градусах Тернера (ºТ) или процентах молочной кислоты. Так, 1 ºТ соответствует 1мл 0.,1 н. раствора щелочи, пошедшей на титрование 100 мл молока.
Следовательно, если на титрование 10 мл молока пошло x мл щелочи, то для выражения кислотности молока в градусах Тернера нужно значение x умножить на 10.
1.Чтобы выразить кислотность в процентах молочной кислоты, количество 0,.1 н. раствора NaOH (в мл), потраченное на титрование 100 мл молока, умножают на 0,.009, так как 1 мл 0,.1 н. NaOH нейтрализует эквивалентное количество молочной кислоты. Молекулярная масса молочной кислоты составляет 90. Для приготовления 1 л 1 н. раствора требуется 90 г кислоты. В 1 л 0,.1 н. раствора содержится 9 г, а в 1 мл – 0,.009 г молочной кислоты. После определения титруемой кислотности оставшееся скисшее молоко отфильтровывают через бумажный фильтр. Фильтрат используют для качественных реакций на молочную кислоту.
1.1. Реакция «серебряного зеркала». В коническую колбу на 100 мл набирают пипеткой 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты и нагревают на асбестовой сетке до начала кипения, периодически взбалтывая. Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5 мл 5% –- ного раствора KMnO4, который при этом обесцвечивается. В результате молочная кислота превращается в уксусный альдегид.
Происходящие химические реакции можно выразить следующими уравнениями:
2KMnO4 + 3H2SO4 = K2SO4 +2MnSO4 + 3H2O + 5O; (5.43)
5 CH3CHOHCOOH + 5O = 5CH3CHO + 5CO2 + 5H2O. (5.54)
Для распознавания уксусного альдегида горлышко колбы без промедления накрывают фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором AgNO3.
Аммиачный раствор нитрата серебра готовят следующим образом: к 1-2 мл 10 %-ного раствора AgNO3 в пробирке добавляют по каплям аммиак: появляется осадок Ag2O, который затем растворяется в избытке аммиака.
Аккуратно, чтобы не разорвать, фильтровальную бумагу прижимают к краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается и, реагируя с аммиачным раствором AgNO3, вызывает почернение бумаги, имеющее серебристый оттенок, –- это выделяется металлическое серебро.
2. Реакция с тиофеном. В пробирку к 1-2 мл фильтрата прибавляют 5 мл концентрированной серной кислоты и 0.5 мл насыщенного раствора CuSO4. Смесь взбалтывают, нагревают 5 мин на водяной бане при 100 ºС и после охлаждения добавляют к ней несколько капель 0,.2 %-ного спиртового раствора тиофена. В присутствии молочной кислоты наблюдается вишнево-красное окрашивание. Реакция очень чувствительна и специфична.
Контрольные вопросы
1. Какие микроорганизмы являются возбудителями молочнокислого брожения?
2. На какие группы делят молочнокислые микроорганизмы? Чем определяется такое деление?
3. Какими способами определяют количество молочной кислоты, образованной микроорганизмами?
4. Какие существуют качественные реакции для определения содержания молочной кислоты в молоке?
5. Для чего существует необходимость контроля количества молочной кислоты в молочных продуктах?
Лабораторная работа №6
Маслянокислое брожение. Приготовление препарата маслянокислых бактерий.
Цель занятия: поставить культуры на маслянокислое брожение, с помощью микроскопирования выявить виды маслянокислых микроорганизмов, провести качественное определение масляной кислоты в культивируемой среде.
Оборудование и материалы: картофель, колбы, зажимы, пробки и трубки, пипетки, пробирки, водяная баня, раствор Люголя, 5%-й раствор FeCl3, предметные и покровные стекла, микроскопы.
Основные понятияВводные пояснения
Микробы, вызывающие маслянокислое брожение (Cl. butyricum, Cl. pasteurianum, Cl. pectinovorum и др.), относятся к облигатным анаэробам. Они встречаются в почве, навозе, на различных предметах. Под действием маслянокислых микробов происходит распад сахара на масляную кислоту, уксусную кислоту и газы:
4С6Н12О6 → 3СН3СН2СН2СООН + 2CH3COOH +8СО2 + 8Н2. (6.15)
Энергетическим материалом для маслянокислых бактерий служит крахмал, водорастворимые углеводы (декстрины), органические кислоты (молочная, пировиноградная) и спирты (маннит, глицерин). В качестве источника азота бактерии используют самые различные азотистые соединения: пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые – даже атмосферный азот.
Характерная особенность маслянокислых бактерий – способность накапливать в клетках гранулезу перед образованием спор.
Постановка опыта на маслянокислое брожение
Для изучения маслянокислого брожения предложено много сред, но наиболее простой и доступной из них является картофельная.
Сырой, неочищенный картофель нарезают мелкими кусочками (кубиками), которые помещают в широкие микробиологические пробирки (на 1/4 объема), затем добавляют 1/3 часть чайной ложки мела, на 2/3 объема пробирки заливают водопроводной водой и ставят на 10 мин в водяную баню, температура в которой 80°С. Если картофель вымыт и очищен, в среду добавляют немного (четверть чайной ложки) почвы.
После пастеризации пробирки переносят в термостат (35°С). Через 2-3 суток развиваются маслянокислые бациллы. В процессе брожения образуются газы СО2 и Н2. которые поднимаются вверх, а вместе с ними кусочки картофеля.
Микроскопирование маслянокислых бактерий
Питательную среду из пробирки с картофелем берут пипеткой, закрыв указательным пальцем верхний конец и погрузив ее кончик в средний слой сброженной жидкости. Слегка приподняв палец, набирают в пипетку жидкость, снова зажимают пальцем верхний конец пипетки и, вынув ее из колбы, наносят каплю на предметное стекло. К накопительной культуре добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом, на которое наносят каплю кедрового масла.
В клетках можно заметить овальные тельца, сильно преломляющие свет. Это споры. В тех местах клетки, где содержится гранулеза, возникает сине-фиолетовое окрашивание.
Качественные реакции на масляную кислоту.
Определение ее количества
1.1. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl3). В пробирку наливают 3-5 мл сброженной жидкости, добавляют 1-2 мл 5%-ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению:
3Ca(CH3CH2COO)2 + 2 FeCl3 =2Fe(CH3CH2COO)3 + 3CaCl2. (6.2)
Раствор масляно - кислого железа в отраженном свете имеет буровато-коричневый цвет, а в проходящем свете – кроваво-красный.
2. 2. Получение масляноэтилового эфира (ананасовой эссенции). К 3-5 мл культуральной жидкости в пробирке прибавляют 0,.5 мл 96%-ного этилового спирта и 1-2 мл концентрированной серной кислоты. При взбалтывании и нагревании появляется характерный запах эфира (запах ананаса).
Реакция протекает по уравнению:
Ca(CH3CH2CH2COO)2 + 2CH3CH2OH = 2CH3CH2CH2COOCH2CH3+ Ca(OH)2 (6.37)
Контрольные вопросы
1.1. Какие микроорганизмы являются возбудителями маслянокислого брожения?
2.2. Какие соединения используют маслянокислые бактерии в качестве источника азота?
3.3. В какой цвет окрашивает раствор Люголя клетки маслянокислых бактерий, почему?
4.4. Назовите качественные реакции определения масляной кислоты.
Лабораторная работа №7
Спиртовое брожение. Дрожжи и их свойства
Цель занятия: поставить процесс спиртового брожения, ознакомиться с методами определения интенсивности брожения и количества диоксида углерода; с помощью микроскопирования дрожжей определить клетки в стадии почкования.
Оборудование и материалы: питательная среда с сахарозой, дрожжи, плоскодонные колбы с затвором Мейссля, весы и разновесы, цилиндры на 100 мл, микроскопы, колба на 700-800 мл, отгонный аппарат Либиха, 20%-ный раствор Na2CO3,, кристаллический йод, водяная баня, стеклянный шпатель.
Вводные пояснения
Основные понятия
Спиртовое брожение – это процесс превращения углеводов, вызываемый дрожжами, некоторыми видами бактерий (Zymomonas mobilis, Sarcina ventriculi и др.) и отдельными представителями мукоровых грибов. Однако практическое значение имеет спиртовое брожение, осуществляемое дрожжами.
Дрожжи встречаются на поверхности растений, плодов, ягод, зерен, в воздухе и почве. Это одноклеточные неподвижные организмы диаметром 8-15 мкм. Клетки дрожжей округлой, овальной или несколько удлиненной формы, содержат хорошо заметное под микроскопом ядро. В них встречаются различные включения: капли жира и валютина, сильно преломляющие свет; гликоген.
Дрожжи обычно размножаются бесполым путем: почкованием (Saccaromyces и др.), реже – делением (Schizosaccharomyces), но способны и к спорообразованию. Споры могут формироваться как без предварительного слияния двух клеток, так и после полового процесса, т. е. в результате слияния содержимого двух клеток. Однако образование спор у дрожжей наблюдается редко. Их появлению способствуюет резкий переход культуры с богатого питательного субстрата на бедный и хорошая аэрация.
Дрожжи сбраживают углеводы (моно - и дисахариды) с образованием этилового спирта по схеме:
C6H12O6 = 2CH3CH2OH+2CO2. (7.18)
Источником азота служат пептоны, аминокислоты и аммонийные соли. Дрожжи дезаминируют аминокислоты, потребляя освобождающийся при этом азот. Образующиеся в процессе реакции высокомолекулярные спирты составляют главную часть сивушных масел. Дрожжи лучше развиваются при pH 4-6, устойчивы к высоким концентрациям сахара (до 705) и спирта (до 14%).
Спиртовое брожение лежит в основе виноделия, пивоварения. В хлебопекарной промышленности дрожжи выполняют роль биологических разрыхлителей теста: при брожении и дыхании образуется диоксид углерода, благодаря чему увеличиваются объем теста при выпечке и пористость хлеба. Большинство видов культурных дрожжей, используемых в бродильных производствах, принадлежит к роду Saccaromyces.
В пивоварении главное внимание обращают на полноту сбраживания мальтозы. В виноделии ценными оказываются побочные продукты, создающие «букет» вина.
Постановка опыта на спиртовое брожение
Используют синтетическую среду следующего состава (в объемных процентах): сахароза –- 15,.0; пептон – 0,.5; KH2PO4 – 0,.3; MgSO4 – 0,.1.
Опыт ставят в нестерильных условиях, однако благодаря созданию элективных условий – учету избирательных потребностей возбудителей спиртового брожения – в среде будут развиваться преимущественно дрожжи. При этом жизнедеятельность других групп микроорганизмов будет подавлена.
100 мл среды наливают в колбу Эрленмейера или другую плоскодонную колбу на 250-300 мл и вносят туда около 0,.5 г прессованных или щепотку сухих дрожжей.
Колбу закрывают каучуковой пробкой, в которую вставлен затвор Мейссля с резиновым клапаном Бунзена. Ее взвешивают на технических весах с точностью до 0,.01 г и ставят в термостат при 25 ºС.
К условиям, способствующим преимущественному развитию дрожжей по сравнению с другими микроорганизмами, относятся: высокая концентрация сахара, слегка кислая реакция среды, анаэробные условия, накопление значительного количества спирта. Сумма этих факторов делает среду элективной для дрожжей.
Определение CO2
Диоксид углерода, образующийся при брожении, определяют по разности массы колбы при постановки опыта и после его окончания. Завершение процесса брожения устанавливают по прекращению газообразования. Брожение обычно продолжается 2-3 дня.
Почти 50% сброженного сахара превращается в диоксид углерода:
C6H12O6 = 2CH3CH2OH+2CO2 (7.28)
Молекулярные массы ××44)
В опыте среда содержит 15 г сахара. При этом может выделиться 7-7.5 г CO2. Расчет количества образовавшегося спирта и сброженного сахара проводят, исходя из массы выделившегося диоксида углерода в соответствии с уравнением спиртового брожения.
Пример расчета. В процессе брожения образовалось 6 г CO2. Находим массы выделившегося спирта (x) и сброженного сахара (y):
88г CO2 соответствуют 92 г CH3CH2OH
6г CO2 x CH3CH2OH
x=6,.3 (г);
88г CO2 соответствуют 180 г C6H12O6
6г CO2 y C6H12O6
y=12,.3 (г).
Определение интенсивности брожения
Под интенсивностью брожения понимают отношение массы сброженного за определенный промежуток времени сахара к исходному его количеству в процентах.
Пример расчета. Если бы за время инкубации подверглись брожению все 15 г сахара, то интенсивность брожения составила бы 100%. В результате же опыта было сброжено 12,.3 г сахара:
15 г сахара соответствуют 100% интенсивности брожения
12,.3 г сахара…………… x интенсивности брожения
x=82 (%).
Микроскопирование дрожжей
Готовят препарат из бродящей жидкости. Каплю стеклянной палочкой наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и после нанесения капли кедрового маслао микроскопируют с иммерсионной системой объектива. При микроскопировании препарата в раздавленной капле конденсор следует немного опустить. На препарате надо найти капли в стадии почкования и зарисовать их – это Saccaromyces cerevisiae.
Определение этилового спирта
После взвешивания бродильных колб и определения CO2 культуральную жидкость переносят в плоскодонную круглую колбу на 700-800 мл для отгонки этилового спирта.
Колбу соединяют с обратным холодильником, устанавливают на асбестовой сетке над газовой горелкой и начинают нагревать. Жидкость закипает. Спирт улетучивается вместе с парами воды и, охлаждаясь в холодильнике, каплями стекает в приемную колбу.
При анализе можно получить несколько последовательных порций отгона. Для этого ставят 3-4 приемные колбы и в каждую набирают примерно 10-15 мл отгона. Пробы из разных порций наносят на фарфоровую пластину и поджигают. Первые порции отгона горят интенсивнее, так как они содержат больше спирта, чем последующие. Первые 2-3 фракции используют для проведения качественных реакций на этиловый спирт.
Качественные реакции на этиловый спирт
1.1 Берут в пробирку 3-5 мл отгона, прибавляют столько же 20%-ного раствора Na2CO3 и около 0,.1 г кристаллического иода в порошке. Смесь взбалтывают, нагревают на водяной бане при 60-70 ºС до полного растворения йода и его обесцвечивания. При охлаждении раствора в осадок выпадают мелкие светло-желтые кристаллы йодоформа, имеющего характерный резкий запах. Процесс происходит по следующей схеме:
CH3CH2OH +J2= CH3CHO+2HJ; (7.39)
CH3CHO+3J2 = CJ3CHO+3HJ; (7.410)
CJ3CHO+ NaOH = CHJ3 + HCOONa. (7.511)
Из летучих органических соединений положительную йодоформную пробу дают уксусный альдегид и ацетон. В их отсутствии в отгоне убеждаются при помощи фуксинсернистой кислоты или аммиачного раствора серебра. При наличиие альдегидов фуксинсернистая кислота краснеет, а аммиачный раствор серебра чернеет вследствие выпадения металлического серебра в осадок.
2. К 5 мл отгона прибавляют несколько капель 10%-ного раствора H2SO4 и небольшой кристалл K2Cr2O7. При слабом нагревании образуется уксусный альдегид, температура кипения которого 21 ºС. Для его обнаружения отверстие пробирки покрывают фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором нитрата серебра. При образовании уксусного альдегида, а значит, и при наличии спирта, бумага чернеет.
1.Контрольные вопросы
1.
2.Какие организмы относят к роду дрожжей?
3.2. Перечислите способы размножения дрожжей.
4.3. Какие продукты реакции образуются при сбраживании углеводов?
5.4. Какую роль выполняют дрожжи в хлебопекарной промышленности?
6.5. Какие факторы среды способствуют преимущественному развитию дрожжей?
7.6. Что понимают под интенсивностью брожения?
7.7. Какие качественные реакции существуют для обнаружения этилового спирта?
8.
Лабораторная работа №8
Методы микробиологического исследования воды,
воздуха и почвы
Цель занятия: ознакомиться с правилами взятия и пересылки проб воды для исследования; определить микробное число воды: исследовать воздух седиментационным (метод Коха) и фильтрационным (прибором Дьякова) методами.
Оборудование и материалы: стерильные чашки Петри, пробирки с МПА, стерильные пробирки, микробиологические петли, пинцеты, иглы, шпатели, карандаши по стеклу, спиртовки, спички, стекла предметные и покровные песочные часы.
Микробиологическое исследование воды
Исследование воды проводят с целью выявления общей микробной загрязненности, обнаружения в ней патогенных микробов и установления наличия в ней кишечной палочки (определения коли-титра). Воду для исследования берут из открытых водоемов и из водопровода. Для взятия проб с глубины используют специальные приборы (батометры), которые опускают на тросах на определенную глубину. На глубине прибор открывается, и в него набирается вода, после чего его поднимают на поверхность.
Взятие проб из открытых водоемов. При взятии проб воды необходимо соблюдать определенные правила.
1. Если имеется источник загрязнения, то из таких водоемов берут три пробы воды: выше источника загрязнения, против него и ниже по течению.
2. Пробы воды из колодцев берут 2 раза: утром до начала разбора воды и вечером после разбора.
3. Из рек, озер, и прудов воду берут на глубине 0,5-1 м от поверхности и на расстоянии 1-2 м от берега.
1.Пробы воды берут в хорошо вымытые (желательно стерильные) стеклянные бутыли с притертыми пробками. Для анализа необходимо от 2-х и более литров воды. К каждой пробе воды прилагают сопроводительную ведомость, в которой отмечают:
2.1.) Ннаименование источника и место его нахождения;.
3.2.) Ггод, месяц, число и час взятия пробы;.
4.3.) Мместо взятия пробы (расстояние от берега и глубина);.
5.4.) Ттемпература воздуха, сведения об осадках в день взятия пробы и за последние десять дней;.
6.5.) Ттемпература воды при отборе пробы;.
7.6.) Ккраткое описание водоема;.
7.) Ддля какой цели направляется.;
8.) 8. Ддолжность и место службы лица, взявшего пробу, и его подпись.
Пробы воды в лабораторию доставляются немедленно, зимой их предохраняют от замерзания, летом – от перегревания.
Исследование водопроводной воды. В течение 1-15 мин воду спускают из водопроводной трубы, после чего пламенем горелки (спиртовки) обжигают кран. Воду набирают в стерильную колбу, заранее готовят две пробирки со стерильной водой, три стерильные чашки Петри и три пипетки.
Из колбы, в которую отобрана вода для исследования, пипеткой берут 2 мл; 1 мл вносят в стерильную чашку и 1 мл – в первую пробирку с 9 мл стерильной воды. Второй пипеткой воду перемешивают в первой пробирке. Получается разведение 1:10. Затем этой же пипеткой 1 мл разведения переносят во вторую стерильную чашку и 1 мл – во вторую пробирку с 9 мл стерильной воды, но не перемешивают. Третьей пипеткой перемешивают воду во второй пробирке (разведение 10-2) – 1 мл переносят в третью чашку.
После внесения в каждую чашку по 1 мл воды в разведениях 10-2,10-1 и неразведенной выливают по 10-12 мл расплавленного и охлажденного до 45°С МПА. Чашку быстро закрывают и вращательными движениями перемешивают расплавленный МПА с водой. На чашке подписывают фамилию студента, разведение, указывают дату посева. Чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат при температуре 35...37°С. По количеству выросших колоний, с учетом разведения, судят о содержании микробов в засеянном объеме воды.
Микробиологическое исследование воздуха
Наиболее простым методом является седиментационный – оседание микробов по Коху. При использовании этого метода чашки Петри с питательной средой открывают на 5 мин, а иногда на более продолжительное время (в зависимости от загрязнения), в том помещении, где необходимо определить чистоту воздуха. Чашки закрывают и ставят в термостат при температуре 30...35°С на 2-3 суток. Подсчет колоний проводят на всей поверхности чашки. Считают, что из каждой живой клетки вырастает колония. Примерно на площади 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха, а в кубическом метре – в 100 раз больше.
Воздух можно исследовать и седиментационно-аспирационным методом с помощью прибора Кротова. При этом получаются более точные результаты. Прибор состоит из приспособления для отбора проб воздуха, микроманометра и питающего механизма (электрической части). В крышке приспособления для отбора проб имеется радиально расположенная щель, через которую поступает воздух. Принудительное поступление воздуха через щель осуществляется вентилятором, который делает около 4·10-3-5·10-3 об/мин. Воздух соприкасается с поверхностью среды, оставляя на ней микроорганизмы. Чашка со средой тоже вращается вихревым потоком воздуха со скоростью 60 об/мин. Засасываемый через щель воздух выходит через два штуцера. Один из них сообщается с внешней средой, другой через резиновую трубку – с микроманометром. Движением воздуха керосин, подкрашенный Суданом III, поднимается по капилляру микроманометра. Вдоль капилляра на плексигласовой пластинке нанесены деления от 0 до 50, которые обозначают количество литров воздуха, способных пройти за одну минуту через щель крышки узла отбора проб.
В других моделях прибора внутри вертикально расположенного плексигласового цилиндра (ротаметр) вместо подкрашенного керосина перемещается облегченный металлический поршень. Изменяя просвет штуцера, соединенного с цилиндром, можно регулировать высоту поршня и по обозначениям определить, какое количество воздуха (л/мин) проходит через щель крышки. Для определения объема прошедшего воздуха необходимо показания на шкале умножить на число минут. Содержание микробов в 1 л воздуха определяется делением выросших колоний на количество прошедшего воздуха. Для определения микробов в 1 м3 полученное число умножают на 1000.
Загрязненность воздуха микробами можно оценить также фильтрационными методами. Один из них предложен Дьяковым. По этому методу определенный объем воздуха пропускают через стерильную питательную среду (мясопептонный бульон) или изотонический раствор хлорида натрия и стеклянные бусы. После тщательного перемешивания среды и проникших в нее микробов воздуха 1 мл такой смеси вносят в стерильную чашку Петри. Заливают расплавленным и охлажденным до 40...45°С мясопептонным агаром, среду равномерно распределяют вращательными движениями по дну чашки и оставляют до уплотнения. Чашки, перевернутые вверх дном, помещают в термостат при температуре 35...37°С. Через 2-3 суток подсчитывают выросшие колонии. Учитывая количество пропущенного воздуха и объем среды, определяют число живых микробных клеток в 1 м3 воздуха.
Вместо жидкой среды для определения микробов в воздухе можно использовать сухие сыпучие вещества (порошок сахара), которым и заполняют стерильные стеклянные трубки. После пропускания определенного объема воздуха через такую трубку порошок сахара растворяют в 5 мл стерильной воды и 1 мл полученного раствора высевают в чашку с мясопептонным агаром. Количество микробов в 1 м3 определяют с учетом прошедшего воздуха, разведения и объема высеянного раствора.
Микробиологическое исследование почвы
Микроорганизмы в почве распределены неравномерно, . Ппоэтому для их учета в этой среде взятые образцы смешивают в стерильной банке. Из средней пробы 1 г почвы переносят в колбу с 99 мл стерильной водопроводной воды (получается разведение 10-2, его готовят заранее). Из разведения 10-2 1 мл переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды (получают разведение 10-3) и т. д.
1.Схема приготовления разведений:
2.1.) 1 г почвы + 99 мл стерильной воды – 10-2;.
3.2.) 1 мл разведения 10-2 + 9 мл стерильной воды – 10-3;.
4.3.) 1 мл разведения 10-3 + 9 мл стерильной воды – 10-4;.
4.4.) 1 мл разведения 10-4 + 9 мл стерильной воды – 10-5.
Из последних разведений по 1 мл вносят в стерильные чашки, после чего заливают по 10-12 мл расплавленного и охлажденного до 45°С МПА, содержимое равномерно распределяют и оставляют на ровной поверхности. Чашки с застывшей средой переворачивают вверх дном и ставят в термостат. Через 3-4 дня подсчитывают выросшие колонии, умножают на разведение и определяют количество живых микроорганизмов в 1 г сырой почвы.
Для пересчета на 1 г абсолютно сухой почвы ее высушивают до постоянной массы, устанавливают влажность и вносят поправку.
Контрольные вопросы
1. Каковы правила отбора проб воды для бактериальных исследований?
2. Как определяются санитарно-показательные параметры воды, воздуха, почвы?
3. Как проводится исследование воды, воздуха, почвы?
4. Какие зоны санпробности природных вод знаете?
5. Что такое коли-индекс и коли-титр?
6. Каковы микробопитательные среды, на которых определяется численность микроорганизмов?
Лабораторная работа №9
Определение вида микроорганизмов
Цель занятия: определить основные морфологические характеристики выделенного из внешней среды микроорганизма и ознакомиться с основными принципами работы с определителями микроорганизмов.
Оборудование и материалы: стекла предметные и покровные; стерильные пробирки и чашки Петри; пробирки с МПА; капельницы с раствором фуксина Пфейффера; раствор Люголя; фильтровальные бумажки, окрашенные генциановым фиолетовым по Синеву; этиловый спирт; сливные чашки; мостики; вода для смыва красителей с мазков;: карандаши по стеклу; микробиологические петли; пинцеты; иглы; шпатели; спиртовки, спички, песочные часы.
Основные понятия и правила наименования микроорганизмов
Описано несколько тысяч видов микроорганизмов, однако считают, что это составляет лишь около 5% от реально существующих. Изучение разнообразия микроорганизмов составляет предмет систематики. Основной ее задачей систематики является создание естественной системы, отражающей филогенетические взаимоотношения микроорганизмов. До последнего времени систематика микроорганизмов базировалась преимущественно на фенотипических признаках: морфологических, физиологических, биохимических и других. Поэтому существующие системы классификации носят в значительной степени искусственный характер. Однако они позволяют сравнительно легко идентифицировать некоторые вновь выделенные штаммы микроорганизмов.
Систематика включает такие разделы, как классификация, номенклатура и идентификация. Классификация определяет порядок помещения индивидуумов, обладающих заданной степенью однородности, в определенные группы (таксоны). Номенклатура представляет собой свод правил наименования таксонов. Идентификация означает определение принадлежности изучаемого организма к тому или иному таксону.
Термин «таксономия» часто используют как синоним систематики, однако иногда под ним понимают раздел систематики, включающий теорию классификации, учение о системе таксономических категорий, границах и соподчинении таксонов.
Основной таксономической категорией в микробиологии, как и в других биологических науках, является вид. Вид – это совокупность особей, характеризующихся рядом общих морфологических, физиолого-биохимических, молекулярно-генетических признаков.
Под термином «штамм» понимают чистую культуру микроорганизма, выделенную из определенного места обитания (воды, почвы, организма животного и т. д.). Разные штаммы одного вида микроорганизмов могут различаться по некоторым признакам, например, чувствительности к антибиотикам, способности синтезировать некоторые продукты метаболизма и так далее, но эти различия меньше, чем видовые. Виды микроорганизмов объединяют в таксономические категории более высокого порядка: роды, семейства, порядки, классы, отделы, царства. Эти категории называют обязательными. Предусмотрены также необязательные категории: подкласс, подпорядок, подсемейство, триба, подтриба, подрод, подвид. Однако в систематике необязательные категории используются довольно редко.
Номенклатура микроорганизмов подчиняется международным правилам. Так, имеется Международный кодекс номенклатуры бактерий. Для дрожжевых грибов основным руководством является «The Yeasts. A Taxonomic Study», для мицелиальных грибов и водорослей – Международный кодекс ботанической номенклатуры.
Для наименования объектов в микробиологии, как в зоологии и ботанике, используют бинарную или биноминальную (от лат. bis – дважды) систему номенклатуры, в соответствии с которой каждый вид имеет название, состоящее из двух латинских слов. Первое слово означает род, а второе – определяет конкретный вид этого рода и называется видовым эпитетом. Родовое название всегда пишется с заглавной буквы, а видовое – со строчной даже в том случае, если видовой эпитет присвоен в честь ученого, например: Clostridium pasteurianum. В тексте с латинской графикой все словосочетание обычно выделяют курсивом. При повторном упоминании названия микроорганизма родовое название можно сократить до одной или нескольких начальных букв, например: С. pasteurianum. Если в тексте встречаются названия двух микроорганизмов, которые начинаются с одной и той же буквы, например, Clostridium pasteurianum и Citrobacter freundii, то сокращения должны быть разными (С. pasteurianum и Ct. freundii). Если микроорганизм идентифицирован только до рода, вместо видового эпитета пишут слово sp. (species – вид), например, Pseudomonas sp. В этом случае при повторном упоминании названия микроорганизма в тексте родовое название следует всегда писать полностью: Pseudomonas sp.
Для наименования подвида используют словосочетание, состоящее из названия рода, а также видового и подвидового эпитетов. Для разграничения этих эпитетов между ними пишут буквенное сочетание, представляющее собой сокращенное слово subspecies - «subsp.» или реже «ss». Например, Lactobacillus delbrueckil subsp. bulgaricus.
Для каждого штамма указывают также аббревиатуру названия коллекции культур микроорганизмов, в которой он хранится, и номер, под которым он там значится. Например, Clostridium butyricum ATCC 19398 означает, что штамм хранится в американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC) под номером 19398. Список коллекций микроорганизмов, пользующихся мировой известностью, приводится в рРуководстве Берги по систематике бактерий (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, ), в кКаталоге культур микроорганизмов (Пущино, 1992) и других справочных изданиях.
Описание любого нового вида микроорганизма базируется на типовом штамме, который хранится в одной из коллекций микроорганизмов и на основании совокупности свойств которого характеризуется данный вид в оригинальной статье или определителе. Например, Bacillus subtilis ATCC 6051. Типовой штамм является номенклатурным типом вида, поскольку за ним закреплено видовое название. Если какие-либо штаммы, первоначально включенные в тот же вид, в дальнейшем будут признаны заслуживающими выделения в особые виды, они должны получить новые названия, а старое видовое название сохраняется за типовым и родственными ему штаммами. При этом номер переименованного штамма сохраняется прежним. Для рода номенклатурным типом является специально обозначенный типовой вид, обладающий набором наиболее характерных для представителей данного таксона признаков. Например, в роде Bacillus типовым видом является В. subtilis.
В некоторых определителях и каталогах указывают старые названия переименованных микроорганизмов, а также приводят фамилии авторов, которые первыми выделили данный микроорганизм, и год первой публикации. Например, вид дрожжей, называемых в настоящее время Candida magnoliae (Lodder et Kregervan Rij, 1952) Meyer et Yarrow 1978 BKM – 1685, впервые был выделен и описан Lodder и Kreger-van Rij в 1952 г. и назван Torulopsis. magnoliae.
Кроме понятия «штамм» в микробиологии применяют термины «вариант», «тип», «форма». Они обычно используются для обозначения штаммов микроорганизмов, отличающихся по некоторым признакам от типового штамма. Штамм, отличающийся от типового по морфологическим особенностям, называют морфовар (морфотип), физиолого-биохимическим свойствам – биовар (биотип, физиологический тип), способности синтезировать определенные химические соединения – хемовар (хемоформа, хемотип), условиям культивирования – культивар, тип ответа на внедрение бактериофага – фаговар (фаготип, лизотип), антигенным характеристикам – серовар (серотип) и т. д.
В работах по генетике микроорганизмов часто используют термин «клон», под которым подразумевают популяцию генетически родственных клеток, полученную неполовым путем из одной родительской клетки. В молекулярной биологии клоном называют множественные копии идентичных последовательностей ДНК, полученные при их встраивании в клонирующие векторы (например, плазмиды). Под термином «генетически модифицированные», или «рекомбинантные» штаммы понимают штаммы микроорганизмов, полученные в результате генно-инженерных манипуляций. Часто новые штаммы микроорганизмов получают с помощью мутагенов.
Каждый новый штамм микроорганизмов, выделенный из природных или техногенных источников, должен быть охарактеризован для получения полного набора данных о свойствах микроорганизма в чистой культуре. Эти данные могут быть использованы, например, для составления паспорта данных в промышленном отношении штаммов, а также для их идентификации.
Цель идентификации – установить таксономическое положение исследуемого штамма на основании сравнения его свойств с изученными и принятыми (официально зарегистрированными) видами. Поэтому результатом идентификации обычно является отождествление исследуемого микроорганизма с каким-нибудь видом или отнесение к определенному роду. Если исследуемый штамм или группа штаммов отличаются по своим свойствам от представителей известных таксонов, то они могут быть выделены в новый таксон. Для этого дают описание нового таксона, включающее, например, в случае бактерий следующее: перечень штаммов, входящих в таксон; характеристику каждого штамма; перечень свойств, рассматриваемых в качестве существенных в таксоне; перечень свойств, которые квалифицируют таксон для представительства в ближайшем более высоком таксоне; перечень диагностических характеристик, дифференцирующих предлагаемый таксон от близко родственных таксонов; отдельное описание типового (для вида) штамма; фотографию микроорганизма.
Чтобы вновь предлагаемый таксон мог быть официально принят, его описание должно быть опубликовано в соответствии с определенными - правилами. Например, действительное опубликование таксона бактерий предусматривает помещение статьи с его описанием в мМеждународном журнале по систематике бактерий «"International Journal of Systematic Bacteriology»" (USB) или в другом журнале с последующим направлением оттиска статьи с его описанием в 1JSB. Культура типового штамма нового вида микроорганизмов передается на хранение в одну из коллекций микроорганизмов мирового значения. В случае утери типового штамма возможна его замена на так называемый неотиповой штамм. При этом должно быть подтверждено, что свойства нового штамма хорошо совпадают с описанием утерянного. Чтобы показать, что таксон предлагается впервые, после названия нового рода добавляется сокращенная комбинация «gen. nov», а для нового вида –- «sp. nov». Например, в 1970 г. предложил новый род бактерий – Prosthecochloris gen nov. и его вид P. aestuarii sp. nov. В дальнейшем при первичном использовании этих названий в публикации другими исследователями вместо указанных комбинаций ставится фамилия ученого, выделившего и описавшего микроорганизм, в данном случае Prosthecochloris aestuarii Gorlenko, 1970. Однако такая информация о виде дается не всегда, обычно приводяится только его родовое название и видовой эпитет. Информацию об авторе, выделившем штамм, и дате первой публикации штамма при необходимости берут из определителей и каталогов.
После выделения и пересева чистой культуры на МПБ и МПА определяют вид микробов. Для этого готовят мазок, окрашивают его по Граму, устанавливают форму клеток, наличие капсул, спор. Если клетки имеют форму палочек, то молодую культуру исследуют на подвижность. Макроскопическое исследование позволяет дополнительно охарактеризовать колонии, из которых сделан пересев. После изучения биохимических свойств микроорганизма (сахаролитические, протеолитические и др.) устанавливают его вид по определителям микробов Д. Берги, , и других авторов.
Контрольные вопросы
2.1. Какие признаки необходимы для определения микроорганизмов до вида?
2. Какие признаки необходимы для определения микроорганизмов до вида?
2.Что такое систематика, таксон? Привести примеры.
3.3. Что такое вид?
4.4. Что такое штамм, клон?
5.5. Что такое бинарная номенклатура видов? Привести примеры.
КОНТРОЛЬНЫЕ ЗАДАНИЯ
Задание 1
2.1. Принципы и методы выделения чистых культур бактерий.
3.2. Методы контроля микробной загрязненности пищевых продуктов.
3.3. Биотехнология производства витаминов.
Задание 2
2.1. Принципы, положенные в основу классификации вирусов.
3.2. Виды изменчивости, понятие о генотипе и фенотипе у микроорганизмов.
3.3. Биотехнология производства антибиотиков.
Задание 3
2.1. Место микробиологии в современной охране окружающей среды.
3.2. Действие физических факторов на микроорганизмы. Методы стерилизации, аппаратура для стерилизации.
3.3. Биотехнология производства ферментов.
Задание 4
2.1. Систематика и номенклатура микроорганизмов (вид, клон, штамм), эукариоты и прокариоты.
3.2. Методы выделения чистых культур аэробных бактерий.
3.3. Биотехнология производства аминокислот.
Задание 5
1.1. Структура и состав почвенных микроорганизмов.
2.2. Токсины бактерий и их свойства.
3.3. Биотехнология производства серной кислоты.
Задание 6
1.1. Рост и размножение бактерий. Фазы размножения.
2.2. Микроорганизмы, поражающие растительное сырье. Фитопатогенные микроорганизмы.
3.3. Биотехнология производства бифидоактивных кормовых добавок.
Задание 7
1.1. Основные этапы развития микробиологии и биотехнологии.
2.2. Принципы классификации микроорганизмов.
3.3. Биотехнология производств трансгенных продуктов.
Задание 8
1.1. Токсины бактерий, их природа, свойства и получение.
2.2. Питательные среды и их классификация.
3.3. Производство дрожжей.
Задание 9
1.1. Строение бактерий.
2.2. Дыхание бактерий. Типы дыхания бактерий.
3.2. Производство биосинтетического этанола.
Задание 10
1.1. Экзо - и эндотоксины, их получение.
2.2. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
3.3. Биотехнология производства микробных инсектицидов.
Задание 11
1.1. Использование бактериальных препаратов в качестве удобрений.
2.2. Плазмиды бактерий и их значение.
3.3. Биотехнология препаратов для сельского хозяйства.
Задание 12
1.1. Хранение микроорганизмов.
2.2. Методы учета численности бактерий.
3.3. Производство биоудобрений для сельского хозяйства.
Задание 13
1.1. Азотфиксация. Симбиотические азотфиксаторы.
2.2. Разложение нефти и нефтепродуктов бактериями.
3.3. Технология производства пребиотиков.
Задание 14
1.1. Ассоциативные бактерии.
2.2. Биодеградация ПАВ.
3.3. Биотехнологии утилизации отходов сельского хозяйства.
Задание 15
1.1. Микроорганизмы, обитающие в ризосфере и ризоплане растений.
2.2. Биодеструкция отравляющих и взрывчатых веществ.
3.3. Производство микробных препаратов для питания животных.
Задание 16
1.1. Бактериологический анализ молока.
2.2. Биотрансформация ксенобиотиков водорослями и растениями.
3.3. Технология очистки навозных стоков.
Задание 17
1.1. Микробиологический анализ сыра.
2.2. Токсическое действие металлов на микроорганизмы.
3.3. Биоконверсия растительных отходов сельского хозяйства.
Задание 18
1.1. Микробиологический анализ мяса.
2.2. Биотрансформация тяжелых металлов.
3.3. Биоконверсия животных отходов сельского хозяйства.
Задание 19
1.1. Микробиологический контроль воды. Определение коли-титра и коли-индекса.
2.2. Роль микроорганизмов в концентрировании металлов в природных средах.
3.3. Биоконверсия твердых отходов сельского хозяйства.
Задание 20
1.1. Микроорганизмы – продуценты белка.
2.2. Строение внешней бактериальной мембраны и ее функции.
3.3. Биоконверсия сточных вод.
ЛИТЕРАТУРА
1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / под ред. . М: Изд-во МГУ им. , 19с.
2. Практикум по микробиологии / М.: Агропромиздат, 19с.
3. Лабораторный практикум по общей микробиологии / , B.C. Бабусенко. M.: Изд. центр РХТУ, 19с.
4. Общая микробиология / Г. Шлегель - М.: Мир, 1987.567 с.
5. Теппер по микробиологии / , , . М.: Дрофа, 20с.
1. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. .- М: Изд-во МГУ им. , 19с.
2. Леонов по микробиологии / - М.: Агропромиздат, 198с.
3. Градова практикум по общей микробиологии / , B. C. Бабусенко - M.: Изд. центр РХТУ, 199с.
4. Общая микробиология./Г. Шлегель - М.: Мир, 1987.-567 с.
5.Теппер по микробиологии./ , , Г. И.. Переверзева– М.: Дрофа, 200с.
6. Сидоренко . / , , .- М.: ИНФРА-М, 200с.
МИКРОБИОЛОГИЯ
Часть 2
Методические указания
к выполнению лабораторных работ и контрольные задания
по дисциплине
«Основы микробиологии и биотехнологии»
Составили: АРЕФЬЕВА Оксана Анатольевна
ЕРОШКИНА Анна Александровна
Рецензент О.В. Титоренко
Редактор
Подписано в печать Формат 60х84 1/16
Бум. офсет.. Усл. печ. л Уч.-изд. л.
Тираж 100 экз. Заказ Бесплатно
Саратовский государственный технический университет
Саратов, Политехническая ул., 77
Отпечатано в РИЦ СГТУ. Саратов, Политехническая ул., 77МИКРОБИОЛОГИЯ
Часть 1
Методические указания
к выполнению лабораторных работ и контрольные задания по дисциплине
«Основы микробиологии и биотехнологии»
Составили: АРЕФЬЕВА Оксана Анатольевна
ЕРОШКИНА Анна Александровна
Рецензент
Панина
Лицензия ИД № 000 от 14.11.01
Подписано в печать Формат 60х84 1/16
Бум. тип. Усл. печ. л Уч.-изд. л.
Тираж экз. Заказ Бесплатно
Саратовский государственный технический университет
Саратов, Политехническая ул., 77
Отпечатано в РИЦ СГТУ. Саратов, Политехническая ул., 77
