«Молекулярно-биологические методы в селекции огурца»

Лицей № 11 «Физтех»

г. Долгопродный Московской обл.

«МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В СЕЛЕКЦИИ ОГУРЦА»

г. Долгопродный Московской обл.

Оглавление

Оглавление...................................................................................................................................... 2

Молекулярно-биологические методы в селекции растений.......................................................... 3

Введение.................................................................................................................................. 3

Объект исследования................................................................................................................ 4

Методы исследования – выделение ДНК и проведение амплификации ПЦР (SSR)................. 6

Выделение ДНК........................................................................................................................ 6

Проведение амплификации ПЦР (SSR)..................................................................................... 9

Результаты Исследования...................................................................................................... 12

Выводы. .................................................................................................................................. 14

Список использованной литературы....................................................................................... 14

Молекулярно-биологические методы в селекции растений

Введение

Наша работа посвящена очень важной биологической и прикладной теме: одному из современных методов селекции растений – молекулярно-биологическому.

Селекция важна, прежде всего, в сельском хозяйстве, особенно – в производстве продуктов питания, в связи с ростом населения планеты и нагрузки на биосферу.

Исторически селекция предусматривала многолетние исследования и эксперименты, так как необходимо было дожидаться развития растения семян, полученных от ручного скрещивания. Это было очень долго и затратно.

Наш же метод принципиально иной. Он позволяет проверять свойства растений, не дожидаясь того, когда они полностью вырастут и продемонстрируют свои новые свойства. Этот метод основан на оценке морфологических признаков, которые находятся под влиянием условий окружающей среды. Это менее длительная (в районе трёх недель) и трудозатратная по сравнению с традиционной процедура. Грунт контроль требует высокой степени компетентности специалистов для проведения фенотипической идентификации сортовых признаков. Также мы использовали метод генетического маркирования, который позволяет значительно сократить время (до одной недели) и затраты по определению уровня гибридности семян.

Использованные нами методы имеют большое народнохозяйственное и коммерческое значение, так как позволяют семеноводческим хозяйствам быстро определять качество покупаемых и продаваемых семян, а фермерам – быть уверенным в свойствах будущих растений уже при покупке семенного материала.

Нам было очень интересно знакомиться с теорией, лежащей в основе этих методов, и, конечно, проводить эксперименты в настоящей биологической лаборатории на базе кафедры селекции Тимирязевской Академии.

Мы много узнали не только из области предмета биологии, но и по химии и физике, а также немного попробовали проводить точные исследования на современном тонком измерительном оборудовании.

В данной работе описаны цели, объект и методы исследования, результаты исследования, выводы, и приведены фотографии образцов, приборов и результатов молекулярного маркирования семян.

В нашей работе мы в основном пользовались двумя протоколами исследования: Выделение ДНК и проведение ПЦР.

Объект исследования

Предметом нашего исследования была партия семян огурца F1 Кассандра.

Огурец относится к группе теплолюбивых культур, отличается высокой теплотребовательностью и не переносит заморозков.

Огурец — растение однодомное, образующее мужские и женские цветки. Число женских цветков в узле может быть различным — 1, 2 и несколько (щиток). Мужские цветки образуются в большем количестве.

Мужские и женские цветки могут формироваться в отдельных узлах (мужские и женские узлы) или в одних и тех же (смешанные).

В пазухах нижних листьев образуются преимущественно мужские цветки. По мере движения вверх по стеблю соотношение мужских и женских узлов смещается в сторону последних. Самые верхние узлы главного стебля, как и узлы ветвей высшего порядка, могут быть только женскими.

Огурец — энтомофильное перекрестноопыляющееся растение. Созданы партенокарпические сорта, образующие плоды без опыления, что способствует более длительному сохранению товарных качеств плодов и более редкому проведению сборов. Партенокарпические гибриды широко используют в тепличном производстве.

Широкое распространение этой овощной культуры объясняется, прежде всего, традиционными особенностями питания народа, высокими вкусовыми качествами плодов, идущих в пищу как в свежем, так и в переработанном виде (соленом, маринованном и в составе быстрозамороженных овощных смесей).

Пищевое значение огурца не в его питательности, а содержании ферментов и минеральных солей, необходимых для лучшего усвоения другой пищи. Свежие и переработанные огурцы рекомендуют при повешенной кислотности желудочного сока, а также при заболеваниях зоба, печени, почек.

Приятный, освежающий вкус огурцов зависит от наличия в них свободных органических кислот, а характерный запах обуславливается присутствием в плодах эфирного масла [1].

В пищу у огурца употребляют не только недозрелые плоды-зеленцы, но и семенники (плоды в биологической спелости). В некоторых странах Юго-Восточной Азии и Западной Европы такие плоды консервируют. Из них также готовят различные маринады и подливы. В Малайзии и Индонезии в пищу употребляют молодые листья огурца (в свежем или отваренном виде). Плоды огурца содержат 4-5% сухого вещества и 95-96% воды. В народной медицине огурцы используют при желудочных заболеваниях как послабляющее средство, в последние годы сок огурцов применяют в косметике. Огурец может стать и предметом экспорта.

Мировое производство огурцов в 1989 г. составляло более 12 млн т, их выращивали на площади свыше 880 тыс. га со средней урожайностью 15 т/га. В субтропических и других районах Китая собирают в год до 3,9 млн т, Много выращивают огурцов в Японии — 1 млн т, в США — 0,6 и в Турции — 0,8 млн т.

F1 Кассандра

Сильнорослый партенокарпический гибрид для позднего зимнее-весеннего и осеннего выращивания в теплицах, теневынослив. Растения женского типа цветения, с очень высокой партенокарпией. В пазухах листьев образуется по 1-2 (до 3) завязей. Обладает дружной отдачей раннего урожая. Зеленцы средне-бугорчатые тёмно зеленые с белым опушением, длиной 13-15 см, диаметром 3,5-4,0 см, массой 140-160 г. Плоды с высокими товарными качествами, хорошо транспортируются, использование, в основном, салатное. Отсутствие горечи обусловлено генетически. В первых плодах возможно наличие небольшой ручки. Гибрид толерантен к корневым гнилям и настоящей мучнистой росе. Листья черешковые, варьирующие в пределах растения по размеру и форме. Расположение листьев очередное. Нижние листья отличаются от последующих меньшими размерами и относительно округлой формой. В пазухах третьего-четвертого и последующих листьев образуются усики, в пазухах же формируются мужские и женские цветки [4].

Рис. 1.

Методы исследования – выделение ДНК и проведение амплификации ПЦР (SSR).

Для проведения этого исследования нам необходима выборка семян из общей партии гибрида, в количестве 120 штук, а также семена родительских линий, по 6 штук каждого. 20 семян при этом будут являться, так называемым, «страховым фондом» на случай, если какое-то количество не прорастёт. В итоге из 100 проросших семян мы выделяем ДНК, которое и подвергаем анализу. Таким образом, общее число семян – 100%.

Проращивание материала проводится в чашках Петри на фильтровальной бумаге, смоченной небольшим количеством воды. Растения доращиваются до стадии появления семядольных листьев, которые затем собираются, укладываются в пробирки и замораживаются.

Цель — определение сортовой чистоты партии семян гибрида огурца, при помощи молекулярно-биологических методов, а также знакомство с современными методами исследований, применяемых в селекции растений.

Выделение ДНК

1.  Приготовление смеси (4 компонента). На 12 образцов.

В стаканчик (предварительно ополоснуть дистиллированной водой), используя большие носики на 1мл, соединить:

Ex. Buffer – 5мл

Nuclei Buffer – 5мл

Sarkosy 5% - 2мл

Перемешать.

2.  Работа с весами (для 4 компонента)

При работе с весами необходимо закрывать дверцу после каждого действия.

Взвешивание на фильтровальной бумаге. На весы кладётся бумага, затем они включаются.

Na2S2O5 – 0,02г. (В шкафчике напротив термостата).

Выключение весов. Бумагу снимаем с весов, Na2S2O5 ссыпаем в раствор.

3.  Подготовка образцов (образцы должны быть подписаны).

Поставить в подставку эпиндорфы с небольшими кусочками образцов.

В каждую пробирку добавить по 200мкл смеси (буферного раствора). Использовать носики на 200мкл.

Кусочки образцов растираем пестиками до однородной массы (гомогенизирование).

Перед растиранием нового образца пестик необходимо ополоснуть в дистиллированной воде, а затем просушить фильтровальной бумагой.

Подготовить стаканчик.

4.  Установить пробирки в подставку и добавить в каждую ещё по 500мкл буферного раствора (всего в каждой пробирке 700мкл).

Помещаем пробирки в термостат (65оС). Термостат нагревается за 2-3 минуты, когда температура достигнет 65оС, засекаем 40-60 минут, в течение которых образцы будут прогреваться.

Каждые 15 минут пробирки необходимо аккуратно встряхивать.

Рис. 2.

5.  Через час пробирки вынимаются из термостата.

В каждую пробирку добавляется по 700мкл хлороформа, делать это необходимо под вытяжкой.

(Вытяжка включается крутящимся регулятором слева от окна; внизу (под вытяжкой) – регулятор включения света – чёрный рычажок; затем включаем кнопку «освещение»).

6.  После добавления хлороформа, устанавливаем пробирки в центрифугу (на 10мин.)

(Готовим новые подписанные пробирки по числу образцов.)

Осторожно достать пробирки из центрифуги, и под вытяжкой при помощи пипетки, отбираем верхнюю фракцию (большая пипетка), в объеме 500мкл.

Между образцами меняем носик, в нескольких повторностях одного образца – носик промываем дистиллированной водой.

Вытяжная фракция сливается в новые (подписанные) пробирки.

Оставшиеся фракции выбрасываем.

Рис. 3.

Рис. 4. Рис. 5.

7.  В новые пробирки под вытяжкой добавляем по 500мкл изопропанола, перемешиваем и оставляем на 10 минут отстояться с закрытыми крышками.

Затем снова ставим на центрифугу на 10 минут.

Рис. 6.

Осторожно достаём пробирки из центрифуги. На дне образуется маленькая частица с ДНК (иногда не видна, иногда плавает в растворе).

Рис. 7.

8.  Промывание.

Верхняя фракция (жидкость) сливается в стаканчик.

В пробирки добавляется по 500мкл 80% спирта. Затем они устанавливаются в центрифугу на 5 минут.

Через 5 минут спирт осторожно сливаем, а затем опять заливаем по 500мкл спирта в каждую пробирку, и ставим в центрифугу ещё на 5 минут.

9.  После центрифуги сливаем спирт и с открытыми крышками ставим пробирки в сушку (на 10 минут, при температуре 45оС).

10.  Через 15 минут достаём пробирки с ДНК и в каждую добавляем по 50мкл воды (дистиллированной и пропущенной через фильтр MiliQ). Вода находится в отдельном пузырьке, в коробке с буферами.

11.  Пробирки ставятся в холодильник с положительной температурой, на 1-2 дня, затем в морозилку.

Проведение амплификации ПЦР (SSR).

Работу необходимо проводить на льду.

1.  На каждый образец ДНК берём по пробирке, и ещё одну пробирку в качестве контроля заполняем дистиллированной водой (MiliQ). Все пробирки подписываем. В каждую пробирку добавляем по 1 мкл. ДНК, в пробирку – контроль добавляем, соответственно, 1 мкл. воды (MiliQ).

Перед приготовлением смеси все реагенты (кроме образцов ДНК, они размешиваются осторожно, вручную, щелчком по пробирке) должны быть размешаны на Microspin Fv – 2400, после перемешивания реактивы осаждаются на центрифуге. При осаждении все пробирки в центрифуге должны быть уравновешены.

2.  Mastermix (реакционная смесь). Готовится в 1 эпиндорфе не более чем на 14 образцов.

·  Вода дистиллированная (MiliQ) (необходимо следить, чтобы вода была свежая)

·  Super taq буфер 10Х (можно размораживать в руках)

·  dNTP’s (можно размораживать в руках, находится в отдельном эпиндорфе, разбавлен в соотношении 2:10, 2мкл. dNTP’s конц. + 8мкл. вода дистиллированная (MiliQ))

·  Праймер (forward) прямой

·  Праймер (reverse) обратный

·  Super taq полимераза (добавляется в последнюю очередь, достаётся из морозильника непосредственно перед добавлением и сразу же убирается, т. к. теряет ферментативную активность).

Табл. 1.

очерёдность	Mastermix (смесь)	1Х	4Х	8Х	12Х	14Х	24Х	28Х
1	Вода дистиллированная (MiliQ)	6,8	27,2	54,4	81,6	95,2	163,2	190,4
2	Super taq буфер 10Х	1,0	4,0	8,0	12,0	14,0	24,0	28,0
3	dNTP’s	0,4	1,6	3,2	4,8	5,6	9,6	11,2
4	Праймер (forward) прямой	0,4	1,6	3,2	4,8	5,6	9,6	11,2
5	Праймер (reverse) обратный	0,4	1,6	3,2	4,8	5,6	9,6	11,2
6	Super taq полимераза	0,05	0,2	0,4	0,6	0,7	1,2	1,4
Итого:	9,05	36,2	72,4	108,6	126,7	217,2	253,4

3.  Перед добавлением смеси к пробиркам с ДНК, её надо перемешать на Microspin Fv – 2400, после перемешивания осадить на центрифуге.

4.  Пробирки устанавливаются в амплификатор.

5.  Забрать пробирки из амплификатора (по завершении программы). Не забыть выключить (остановить) программу аппарат в том случае, если он не используется кем-либо ещё.

6.  Приготовление геля.

Агароза находится в шкафчике.

ТВЕ х0,5 (буфер)

Колбу взять на 250мл.

Необходимая концентрация – 1,5%.

1). 1,5г агарозы отмеряем на весах.

2). Доливаем буфером до 100мл в колбу.

3). Колбу закрываем фильтровальной бумагой.

4). Раствор ставим в микроволновую печь на 1 - 2 минуты. Внимательно следить, чтобы раствор не закипал сильно, не выкипел.

7.  Нагретую колбу несём охлаждать под вытяжку. По мере остывания колбы, раствор в ней необходимо постоянно перемешивать, чтобы не образовались комки.

8.  Приготовить плашку, закрепить её. Затянуть плотно, но без перегиба, иначе гель деформируется. Устанавливаем гребёнку в первый пас (дальний от себя).

9.  Остужаем колбу приблизительно до 50оС (при такой температуре колбу можно держать рукой).

10.  Аккуратно заливаем гель в электрофорезную камеру. Последние капли из колбы сливаем к краю камеры. При образовании пузырька, накрыть его широкой стороной носика пипетки. Гель оставляется для застывания. Для этого достаточно 20 минут, если гель оставлять более чем на 30-40минут, его необходимо накрывать фольгой, чтобы в результате избыточного испарения, гель не потрескался.

11.  К тому моменту, когда заканчивается амплификация (1 час, 30 минут), готовим гель к дальнейшей работе.

12.  Готовим электрофорезную камеру к работе. Устанавливаем камеру с гелем, лунками в сторону чёрного. (Красный + ,Чёрный – ДНК всегда имеет заряд « - »). Камеру прижимаем к 1 стенке. Аккуратно раскачивая, вытаскиваем гребёнку.

13.  Добавляем к амплифицированному материалу (ДНК), загружающий буфер с красителем и дистиллированную воду в соотношении 3:3:1(7мкл).

1 мкл – загружающий буфер (Якорь – утяжелитель) с красителем

3 мкл – раствор с ДНК

3 мкл – дистиллированная вода (MiliQ)

Загружающий буфер, в том числе выступает в роли краски.

(Полная разгонка – 6см, для SSR тоже.)

Одновременно готовим леддер в капле (в чашке петри) c утяжелителем.

Маркер молекулярной массы 100bp (Ladder) 5мкл, 1мкл загружающий буфер.

14.  В ячейку из геля опускаем носик по краю, чтобы раствор (в количестве 7мкл.) заливался, вытесняя электролит. Придерживаем пипетку пальцем, чтобы она не тряслась.

15.  Закрываем крышкой электрофорезную камеру, красный провод к красной стороне. Разгонка должна осуществляться при 130В. (Разгонка занимает приблизительно 1 час).

16.  Перед снятием крышки аппарат выключают (нажатием кнопки «стоп»).

Снимаем фарезную плашку.

17.  Откидываем крышку трансиллюминатора, устанавливаем плашку (сдвигая гель на просвечиваемую поверхность).

Закрываем стеклом. Включаем трансиллюминатор. ДНК светится.

Сначала выключаем трансиллюминатор, затем открываем стекло и достаём фарезную плашку.

По окончании работы поверхность необходимо протереть фильтровальной бумагой, затем тряпкой. Оставшийся гель складываем обратно в колбу для повторного использования. (Гель можно использовать 3 раза).

Результаты Исследования

В результате нашей работы, мы получили следующие данные. Они наглядно показаны на фотографиях геля.

Рис. 8.

F1 Кассандра (варианты 61-80), праймер № 000.

1 – Вал 1; 2 – Кассандра (Вал1хРс3-3); 3 – Рс3-3;

L – Ledder (маркер молекулярной массы)

Рис. 9.

F1 Кассандра (варианты 21-40), праймер № 000. 1 бэнд от материнской линии

Прогонка спорных образцов Кассандра

Рис. 10.

1 – Вал 1; 2 – Кассандра (Вал1хРс3-3); 3 – Рс3-3; L – Ledder (маркер молекулярной массы)

Праймер - 100

Выводы.

Анализ SSR-ПЦР.

В результате проведения SSR-ПЦР были получены следующие данные: праймеры SSR маркера 100 амплифицировали по 1 фрагменту размером приблизительно 310п. н. у родительской линии Рс3-3 и 350п. н. у родительской линии Вал1 F1 Кассандра и оба этих фрагмента у гибрида. Разница между двумя фрагментами на гибриде Кассандра составила приблизительно 40п. н.

Метод генетического маркирования с использованием молекулярных маркеров, позволил оценить гибридность партии семян F1 Кассандра. Гибридность партии составила 97% (2 образца не амплифицировались, 1 образец показал ДНК материнской линии).

Список использованной литературы.

1.  Овощеводство / Под ред. и - М.: Колос, 1993;

2.  Российский огурец – сегодня. , В. И., Пыженков,  ,  , кандидат с/х наук http://www. *****/cucumber

3.  «Ваши 6 соток» февраль 2006 г. А. Борисов -семеноводческая фирма «Манул»

4.  Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию. Москва 2009.

5.  Выращивание огурцов [Электронный ресурс] // ВоструХА. Ru : [сайт]. - М., 2008. – URL: http://*****/content/view/2199/5/ (06.12.08).

6.  Летне-осенняя культура огурца: „Овощеводство“ № 7, ст. 76—77, К: 2005 г.

7.  http://www. *****/agrotehnika-ogurca Агротехника огурца для выращивания в зонах рискованного земледелия. ,

8.  Т. Биггс. Овощные культуры. М. «Мир», 1986

9.  Мухин , кабачок, патиссон, бахчевые и другие тыквенные овощи. М. «Никола-пресс», 2007

10.  Практикум по селекции и семеноводству овощных и плодовых культур. , , М. «Колос», 1975

11.  Принципы и методы селекции растений, М. «Колос», 1984

12.  Байназаровой -генетическое изучение полиморфизма генома огурца посевного (Cucumis sativus L.) и его применение для оценки гибридности семян и маркирования устойчивости к мучнистой росе. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

13.  Fazio et al. Development and Characterization of PCR Markers in Cucumber. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 127(4): 545-577, 2002