МИНИСТЕРСТВО
СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
(Минсельхозпрод России)
ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ УТВЕРЖДАЮ
Заместитель руководителя
26.04.99г. № 13-7-2/1573 Департамента ветеринарии
НАСТАВЛЕНИЕ
орнитоза (хламидиоза) птиц.
1. Общие положения.
1.1. Лабораторные исследования на хламидиоз птиц включают:
- выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц
в РСК (РНСК) или ИФА;
- обнаружение хламидий или антигенов хламидий в патологическом
материале методом световой или люминесцентной микроскопии;
- выделение хламидий на куриных эмбрионах или лабораторных жи-
вотных с последующей их идентификацией;
- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом
полимеразной цепной реакции (ПЦР).
1.2. Работа с возбудителем хламидиоза птиц допускается в лабора-
ториях, имеющих условия для работы с особо опасными инфекциями и раз-
решение СЭС на работу с возбудителями 1-2 групп; исследования на хла-
мидиоз проводят в отдельном боксе или отдельной комнате с настольным
боксом.
Работа с возбудителем орнитоза также может проводиться в ПЦР-
лаборатории с предварительно инактивированным материалом, прогретым
при 70-80 °С в течение 10 мин. или залитым 0,5%-ным раствором фенола или
гуанидин тиоционатом в концентрации 5,3 моль/л.
1.3. Диагноз на хламидиоз птиц устанавливают на основании анализа
эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических из-
менений с учетом результатов лабораторных исследований.
В лабораторию для исследования направляют сыворотку крови, па-
тологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), павших
или вынужденно убитых птиц или патологический материал от них (кусочки
печени, селезенки, экксудат брюшной полости).
Патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет),
для исследования необходимо брать в количестве не менее трех образцов
от одной и той же особи в течение 5 суток в связи с непостоянным выделе-
нием возбудителя у инфицированной птицы.
Сыворотку крови для серологического исследования берут на 5-12
день заболевания и направляют в лабораторию в количестве 1-2 куб. см. Сы-
воротки хранят при температуре минус (18-20) °С и исследуют одномомент-
но. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной
и грибковой флорой не пригодны.
Патологический материал берут только одноразовыми или
стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с
крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками,
упаковывают в отдельные пакеты с номерами или надписями и доставляют
в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал
можно не более 7 суток при 4 °С и 10-12 мес. при температуре минус (18-
20) °С.
Патологический материал отбирают не позднее 2 ч. после гибели или
убоя птицы с соблюдением правил асептики, помещают его в стерильные
пробирки (флаконы) с резиновыми пробками и затем в термос со льдом.
Трупы птиц заворачивают в несколько слоев марли или ткани, смо-
ченной 5%-ным раствором хлорамина, и помещают во влагонепроницае-
мую тару, опечатывают и в тот же день (не позднее 24 часов после взятия)
доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих рассеивание
возбудителя. В лаборатории вскрытие трупов птиц с подозрением на хла-
мидиоз проводят в отдельном боксе с соблюдением правил работы с особо
опасным материалом.
2. Выявление комплементсвязывающих антител.
2.1 Специфические антитела к хламидиям можно выявить в крови
птиц, начиная с 5-12 дней после их заболевания, в реакции связывания
комплемента (РСК), или реакции непрямого связывания комплемента
(РНСК) или иммуноферментным анализом (ИФА). В отличие от РСК и ИФА,
РНСК выявляет "неполные" антитела, образующиеся в крови некоторых
видов птиц.
2.2. Постановка РСК.
2.2.1 Компоненты реакций и их подготовка к работе:
- комплементсвязывающий группоспецифический и контрольный ан-
тигены, иммунную и отрицательные сыворотки, применяют в рабочих тит-
рах, указанных на этикетках:
- стандартную гемолитическую сыворотку (гемолизин) используют в
утроенном титре (например, титр гемолизина 1:1500, а в реакцию берут в
разведении 1:500:
- эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем
центрифугирования при об/мин в течение 10-15 мин до полного
просветления надосадочной жидкости и готовят 3%-ную взвесь из осадка
на физиологическом растворе;
- комплемент (свежая, консервированная и лиофильно высушенная
сыворотка морской свинки) в рабочем титре, установленном в день поста-
новки реакции;
- физиологический раствор (0,85%) химически чистого хлорида на-
трия в дистиллированной воде рН 7,2-7,4;
- испытуемые сыворотки (свежие или консервированные) разводят
1:8 физраствором и инактивируют в водяной бане при 58-60 °С 30 мин.
Гемолитическую систему - смесь равных объемов 3% взвеси эритро-
цитов и рабочего разведения гемолизина - выдерживают 30 мин. при 37 °С
для сенсибилизации.
2.2.2. Титрование комплемента.
За рабочее разведение принимают разведение комплемента через
одну влево от последней пробирки с полным гемолизом. В данном примере
полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:40, рабочее раз-
ведение его 1:20
Определение рабочего разведения комплемента проводят по
следующей схеме:
№№ пробирок | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
Получаемые разведения комплемента | 1:10 | 1:20 | 1:30 | 1:40 | 1:50 | 1:60 | 1:70 | 1:80 | 1:90 | 1:100 |
Комплемент в разведении 1:10 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Физиологический раствор | - | 0,1 | 0,2 | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 |
титрование комплемента | ||||||||||
Комплемент в разведении | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Физиологический раствор | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Гемолитическая система | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
водяная баня 37-38 гр. С-30мин. | ||||||||||
Примерный результат | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ЧГ | ЧГ | ЗГ | ЗГ | ЗГ | ЗГ |
ПГ - полный гемолиз, ЧГ - частичный гемолиз, ЗГ - задержка гемолиза
Комплемент в рабочем разведении титруют на специфической, нега-
тивной и испытуемой сыворотках в присутствии специфического антигена
по следующей схеме:
Компоненты | №№ пробирок | ||||||||
/ | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
Комплемент в рабочем разведении | 0,02 | 0,03 | 0,04 | 0,05 | 0,06 | 0,07 | 0,08 | 0,09 | 0,1 |
Физиологический раствор | 0,08 | 0,07 | 0,06 | 0,05 | 0,04 | 0,03 | 0,02 | 0,01 | - |
Антиген специфический в рабочем разведении | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Сыворотка негативная (специфическая, испытуемая), разведение 1:8 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Холодильник 4-6 гр. С - 16-18 часов | |||||||||
Гемолитическая система | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Водяная баня 37-38 гр. С - 40 мин. | |||||||||
Титром комплемента считают минимальное его количество, вызы-
вающее полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуе-
мой сыворотками в присутствии антигена при задержке гемолиза в анало-
гичной пробирке со специфической сывороткой.
Рабочей дозой является доза комплемента на один интервал вправо.
В случае инкубации ингредиентов 16-18 ч. при 4-6 °С за рабочую дозу при-
нимают удвоенный титр комплемента
Расчет количества чистого комплемента для главного опыта делают
по формуле:
К х П
-----
Р
где К - комплемент в рабочей дозе; П - количество пробирок в опыте;
Р - рабочее разведение комплемента.
2.2.3. Постановка главного опыта РСК.
Реакцию ставят в объеме 0,5 куб. см в пробирках Флоринского. Разве-
денные и инактивированные сыворотки исследуют со специфическим, кон-
трольным антигенами и без антигена (контроль на антикомплементар-
ность).
Одновременно с главным опытом ставят контроли: позитивной сыво-
ротки до ее предельного титра и негативной в том же разведении, как испы-
туемые, со специфическим антигеном; специфического и контрольного ан-
тигена - на антикомплементарность.
Главный опыт и контроли ставят по схеме:
Компоненты реакции | №№ пробирок | Контроли | |||||||||
. | 1 | 2 | 3 | сывороток | антигенов | ||||||
Испытыемые сыворотки | 0,1 | 0,1 | 0,1 | - | - | - | - | - | - | - | - |
Позитивная сыворотка до предельного титра | - | - | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | - | - | - | - | - |
Негативная сыворотка 1:8 | - | - | - | - | - | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | - | - |
Антиген специфический в рабочем разведении | 0,1 | - | - | 0,1 | - | - | 0,1 | - | - | 0,1 | - |
Антиген контрольный в рабочем разведении | - | 0,1 | - | - | 0,1 | - | - | 0,1 | - | - | 0,1 |
Физиологический раствор | - | - | 0,1 | - | - | 0,1 | - | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Комплемент в рабочем титре | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Водяная баня 37-38 гр. С - 1 час или холодильник 4-6 гр. С - 16-18 час. | |||||||||||
Гемолитическая система | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
Водяная баня 37-38 гр. С - 40 мин. | |||||||||||
2.2.4. Учет и оценка результатов реакции.
Реакцию учитывают через 30 мин. после извлечения штативов из во-
дяной бани. Результаты реакции считают действительными при следующих
показаниях контролей:
- задержка гемолиза в пробирках со специфическим антигеном и сы-
вороткой до ее предельного титра;
- полный гемолиз во всех пробирках с негативной сывороткой, со спе-
цифической сывороткой без антигена и с контрольным антигеном; в конт-
ролях антигенов на антикомплементарность.
Оценку результатов реакции проводят по степени задержки гемолиза
эритроцитов и выражают по четырехкрестовой системе:
++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость бес-
цветная;
+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;
++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;
+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;
- (минус) - полный гемолиз, осадок отсутствует.
Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2-4 крес-
та в пробирке с испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и специфи-
ческим антигеном. Сомнительной при задержке гемолиза на 1 крест, отри-
цательной - при полном гемолизе эритроцитов.
2.3 Постановка РНСК.
2.3.1. Постановку реакции до главного опыта проводят по той же
схеме, что и РСК, но в объеме 0,6 куб. см (путем добавления 0,1 куб. см
физиологического раствора).
2.3.2. Главный опыт РНСК проводят в три этапа:
1 этап - испытуемые сыворотки со специфическим и контрольным антиге-
нами выдерживают 1 ч. при 37-38 °С.
2 этап - во все пробирки вносят иммунную сыворотку, разведенную до пре-
дельного титра и комплемент в рабочей дозе по 0,1 куб. см, смесь инкубируют
1 ч. при 37-38 °С или 16-18ч. при 4 °С.
3 этап - добавляют гемолитическую систему по 0,2 куб. см и выдерживают
30 мин. при 37-38 °С.
2.3.3. Учет и оценка реакции.
Учет реакции проводят через 30 мин после изъятия штативов из во-
дяной бани; степень гемолиза, как и в РСК, выражают по четырехкрестовой
системе, но оценивают в обратном порядке:
++++ (4 креста) - реакция отрицательная;
+++ (3 креста) - реакция отрицательная;
++ (2 креста) - реакция отрицательная;
+ (1 крест) - реакция положительная;
- (минус) - реакция положительная.
3. Постановка ИФА.
3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики орнитоза
(пситтакоза) птиц и эпизоотологического обследования особей путем выяв-
ления специфических антител в сыворотках крови.
3.2.Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии
антител и антигена с последующим присоединением к полученному ком-
плексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным
вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта фермен-
тативной реакции.
3.3. Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудо-
вание:
3.3.1. В состав набора входят:
1 - специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный -
1 амп.;
2 - специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -
1 амп.;
3 - отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
4 - пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный -
1 амп.
Химический набор, в состав которого входят:
5-КН2Р04-1 амп.:
6-К2НР04- 1 амп
7-NaCI -1 амп :
8-Твин, Тритон Х-100)-1 амп.;
9-лимонная кислота -1 амп.:
l0-K2HPO4-l амп ;
11-0-фенилендиамин - 2 амп.;
12-гидроперит -1 табл.;
13-две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для
ИФА;
14-стоп-раствор -1 флакон.
3.3.2. Оборудование:
1- одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом
от 0,05 куб. см до 1 куб. см;
2 - стеклянные пипетки на 1 -2 куб. см;
3 - промывающее устройство;
4 - спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.
3.4. Приготовление рабочих растворов:
- Буфер №1 - (0,01М калий фосфатный, рН 7,2-7,4) предназначен для
растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 куб. см дис-
тиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН
корректируют 0,1 N КОН или НСl.
- Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата,
а также для промывки микропанелей. К 2000 куб. см буфера №1 добавляют со-
держимое ампулы №8.
- Буфер №3 - (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовле-
ния субстрата (рН 5,0-5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.
А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 куб. см дистиллированной
воды в мерной колбе.
Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 куб. см дистиллированной
воды в мерной колбе, затем к 24,3 куб. см раствора А добавить 25,7 куб. см
раствора Б и 50 куб. см дистиллированной воды, проверить рН. В случае необхо-
димости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б)
компоненты буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета
субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является
следствием использования для его приготовления недостаточно чистой по-
суды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно
перед использованием, хранению не подлежит.
Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непо-
средственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления
реакции на последней стадии Содержимое ампулы №11 растворить в 2 куб. см
спирта-ректификата и добавить 48 куб. см буфера №3, внести 0,8 куб. см
перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 куб. см
дистиллированной воды.
Буферные растворы хранят при температуре 4-6 гр. С не более 3 мес.
3.4.2. Подготовка биологических компонентов реакции:
Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в
20 куб. см буфера №1.
Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб. см
буфера №2.
Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб. см бу-
фера №2, получая разведение 1:200.
Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при
4-6 °С в течение 3-4 дней.
3.5. Постановка иммуноферментной реакции.
Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.
3 5.1. Сорбция антигена на микропанели.
3.5.2. Промывание микропанели.
Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Ка-
ждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхи-
вают. Промывание повторяют 4-5 раз.
Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое про-
мывающее устройство.
3.5.3. Разведение сывороток.
В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1 вносят по
0,1 куб. см специфической положительной сыворотки (положительный кон-
троль), а в три следующие лунки D1, Е1, F1 вносят по 0,1 куб. см
отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены со-
гласно п. 3.4.2. В лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вно-
сят по 0,1 куб. см буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с
лунок А2 и Е2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготов-
ленных как указано в п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным ря-
дам. начиная с разведения 1:200 до 1 :6000.
Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37 °С в термо-
стате в течение часа.
3 5.4. Внесение конъюгата.
Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.
Во все лунки вносят по 0,1 куб. см рабочего раствора иммуноферментно-
го конъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате
при 37 °С в течение 1 часа.
3.5.5. Промывают 5 раз как указано в п.3.5.2.
3-5.6. Проявление реакции.
Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4 1.
Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 куб. см субстратно-
индикаторного раствора и выдерживают в темноте при комнатной темпера-
туре 30-40 мин.
В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.
3.6 Учет результатов реакции.
Результаты учитывают в течение 30-40 мин. после внесения стоп-
раствора.
3.6.1 Визуальный учет: при наличии специфических антител наблю-
дается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле
Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или
имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.
3.6.2.Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реак-
ции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при
длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотно-
сти (ОП 490)
Положительными считаются пробы, ОП 490 которых в два и более раза
превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но
при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.
Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля
и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.
Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свиде-
тельствует об отрицательной реакции.
3.7. Интерпретация результатов ИФА.
Основанием для постановки предварительного диагноза на хлами-
диоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-
4 раза.
Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному
исследованию и при подтверждении первоначального результата считают-
ся положительными.
3.8. Птиц, с сыворотками крови которых получены положительные и
сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диаг-
ностики для постановки окончательного диагноза.
4. Обнаружение хламидий в патологическом материале.
Из патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки (с
висцеральной поверхности внутренних органов: сердца, печени, селезенки;
при гидроперикардите - из перикардной жидкости) для световой и
люминесцентной микроскопии.
4.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала
методом световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по
Романовскому-Гимзе.
При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе пре-
параты фиксируют метиловым спиртом в течение 1 мин. или спирт-эфиром
в течение 15-20 мин. и окрашивают краской Романовского-Гимзе,
разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (рН 7,2-7,6) в
течение 1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и
высушивают фильтровальной бумагой.
Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом
микроскопе под иммерсионным объективом. Цитоплазматические включе-
ния представляют компактные или рыхло расположенные зернистые мас-
сы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах
его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают
его к периферии клетки, имеют разнообразную правильную или неправиль-
ную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цито-
плазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со сред-
ним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, крупные
включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры
возбудителя имеют розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявля-
ются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности
расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических
структур микроорганизма, обнаруживается содержащая их вакуоль.
4.2.Метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).
Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят не-
посредственно после взятия материала с конъюнктивы и клоаки у птиц, ис-
пользуя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной ад-
сорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и пере-
носят на лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют,
указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают
на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин.
или наносят на мазок 2-3 капли ацетона до полного его испарения. Стекло с
фиксированным препаратом может храниться при температуре (18-20) °С в
течение 5 сут.
4.2.1. Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав кото-
рого входят:
- компонент №1 - лиофилизированные моноклональные антитела,
меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель
Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета - 1
флакон, 0,1 куб. см;
- компонент №2 - растворитель для лиофилизированных иммуногло-
булинов, прозрачная бесцветная жидкость -1 флакон, 3,0 куб. см;
- компонент №3 - жидкость для "заключения" препарата, вязкая про-
зрачная маслянистая жидкость -1 флакон, 2,0 куб. см.
Оборудование:
- люминесцентный микроскоп;
- термостат на 37 °С;
- чашки Петри;
- предметные стекла с лункой;
- фильтровальная бумага;
- микропипетки на 30 мкл;
- наконечники в штативе.
4.2.2. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку
предметного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипет-
ки вносят 30 мкл меченных ФИТЦ моноклинальных антител. С помощью
наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно рас-
пределяют реагент по всей поверхности лунки с материалом.
4.2.3. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реа-
гентом инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре
37±0.5 °С в течение 30 мин, периодически проверяя их состояние во избе-
жание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложнопо-
ложительным результатам при диагностике, поэтому высохшие препараты
бракуются.
4.2.4 Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации
предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в те-
чение 10с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бума-
гой и высушивают на воздухе.
4.2.5. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости
для "заключения" препарата (компонент №3), покрывают обезжиренным
покровным стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микро-
скопе при комбинации светофильтров СЗ 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при исполь-
зовании окуляра Х 10 и объектива с масляной иммерсией Х 90, с использо-
ванием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомен-
дуется просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные
препараты можно хранить при температуре 2-8 °С не более 24 ч.
Продолжение
4.2.6. Учет результатов прямой ИФ. Диагноз на хламидиоз считается
положительным, если в препарате диагностируют наличие элементарных
телец хламидий, расположенных внеклеточно и представляющих собой яр -
ко-зеленые образования округлой формы с ровными краями, размером
около 300 мкм (приблизительно 1/100 от окружающих эпителиальных кле -
ток). Иногда наблюдаются ретикулярные тельца хламидий, размеры кото -
рых в 2-3 раза больше элементарных. Внутриклеточные включения выяв -
ляются не более, чем в 10% случаев.
Диагноз на хламидиоз считается отрицательным, если в препарате
отсутствует специфическое ярко-зеленое свечение при наличии красных
эпителиальных клеток. Для того, чтобы отрицательный диагноз можно было
считать достоверным, рекомендуется просматривать все поле мазка не ме -
нее 5 мин.
В качестве отрицательного контроля проводят микроскопию мазков,
приготовленных из конъюнктивы заведомо здоровых животных, специфиче -
ское ярко-зеленое свечение при наличии красных эпителиальных клеток
должно отсутствовать.
Любой флюоресцирующий материал неправильной формы или дру -
гого цвета, а также имеющий неяркую зеленую окраску, рассматривается
как артефакт
4.2.7. При исследовании препаратов непрямым методом ИФ на фик -
сированный мазок или мазок-отпечаток наносят иммунную хламидийную
нефлуоресцирующую сыворотку и выдерживают его во влажной камере при
тех же условиях. Затем промывают физиологическим раствором и высуши -
вают.
Для контроля на другой препарат наносят контрольную отрицатель -
ную сыворотку, выдерживают во влажной камере, затем окрашивают флуо -
ресцирующей антивидовой сывороткой.
При наличии в препаратах антигена хламидий обнаруживают специ -
фическое свечение в виде желто-зеленых гранул округлой и овальной
формы на тусклом зеленовато-сером фоне. В контрольном препарате спе -
цифическое свечение должно отсутствовать.
5. Выделение хламидий из патологического материала и их идентификация.
5.1. Подготовка материала. Из патологического материала готовят
10% суспензию на стерильном физиологическом растворе рН 7,2-7,4 и
центрифугируют ее при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жид -
кость переносят в стерильные пробирки (флаконы) и вносят в нее анти -
биотики: 500 мг/куб. см стрептомицина 150 мг/куб. см гентамицина или 500
ед/куб. см. канамицина. Пробы экссудата (в нативном виде или разведенные 1:2 сте -
рильным физраствором) обрабатывают теми же антибиотиками; выдер -
живают при 4 °С в течение 2 часов и высевают на питательные среды
(МПА, МПБ) для исключения бактериального загрязнения. Через сутки при
отсутствии роста микрофлоры на питательных средах материал исполь -
зуют для заражения куриных эмбрионов или лабораторных животных.
5.2. Выделение хламидий на куриных эмбрионах (КЭ). Исследуемый
материал, подготовленный как указано в пункте 5.1, вводят в объеме
0,2 куб. см в желточный мешок 6-7-дневным КЭ. Каждым материалом заражают
не менее 6 эмбрионов. Для контроля оставляют такое же количество
незараженных эмбрионов. Инкубируют КЭ в термостате при 37 °С в течение
7 дней.
Гибель эмбрионов в первые двое суток после заражения считают
неспецифической. Эмбрионы, погибшие на 4-7 день после заражения,
вскрывают с соблюдением правил асептики, отбирают в стерильную посуду
желточные мешки.
Из желточных мешков готовят мазки или мазки-отпечатки и
окрашивают по Романовскому-Гимзе или моноклональными антителами,
меченными ФИТЦ, и проводят идентификацию хламидий методом световой
или люминесцентной микроскопии(п. п. 4.1; 4.2).
При отсутствии специфической гибели эмбрионы на 7 день вскры -
вают и проводят второй пассаж по общепринятой методике. Для заражения
используют центрифугат 10% суспензии желточных мешков, который
предварительно обрабатывают антибиотиками и проверяют на отсутствие
бактериальной контаминации. При пассажах специфическая гибель КЭ
может наблюдаться на 3-7 сутки после заражения. Из желточных мешков
погибших эмбрионов готовят мазки или мазки-отпечатки, окрашивают и
исследуют методом световой или люминесцентной микроскопии.
При отсутствии специфической гибели эмбрионов во втором пассаже
проводят третий пассаж
Обнаружение хламидий или антигенов хламидий или ДНК хламидий в
мазках-отпечатках или патматериале из желточных мешков эмбрионов в
любом из трех последовательных пассажей считают положительным
результатом.
5.3. Выделение хламидий из лабораторных животных Для выделения хламидий
из патологического материала заражают не менее четырех белых мышей весом
5-10 г. Исследуемый материал, подготовленный как указано в п. 5.1., вводят
внутрибрюшинно в дозе 0,5-1,0 куб. см или в мозг в дозе 0,03 куб. см.
При внутрибрюшинном заражении животные находятся под наблю -
дением в течение 10 дней. У больных и павших мышей при вскрытии обна -
руживают скопление экссудата в брюшной полости, увеличение селезенки
и печени, очаговую гиперемию легких.
При заражении животных в мозг наблюдение за ними проводят в те -
чение 7 дней. Животные погибают с клиническими признаками энцефалита.
Из пораженных органов (паренхиматозных органов или оболочек
мозга) и экссудата готовят мазки или мазки-отпечатки, и исследуют с помо -
щью световой или люминесцентной микроскопии на наличие хламидий или
их антигенов.
При отсутствии специфической гибели животных убивают эфиром
или хлороформом и проводят второй пассаж на том же виде и количестве
животных. Для внутрибрюшинного заражения используют центрифугат
10%-ной суспензии паренхиматозных органов мышей, зараженных в первом
пассаже; при заражении в мозг - центрифугат 10%-ной суспензии из обо -
лочек головного мозга.
Из пораженных органов больных или павших мышей готовят мазки-
отпечатки и исследуют методом световой или люминесцентной микроско -
пии.
При отсутствии специфической гибели животных во втором пассаже
проводят третий пассаж.
Результаты исследования считают положительными в случае обна -
ружения хламидий или их антигенов или ДНК хламидий в мазках-отпечатках
или в патматериале из органов больных или павших животных в любом из
трех последовательных пассажей.
6. Выявление и идентификация ДНК C. psittaci методом полимеразной цеп -
ной реакции (ПЦР)
6.1 Метод предназначен для выявления ДНК C. psittaci с помощью
ПЦР в патологическом материале от птиц. В основе метода лежит
многократное повторение циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе
при температуре 95 °С, отжига специфических олигонуклеотидных затравок
(праймеров) при температуре 62 °С и синтеза комплементарных цепей ДНК
с помощью фермента при температуре 72 °С.
В качестве неконкурентного внутреннего стандарта используется
фрагмент неспецифической ДНК фага лямда, позволяющий контролировать
эффективность протекания всего процесса для каждой исследуемой пробы.
Метод предназначен для идентификации хламидий методом ПЦР.
6.2. В ПЦР используют следующие наборы:
1) набор для выделения ДНК, " ДНК-сорб-ПЦР ",
2) набор для ПЦР-амплификации участка ДНК хламидий,
3) набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР.
6.2.1. Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
- лизирующий раствор -1 пробирка, 30 куб. см;
- отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 куб. см;
- концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 куб. см;
- суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 куб. см;
- буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 куб. см.
Дополнительно необходим 96%-ный этанол (ректификат), 100 куб. см.
6.2.2. Набор для проведения ПЦР состоит из следующих
компонентов:
- смесь праймеров "Chla" -1 пробирка, 0,25 куб. см;
- смесь праймеров "ВС-Л" -1 пробирка, 0,25 куб. см;
- смесь нуклеотидов -1 пробирка, 0,5 куб. см;
- 5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 1,0 куб. см;
- деионизованная вода -1 пробирка, 2 куб. см;
- фермент Taq-полимераза -1 пробирка, 0,1 куб. см;
- положительная контрольная ДНК (ДНК C. psittaci) -1 пробирка,
0,2 куб. см;
- ДНК внутреннего стандарта (ДНК ВС-Л) -1 пробирка, 1,0 куб. см;
- воск для ПЦР - 2 пробирки по 1,0 куб. см;
- масло минеральное -1 пробирка, 5,0 куб. см.
6.2.3. Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР
состоит из следующих компонентов:
- концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 куб. см;
- агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.
6.3. Отбор материала для исследования.
При отборе образцов материала, а также при подготовке проб
для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие
обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом
действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
6.3.2. Для исследования используют: соскобы с конъюнктивы и
клоаки, биоптаты (кусочки паренхиматозных органов), помет.
6.3.3. Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 куб. см, из
тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см (при невозможности
толщина кусочков может быть меньше).
6.3.4. Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на
следующий день, сохраняя при 4 °С. Допускается хранение материала при
минус 20 °С в течение 30 дней.
6.4. Подготовка исследуемого материала.
Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся
пипеточными дозаторами переменных объемов (типа "Ленпипет") с исполь -
зованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 куб. см и 10,0 куб. см
(ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая
пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в спе -
циальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор
хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
6.4.2. Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 куб. см центрифуги -
руют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем
проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора
Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,5 куб. см
жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят
еще 10 куб. см материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспенди-
руют в оставшейся надосадочной жидкости, переносят в пробирку
"эппендорф" и осаждают на микроцентрифуге при 11000 об/мин в течение
8-10 мин. Супернатант отбрасывают, осадок ресуспендируют в 100 мкл фи -
зиологического раствора и используют для выделения ДНК.
6.4.3. Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, разме -
ром 3х3х3 мм помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно расти -
рают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 куб. см физиологи -
ческого раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при тем -
пературе 20-25 °С в течение 30 мин, после чего верхнюю фазу переносят в
другие пробирки "эппендорф" и центрифугируют при об/мин в
течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспен -
дируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения
ДНК.
6.4.4 Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 куб. см физиологи -
ческого раствора, осаждают на микроцентрифуге при об/мин в
течение 3-5 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспен -
дируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения
ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пи -
петки), то пробу обрабатывают 1-2 куб. см раствора 0,1М меркаптоэтанола,
добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе, выдерживают при
комнатной температуре 3-5 мин. и центрифугируют в вышеуказанном режи -
ме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделе -
ния.
6.4.5. Пробы помета птиц в количестве 0,1-0,2 г вносят в пробирку с
0,5 куб. см физиологического раствора, тщательно перемешивают и осаждают
на микроцентрифуге при 2000 об/мин в течение 1 мин. Осадок отбрасыва -
ют, а Супернатант используют для выделения ДНК.
6.5 Проведение ПЦР-анализа.
6.5.1. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помеще -
ниях (зонах), для работы в которых дополнительно требуются следующие
материалы и оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:
- настольный бокс с бактерицидной лампой;
- термостат для пробирок типа "эппендорф" на 25-100 °С;
- микроцентрифуга до об/мин;
- центрифуга/вортекс "Микроспин";
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от
0,001 куб. см до 1 куб. см;
- одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;
- одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 куб. см типа
"эппендорф";
- штативы для пробирок, наконечников;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
- холодильник на 2-8 °С с морозильной камерой.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2:
- амплификатор;
- ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;
- отдельный халат и одноразовые перчатки;
- отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от
0,001 куб. см до 1 куб. см;
- одноразовые наконечники в штативах:
- одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 куб. см;
- штативы для микропробирок на 0,5 куб. см;
- холодильник на 2-8 °С, морозильник на минус 20 °С для выделенных
ДНК;
- термостат для микропробирок с воском на 95 °С.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3:
- камера для горизонтального электрофореза;
- источник постоянного тока на 150-200 В;
- ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;
- фотоаппарат для фотографирования гелей и фотопленка;
- бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
- аквадистиллятор;
- отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки:
- отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
- мерный цилиндр на 1л;
- колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
- электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
6.5.2. Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.
Выделение ДНК из 100 мкл предварительно подготовленного пато -
логического материала проводят с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР».
Приготовить отмывочный раствор 2, для этого в отдельном флаконе
смешать 20 куб. см концентрата из набора, 80 куб. см дистиллированной воды и
100 куб. см 96% этанола. Хранить раствор при комнатной температуре в плот -
но завинчивающемся флаконе.
Проверить состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать
приблизительно половину объема суспензии.
В плотно закрывающуюся полипропиленовую пробирку на 1,5 куб. см
(желательно с завинчивающейся крышкой) внести по 100 мкл
предварительно подготовленной исследуемой пробы, отрицательной или
положительной пробы, добавить по 300 мкл лизирующего раствора (в
каждую пробу отдельным наконечником) и тщательно перемешать
пипетированием 3-10 раз.
Добавить 15-20 мкл ресуспендированного сорбента, хорошо пере -
мешать на вортексе, поставить в штатив на 5-7 мин. для полного осаждения
сорбента.
Осадить сорбент на микроцентрифуге в течение 30 сек. при 3000-
8000 об/мин. Отобрать супернатант из каждой пробирки отдельным
наконечником (удобно успользовать вакуумный отсос).
Добавить по 300 мкл отмывочного раствора 1, перемешать на
вортексе до полного ресуспендирования сорбента (если сорбент плохо
разбивается разбить его при помощи пипетки), осадить на центрифуге при
об/мин в течение 30 сек. Отобрать супернатант из каждой
пробирки отдельным наконечником.
Добавить по 800 мкл отмывочного раствора 2, перемешать на
вортексе до полного ресуспендирования сорбента, осадить на
микроцентрифуге при об/мин в течение 30 сек, отобрать супер -
натант.
Повторить процедуру отмывки, тщательно отобрать супернатант,
высушить осадок сорбента в термостате при 65 °С, в течение 5 мин.
Ресуспендировать сорбент в 30-40 мкл элюирующего буфера,
поместить в термостат на 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на
вортексе.
Осадить на микроцентрифуге при максимальных оборотах 1 мин.
Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную
ДНК.
В качестве отрицательного контроля на этапе выделения ДНК
необходимо использовать физраствор или деионизованную воду.
Эффективность выделения ДНК с помощью набора «ДНК-сорб-ПЦР»
составляет%.
Клинический или патологический материал | Соскоб с конъюктивы или клоаки | Биопат, фекалии |
Число пипетирований | 5-10 раз | 10 раз |
Объем сорбената | 20 мкл | 25 мкл |
Скорость осаждения сорбента | 6000 об/мин | об/мин |
Объем элюента | 30-40 мкл | 40 мкл |
Эффективность выделения ДНК | 30-40 % | 50-60 % |
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 °С до полного
расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя
стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при
120°С):
- отдельно для амплификации ДНК C. psittaci: к 0,25 куб. см праймеров
"Chla" добавляют 0,25 куб. см нуклеотидов, смешивают на вортексе;
- отдельно для амплификации ДНК ВС-Л: к 0,25 куб. см праймеров "ВС-Л"
добавляют 0,25 куб. см нуклеотидов, смешивают на вортексе.
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси,
наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он
полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых
наносят пометки "Chla" или "ВС-Л". Если воск покрыл жидкость неровно
или образовались пузыри, прогревают пробирки в амплификаторе 5 мин.
при 95 °С и охлаждают. В таком виде пробирки хранятся в морозильнике
несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 куб. см 5-кратного реакционного буфера
добавляют 0,45 куб. см деионизованной воды и 0,05 куб. см Taq-полимеразы,
хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8 °С в течение
месяца (не замораживать!). Выставляют два ряда пробирок с "нижними"
смесями ("Chla" и "ВС-Л") в штатив по числу испытуемых проб, включая
контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют
пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода, ДНК C. psittaci и ДНК
ВС-Л, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их
Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси,
при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с "нижней"
смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по
10 мкл проб - испытуемых и контрольных двух этапов анализа (для каждой
пробы две пробирки - из ряда "Chla" и ряда "ВС-Л"). Набирают на
амплификаторе нужную программу:
- для C. psittaci:
Амплификаторы с регулиро - ванием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения - не менее1 °С/сек) "Ампли-3" (Биоком)" "MiniCycler", "PTC-100" (MJ Research) | Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке) "GeneAmp PSR System 2400" (Perkin Elmer) "Omn-E" (Hibaid) "Терцик" (ДНК-технология) |
95 °С - 2мин 1 цикл 95°С -1 мин. 62°С -1 мин. 72 °С -1 мин 40циклов 10° С -12-14 час (хранение) | 95 °С - 2 мин 1цикл 95°С-10с, 62° С-10 с, 72 °С-10 с 40циклов 10 °С -12-14 час (хранение) |
- для ВС-Л:
95 °С - 2мин 1 цикл 95°С -1 мин. 65°С -1 мин. 72 °С -1 мин 40циклов 10° С -12-14 час (хранение) | 95 °С - 2 мин 1цикл 95°С-10с, 65° С-10 с, 72 °С-10 с 40циклов 10 °С -12-14 час (хранение) |
Через 1-2 мин после запуска программы, когда температура в ячейке
амплификатора достигнет 95 °С, ставят программу на паузу, помещают
пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут
окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с
регулированием температур по матрице и 1 час 40 мин на амплификаторе с
активным регулированием). После окончания реакции (в тот же день или
после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный
пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР, который
проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:
-C. psittaci -1033 п. н.
-ВС-Л -500 п. н.
ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
Работа с амплифицированными ДНК должна проводиться в
отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не
производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения
работ в диагностических лабораториях, использующий метод
полимеразной цепной реакции. Основные положения.", утвержденные Де -
партаментом ветеринарии МСХиП РФ 27 января 1997 г.№ 13-7-2/840).
В мерный цилиндр наливают 25 куб. см концентрированного буфера,
доводят дистиллированной водой до 500 куб. см, закрывают цилиндр
парафинированной пленкой ("PARAFILM") и перемешивают. Агарозу из
одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого
стекла объемом 250 куб. см, наливают 100 куб. см готового буфера и плавят на
кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого
кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу. Заливают
агарозный гель в форму (толщина 5-6 мм), помещают гребенки на
расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре)
осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу
готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены
в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к
положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько,
чтобы он покрыл гель на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами
амплификации в штатив в два ряда (на основе праймеров" Chla" и "ВС-Л").
Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки
(например, амплификат пробы №6 из ряда "Chla" вносят в одну полосу
геля, затем амплификат той же пробы из ряда "ВС-Л" - в другую полосу.
Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1-2
раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если
нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны
подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения
10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно
половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на
трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и
совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета.
Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым
излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской
или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в
проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300"
или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить
с помощью других систем; Insta Doc I, Insta Doc II (фотографирующие), Gel
Doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).
6.5.3 Учет и интерпретация результатов.
Учет результатов ПЦР-анализа следует начинать с результатов
амплификации ДНК внутреннего стандарта. Все амплификаты "ВС-Л" (за
исключением "контролей ПЦР" - ДНК C. psittaci и деионизованная вода)
должны содержать полосу 500 п. н. Если в дорожке какой-либо исследуемой
пробы полоса внутреннего стандарта отсутствует, то отрицательный
результат анализа данной пробы на ДНК C. psittaci учитывать нельзя.
Положительные пробы должны содержать специфическую
светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности строго на том же
уровне, что и полоса с положительным контрольным образцом ДНК
C. psittaci В ярко положительных пробах может отсутствовать полоса ВС-Л
и результат учитывают как положительный при условии правильного учета
результатов анализа "контролей".
Отрицательными считаются пробы, которые содержат только полосу
ВС-Л.
Кроме полос 1033 п. н. и 500 п. н. в дорожках могут наблюдаться
нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже
уровня 100 н. п. (в нижней части дорожки).
Интерпретация результатов анализа:
Результат ПЦР-анализа | Результат амплификации исследуемой пробы | |
. | с праймерами на ДНК ВС-Л | с праймерами на ДНК С. psitaci |
Положительный | + | + |
Положительный | - | + |
Отрицательный | + | - |
Недействительный | - | - |
Учет результатов амплификации контрольных образцов:
. | Название реагента | с праймерами "ВС-Л" | с праймерами на "С. psitaci" |
"контроли" 1-го этапа | Физиологический раствор | + | - |
Элюирующий буфер | + | - | |
ДНК С. psitaci 1:10 | + | + | |
"контроли" 2-го этапа | ДНК С. psitaci 1:10 | - | + |
ДНК ВС-Л 1:10 | + | - | |
Деонизированная вода | - | - |
Если результаты анализа контрольных образцов не совпадают с
приведенными в таблице, то анализ считают недействительным и исследо -
вание повторяют.
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР
участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в
дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно
располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или
концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном
образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса
отсутствует.
Результаты анализа не учитываются, если:
- в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы.
Необходимо повторить исследование этой пробы с самого
начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы,
приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от
ингибиторов реакции.
- в дорожке любого отрицательного контроля выявляется
специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация
реактивов и проб положительной ДНК или продуктами
амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для
проверки реактивов необходимо поставить не менее трех
отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же
на этапе постановки ПЦР для выявления источника
контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить
реактивы.
- в дорожках появляются неспецифические полосы на разных
уровнях. Возможные причины; неправильное проведение
"горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках
амплификатора.
7. Диагноз на орнитоз (пситтакоз) птиц считают предварительным:
- при выявлении специфических антител в сыворотке крови в РСК
(РНСК) или ИФА;
Диагноз на орнитоз (пситаккоз) птиц считают окончательным при при -
менении любого прямого метода диагностики, который выявляет:
- хламидии, антигены хламидий или ДНК хламидий в исследуемом
материале.
8. Сроки исследований:
- выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;
- световая микроскопия - от 30 мин до 2 часов;
- люминесцентная микроскопия - около 40 мин;
- выделение и идентификация хламидий - от 7 до 30 дней;
- выявление ДНК хламидий - от 4 до 5 часов
С утверждением настоящего наставления утрачивают силу
"Методические указания по лабораторной диагностике орнитоза (пситтако-
за) птиц", утвержденные Главным управлением ветеринарии Министерства
сельского хозяйства СССР от 9 ноября 1988 года.
