Источники устойчивости яровой пшеницы к бурой ржавчине и изменчивость структуры популяции возбудителя в условиях нижнего Поволжья (стр. 1 )

На правах рукописи

ИСТОЧНИКИ УСТОЙЧИВОСТИ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ В УСЛОВИЯХ НИЖНЕГО ПОВОЛЖЬЯ

Специальность: 06.01.07 – защита растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата сельскохозяйственных наук

Саратов – 2013

Работа выполнена в государственном научном учреждении «Научно-исследовательский институт сельского хозяйства Юго-Востока Россельхозакадемии».

Научный руководитель:

доктор сельскохозяйственных наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Всероссийский научно-исследовательский институт биологической защиты растений, заведующая лабораторией иммунитета зерновых культур к болезням

доктор сельскохозяйственных наук, старший научный сотрудник, Саратовская лаборатория Всероссийского института защиты растений, заведующий лабораторией

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Россельхозакадемии»

Защита состоится «16» марта 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.05 при федеральном бюджетном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени »

г. Саратов, Театральная пл., д. 1.

e-mail: *****@***ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ»

Автореферат разослан «_____» ______________ 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и степень разработанности темы. В Нижнем Поволжье основной продовольственной культурой является пшеница. Только по данным Россельхозцентра Саратовской области ее посевы занимают до 30% всех посевных площадей региона. Большую угрозу урожаю пшеницы представляет комплекс фитопатогенов, среди которых бурая ржавчина занимает далеко не последнее место. Возбудитель заболевания гриб Puccinia recondita Rob. ex. Desm. F. sp. tritici является облигатным патогеном, дающим до 6 уредогенераций за вегетационный период, аэрогенным заболеванием, быстро распространяющимся воздушными массами на большие расстояния, что часто приводит к развитию эпифитотий. Все эти особенности патогена, а также наличие растений-промежуточников и полового процесса приводят к высокой динамичности его популяции, к появлению вирулентных патотипов и, как следствие, к потере сортами устойчивости.

Исследованием проблемы изменчивости популяции бурой ржавчины, а также созданием устойчивых сортов пшеницы занимались многие ученые, начиная с . Это , -Кожевников, , и многие другие. Однако, несмотря на то, что степень изученности данной проблемы достаточно высока, она не теряет своей актуальности. Внутрипопуляционные процессы бурой ржавчины, заставляют исследователей вновь обращать внимание на данный объект, работать с ним на более высоком современном уровне с применением молекулярных методов и интрогрессии новых более эффективных генов устойчивости от диких видов пшеницы, опережая, таким образом, развитие патогена.

В связи с этим данная работа, направленная на исследование динамики состава поволжской популяции бурой ржавчины, выявление источников и доноров устойчивости пшеницы к бурой ржавчине из мировой коллекции, изучение интрогрессивных линий и идентификации у них Lr-генов является актуальной и необходимой для эффективной селекции на устойчивость.

Цель исследований. Изучить изменчивость структуры популяции Puccinia recondita Rob. ex. Desm. F. sp. tritici по вирулентности под влиянием генотипов сортов, созданных в селекцентре Юго-Востока и создать генетическую основу, включающую образцы из мировой коллекции и интрогрессивные линии, для эффективной селекции на иммунитет.

Задачи исследований:

1.  Изучить структуру поволжской популяции бурой ржавчины и степень ее вирулентности.

2.  Провести скрининг мировой коллекции пшеницы и сортов местной селекции, выявить новые источники устойчивости к бурой ржавчине.

3.  Изучить типы устойчивости сортов яровой пшеницы к бурой ржавчине с использованием качественной и количественной характеристик развития заболевания.

4.  Провести идентификацию Lr-генов у трансгрессивных линий яровой пшеницы, используя фитопатологический тест и молекулярный скрининг.

5.  Изучить трансгрессивные линии по хозяйственно-ценным признакам.

Научная новизна. Впервые изучена динамика структуры популяции бурой ржавчины в зависимости от генотипов сортов, созданных в селекцентре Юго-Востока. Выявлены новые генетические источники устойчивости пшеницы к бурой ржавчине для селекции на иммунитет. Изучены типы устойчивости у 14 сортов яровой пшеницы в полевых условиях на фоне естественной эпифитотии бурой ржавчины.

Впервые с использованием фитопатологических и молекулярных методов проведена идентификация генов устойчивости к бурой ржавчине у 14 устойчивых к бурой ржавчине интрогрессивных линий, несущих генетический материал от Triticum persicum, Tr. dicoccum, Aegilops speltoides.

Положения диссертации, выносимые на защиту.

1.  Состав структуры популяции бурой ржавчины в зоне деятельности селекцентра Юго-Востока

2.  Новые источники устойчивости пшеницы к бурой ржавчине.

3.  Сорта яровой пшеницы – новые источники неспецифической устойчивости к бурой ржавчине

4.  Результаты молекулярной и фитопатологической диагностики Lr-генов у трансгрессивных линий яровой пшеницы

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость данной работы заключается в обосновании возможности создания сортов пшеницы с различными типами устойчивости, а также с продолжительной устойчивостью; в расширении генофонда пшеницы по устойчивости к патогенам. Для практической селекции предлагаются новые источники и доноры расоспецифической и нерасоспецифической устойчивости пшеницы к бурой ржавчине, а также интрогрессивные линии с эффективными Lr-генами.

Объект исследований. Образцы яровой мягкой пшеницы из мировой коллекции и местного селекционного материала. Поволжская популяция возбудителя бурой ржавчины пшеницы.

Предмет исследований. Устойчивость пшеницы к бурой ржавчине.

Методология и методы исследования. Исследования выполнены с использованием полевых, вегетационных и лабораторных методов.

Реализация результатов исследования. Устойчивые образцы пшеницы и интрогрессивные линии с генами устойчивости к бурой ржавчине переданы в 2012 г. в лабораторию селекции яровой мягкой пшеницы для введения в селекционный процесс.

Достоверность результатов. Эксперименты проведены в соответствии с общепринятыми методиками. При необходимости достоверность выводов подтверждалась статистической обработкой данных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию со дня рождения (Большие Вяземы, 2012), Третьей Всероссийской и международной конференции (Санкт-Петербург, 2012), Международной научно-практической конференции «Проблемы и перспективы инновационного развития мирового сельского хозяйства» (Саратов, 2011), Вавиловских чтениях (Саратов, 2010, 2011), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы и перспективы аграрной науки в России» (Саратов, 2012).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста и включают 48 рисунков, 10 таблиц, 3 приложения. Список литературы включает 233 источника, из них 85 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Посвящена аналитическому обзору литературы по биологии развития ( 1975; , 2002), вредоносности (, 1973; , 2012) и распространению возбудителя бурой ржавчины на посевах пшеницы (, 1964). Освещаются исследования генетики взаимоотношений патогена и растения-хозяина (, 1959; , 1978; -Кожевников, 1977; , 2003; , 1977). Анализируются результаты исследований многочисленных авторов по эволюции структуры популяции бурой ржавчины в различных регионах, в результате которых выработались различные типы устойчивости (Михайлова, 1996; , ; 2003; , 1998; , , 2000). Особое внимание уделяется работам по селекции пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине, как одному из основных факторов в системе интегрированной защиты пшеницы от данного заболевания (E. R. Sears, 1956; , 2000; , 2002; , , 2002; М. Койшыбаев, 2012; , 2012; H. E. Bockelman, 2012).

Глава 2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Полевые опыты проводились с 2009 по 2012 гг. на базе Научно-исследовательского института сельского хозяйства Юго-Востока (г. Саратов) в инфекционном питомнике лаборатории иммунитета.

В 2009 году месячная сумма осадков составила в мае 14,3 мм, в июне – 55,7 мм, в июле – 24,7 мм, в августе – 34,6 мм. Максимальная температура воздуха в июле−августе не превышала 300С. В 2010 году месячная сумма осадков в мае была 33,8 мм, в июне – 18,6 мм, в июле – 19,9 мм, в августе осадков не было, максимальная температура воздуха в июле-августе приближалась к 400С. В 2011 году месячная сумма осадков в мае составила 12,3 мм, в июне – 62,7 мм, в июле – 4,9 мм, в августе – 19,9 мм. Максимальная температура не превышала 340С. В 2012 году месячная сумма осадков была 6 мм, в июне – 46,7 мм, в июле – 27,2 мм, в августе – 94,8 мм. Максимальная температура не превышала 330С.

Основным материалом для исследований являлась мировая коллекция пшеницы из Всероссийского НИИ растениеводства
им. , ВНИИ фитопатологии, Международного центра улучшения кукурузы и пшеницы CIMMYT (Мексика), а также образцы из различных селекционных центров страны.

В качестве инфекционного материала использовались урединиоспоры поволжской популяции бурой ржавчины Puccinia recondita f. sp. tritici.

Материалом для молекулярной диагностики были взяты интрогрессивные линии яровой мягкой пшеницы, созданные в лаборатории иммунитета ГНУ НИИСХ Юго-Востока. В качестве контроля использовались соответствующие линии серии Thatcher (D. J. Samborski, 1981, 1982, 1984, 1985; McIntosh et al., 1995).

Исследования по оценке образцов пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине проводили в полевых условиях на фоне естественных эпифитотий или на фоне усиленного развития заболевания. Полевые оценки дополнялись оценками в условиях искусственного климата на проростках пшеницы.

Инфекционные питомники располагали на полях селекционных севооборотов, на изолированных участках. Посев изучаемого материала проводили ручными 8-ми сошниковыми аппаратами в рядки длиной 120 см, расстояние между рядками 10 см. Для усиления инфекционного фона все проходы между грядками, а также через каждые 10 рядков в грядках высевали сорт-накопитель инфекции (Саратовская 90).

Для полевой оценки использовали шкалу и др. (R. F. Peterson, A. B. Campbell, A. E. Hannah, 1948). Учет проводили в фазу максимального развития болезни. В условиях искусственного климата устойчивость образцов определяли по шкале Майнса и Джексона (E B. Mains, H. C Jackson, 1926).

В качестве показателя, характеризующего неспецифическую устойчивость сорта, использовали критерий скорости нарастания болезни, выражаемый площадью под кривой развития болезни (ПКРБ) (Wilcoxson et al., 1974).

Исследования структуры популяции бурой ржавчины проводили на наборе моногенных линий серии Thatcher по методике (1964).

Молекулярные маркеры использовали для идентификации 13 Lr-генов. ДНК выделяли по методике и Э. Клоке (1997). Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси по предложенным авторами протоколам и при необходимости модифицировали. Эти исследования выполнены в лаборатории микологии и фитопатологии ВИЗР при частичной поддержке гранта РФФИ .

Для исключения ошибок в интерпретации результатов молекулярного скрининга все посеянные для выделения ДНК растения оценивали по устойчивости к бурой ржавчине с использованием бензимидазольного метода , (1970). Для инокуляции использовали две популяции гриба (саратовскую и дербентскую). Дополнительно для идентификации гена Lr9 были выделены и размножены клоны, маркированные вирулентностью к данному гену.

Интрогрессивные линии изучались по основным элементам продуктивности колоса по общепринятым методикам (, , 1981). Определялась визуальная оценка качества зерна в баллах. В качестве стандарта был взят сорт яровой мягкой пшеницы Саратовская 55. Полученные данные подвергали дисперсионному анализу по методике (1988).

Глава 3. СТРУКТУРА ПОПУЛЯЦИИ БУРОЙ РЖАВЧИНЫ В НИЖНЕМ ПОВОЛЖЬЕ

3.1 Динамика состава популяции и степень ее вирулентности

Поволжская популяции бурой ржавчины отличается высокой динамичностью. Анализ исследований лаборатории иммунитета за 2006 – 2008 гг. и результаты собственных исследований свидетельствуют о высокой степени вирулентности данной популяции P. recondita (таблица 1).

Таблица 1 – Степень вирулентности местной популяции бурой ржавчины

Годы исследований	Формула авирулентности / вирулентности (авирулентные R-гены / вирулентные R-гены)	Количество авирулентных / вирулентных генов
	9, 38 / 1, 2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 12, 13, 14a, 14b, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22a, 22b, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 44, B, W	2/38
	9, 38 / 1, 2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 12, 13, 14a, 14b, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22a, 22b, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 44, B, W	2/38
2	9, 38 / 1, 2a, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 12, 13, 14a, 14b, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22a, 22b, 23, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 44, B, W	2/38

3.2. Анализ частоты встречаемости отдельных клонов вирулентности в зависимости от условий вегетационного периода и возделывания сортов с генами устойчивости к бурой ржавчине

Все Lr-гены в поволжской популяции бурой ржавчины, можно условно разделить на 4 группы:

1.  Lr-гены, неэффективные к поволжской популяции бурой ржавчины, за все годы исследований сохранявшие высокую частоту встречаемости. К этой группе следует отнести гены Lr1, 2а, 2b, 2c, 3a, 3bg, 3ka, 10, 11, 12, 13, 15, 18, 20, 21, 22a, 22b, 30, 34, 35, 37, B. За весь период исследований частота встречаемости данных генов не изменялась и составляла 100%.

2.  Lr-гены, неэффективные к поволжской популяции бурой ржавчины, но изменяющие частоту практически ежегодно. К этой группе относятся гены Lr14а, 14b, 16, 17, 25, 28, 29, 32, 36, 45, W (рисунок 1). Данные гены не используются в селекции.

3.  Эффективные Lr-гены, широко использующиеся в селекции на устойчивость, но снижающие эффективность в результате появления в популяции комплементарных им генов вирулентности.

К ним относятся гены Lr19, Lr23, Lr24, Lr26. В поволжской популяции новый клон вирулентности pр19 был выявлен сотрудниками лаборатории иммунитета еще в 1985 году. Но в последние годы () частота встречаемости данного клона сначала стабилизировалась, а затем заметно сократилась. В наших исследованиях частота встречаемости снизилась от 81,8 % в 2006 году до 70 % в 2009 году (рисунок 2).

Так же известно, что клон рр19 не переносит высоких температур. Неблагоприятный температурный режим вегетационного периода 2009 года привел к снижению частоты встречаемости данного клона до 60%. А условия 2010 года оказались для клона рр19 критическими, то есть в популяции он отсутствовал. Однако температурный режим 2011 года оказался для данного клона более благоприятным, поскольку он опять появился в структуре популяции. Частота встречаемости клона рр19 достигла 40%.

Рисунок 1 Частота встречаемости патотипов бурой ржавчины второй группы

Заметные колебания частоты встречаемости клона рр19 в поволжской популяции бурой ржавчины объясняются еще и тем, что в селекционном арсенале по-прежнему используются доноры и источники устойчивости с геном Lr19, а в производстве возделываются сорта с данным геном. Поэтому следует ожидать дальнейшее нарастание клона рр19, и, следовательно, снижение эффективности гена Lr19.

Рисунок 2 Частота встречаемости клонов рр19, рр23, рр24, рр26 в поволжской популяции бурой ржавчины

Ген Lr23 является температурочувствительным, поэтому в наших исследованиях выявлено постепенное снижение частоты встречаемости клона рр23 с 83,3% в 2005 году до 60% в 2009 году (рисунок 2). Но высокий температурный режим вегетационного периода 2010 года оказал на клон рр23 положительное влияние, и в результате наблюдалось увеличение частоты встречаемости данного клона до 100%. Вегетационный период 2011 года отличался более низкими температурами, поэтому частота встречаемости клона рр23 снизилась до 80%.

4.  Lr-гены, сохраняющие на территории Поволжья высокую эффективность. К этой группе следует отнести гены Lr9 и Lr38.

Таким образом, поволжская популяция Puccinia recondita f. sp. tritici эволюционно активна. Большинство моногенных линий сорта Thatcher перестают дифференцировать популяцию. Как показывают наши исследования, частота встречаемости отдельных патотипов в природных популяциях может меняться не только от использования соответствующего гена устойчивости в коммерческих сортах, но и от изменений климатических условий, происходящих в последние годы в регионе и оказывающих значительное влияние на уровень вирулентности популяции бурой ржавчины. Поэтому исключение каких-либо линий Thatcher из набора может стать причиной потери ценной информации об изменениях, происходящих в структуре природных популяций бурой ржавчины. Дифференциация популяции бурой ржавчины при помощи моногенных линий серии Thather позволяет объяснить ситуацию, существующую в структуре популяции патогена, а также установить причину потери сортами устойчивости.

Глава 4. ИСТОЧНИКИ И ДОНОРЫ УСТОЙЧИВОСТИ ПШЕНИЦЫ К БУРОЙ РЖАВЧИНЕ

4.1  Скрининг мировой коллекции и сортов отечественной селекции

За период 2009 – 2012 гг. в полевых условиях и в условиях искусственного климата была проведена иммунологическая оценка 612 коллекционных образцов яровой пшеницы. В результате они были разделены на 4 группы. Наибольшее количество образцов было получено из СИММИТА (Мексика), США и селекцентров России. В изучаемую коллекцию были включены образцы из стран Западной Европы, стран Латинской Америки, Канады (таблица 2). Контролем служил восприимчивый к бурой ржавчине сорт Юго-Восточная 2.

Таблица 2 – Результаты скрининга мировой коллекции яровой пшеницы

Страна	Всего образцов	Из них
Высоко устойчивых	Устойчи-вых	Слабо восприим-чивых	Восприим-чивых
Мексика	387	135	186	47	19
Россия	158	32	43	6	77
США	27	7	19	0	1
Страны Западной Европы	22	3	10	3	6
Страны Латинской Америки	12	1	10	1	0
Канада	5	0	2	0	3

4.2  Типы устойчивости сортов пшеницы к бурой ржавчине в условиях искусственного климата и полевых условиях при естественных эпифитотиях

За период 2009 – 2012 гг. при проведении иммунологической оценки в полевых условиях были изучены образцы, имеющие восприимчивый тип реакции (3-4 балла), но различающиеся по скорости нарастания поражения бурой ржавчиной (рисунок 3).

Рисунок 3 Результаты оценки образцов яровой пшеницы на устойчивость к бурой ржавчине

В результате выделены две группы образцов. Образцы первой группы имели восприимчивый тип реакции 3-4 балла по шкале Мэйнса-Джексона. Однако в полевых условиях, при пораженности стандартных по восприимчивости сортов на 70-80%, поражение образцов первой группы не превышало 20-30%, первые урединиопустулы на растениях появлялись гораздо позже, нарастание инфекции происходило медленнее. То есть данные образцы возможно обладают неспецифической устойчивостью к патогену. Вторая группа образцов также имела восприимчивый тип реакции и высокую скорость нарастания инфекции бурой ржавчины. К концу вегетации поражение их достигало 60-70 и 80-90%.

Для подтверждения полевой оценки неспецифической устойчивости определяли скорость нарастания заболевания, которая выражается площадью под кривой развития болезни (ПКРБ) (таблица 5).

Таблица 5 – Полевая оценка неспецифической устойчивости сортов яровой пшеницы к бурой ржавчине по скорости нарастания болезни, (ПКРБ)

№ п/п	Сорт	Происхож-дение	Тип реак-ции	Пораженность бурой ржавчиной, %	ПКРБ, у. е.
3.06	11.06	18.06	26.06	2.07	9.07
1	Саратовская 55	Россия	3	0	20	30	50	60	70	1360
Восприимчивые сорта
2	Икар	Россия	3	0	5	15	20	50	60	860
3	Granny	Чехословакия	3	0	5	5	10	60	70	780
4	Бэль	Россия	3	0	10	50	60	80	90	1705
5	Новосибирская 15	Россия	3	0	20	30	30	80	90	1420
6	Баганская 95	Россия	3	0	30	50	50	60	70	1585
7	Катюша	Россия	3	0	30	40	40	50	60	1340
8	Омская 35	Россия	3	0	40	60	70	70	80	1975
Сорта с неспецифической устойчивостью
9	SW Vals	Швеция	3	0	5	5	5	5	10	177,5
10	Легенда	Россия	3	0	0	10	10	10	10	245
11	Katepwa	Мексика	3	0	0	0	5	10	15	152,5
12	Симбирцит	Россия	3	0	0	0	1	20	30	242
13	Новосибирская 29	Россия	3	0	1	5	5	15	20	247,5
14	Красноуфимская	Россия	3	0	1	5	10	15	20	282,5

Данные группы сортов отличаются интенсивностью нарастания поражения (рисунки 4 и 5). Интенсивность нарастания поражения у восприимчивых сортов может иногда превышать скорость нарастания сорта-стандарта.