Влияние низкой концентрации свинца на плаценту и плод (стр. 1 )

На правах рукописи

Куликова

Галина Викторовна

ВЛИЯНИЕ НИЗКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СВИНЦА

НА ПЛАЦЕНТУ И ПЛОД

(экспериментальное исследование)

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» и ФГУ "Московский НИИ психиатрии Росздрава"

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Наталия Ивановна Бубнова

доктор медицинских наук Марат Галиевич Узбеков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Марина Николаевна Болтовская

доктор медицинских наук Рудольф Михайлович Худоерков

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт

биологии развития им. РАН

Защита состоится « » _______________ 2008 года в _____ часов на заседании

Диссертационного совета Д 001.004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «____ »______________ 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Лилия Петровна Михайлова

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ANOVA однофакторный дисперсионный анализ

ВКС высокая концентрация свинца

ГК гигантские клетки плаценты

Г-6-ФД глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа

К контрольная группа

K-S критерий парных сравнений Колмогорова-Смирнова

K-W дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса

МАО моноаминоксидаза

М среднее арифметическое

м стандартная ошибка

Ме медиана

Мt медианный тест

М-W непараметрический критерий Манна – Уитни

НАДФ•Н-Д НАДФ•Н-дегидрогеназа

НК негликогенные клетки

НКС низкая концентрация свинца

СОД Zn-Cu-супероксиддисмутаза

ТЭБ трофобласт эпителиальных балок

Pbк концентрация свинца в крови

t-критерий критерий Стъюдента

σ стандартное отклонение

χ 2 критерий хи-квадрат

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ухудшение экологической обстановки является одним из лидирующих факторов в нарушении репродуктивной функции женщины и фактором риска для здоровья ребёнка [, 1994; и др., 1996; ВОЗ, 2004]. Среди наиболее опасных техногенных загрязнителей окружающей среды приоритетное положение занимает свинец и его производные [ВОЗ, 2003, 2004; WHO, 1995, 2007].

Прогрессирующее в последнее столетие накопление свинца в почве, атмосферном воздухе и воде привело к увеличению его концентрации в крови человека до таких значений, превышение которых может иметь необратимые последствия для популяции в целом [, и др., 2001; и др., 2002; WHO, 2007]. Международные нормативы безопасного содержания свинца в организме женщин репродуктивного возраста и детей существенно различаются (25 мкг/дл и 5 мкг/дл, соответственно). В связи с этим, при беременности создаются условия для неблагоприятного воздействия свинца на плод [Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2007].

До настоящего времени механизмы влияния низких концентраций свинца на плаценту и развивающийся плод остаются практически не изученными [Semczuk M., Semczuk-Sikora A., 2001]. Между тем, эти знания могут служить теоретическим основанием для разработки практических мероприятий по защите плода от негативного влияния свинца.

Цель исследования. Изучить влияние на плаценту и плод низкой концентрации свинца в условиях различной продолжительности его воздействия.

Задачи исследования.

1. Определить содержание свинца в крови самок крыс при введении с питьевой водой различных концентраций свинца.

2. Изучить в эксперименте эмбриотропное действие низкой и высокой концентраций свинца в условиях различной продолжительности их воздействия.

3. Исследовать морфофункциональное состояние плаценты, почек и легкого плода в условиях различной длительности воздействия низкой и высокой концентраций свинца.

4. Изучить активность супероксиддисмутазы в печени и головном мозге плодов для оценки состояния антиоксидантной защиты в этих органах в условиях различной длительности воздействия низкой и высокой концентраций свинца.

5. Обосновать механизмы влияния низкой концентрации свинца на плаценту, почки, легкое, головной мозг и печень плода.

Научная новизна

Впервые установлены морфофункциональные, стереометрические и гистохимические параметры плаценты в условиях длительного влияния на материнский организм низкой и высокой концентраций свинца. Низкая концентрация свинца вызывает в плаценте дистрофические, некробиотические и дисциркуляторные изменения, снижение активности глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и моноаминоксидазы в различных структурах этого органа. При длительном воздействии низкой концентрации свинца в лабиринтном отделе плаценты (основном обменном звене между матерью и плодом) установлено статистически значимое увеличение удельного объема эпителия трофобласта лабиринтных балок за счет снижения удельного объема материнских лакун и сосудистого русла плода. При влиянии высокой концентрации свинца изменения в плаценте носили сходный характер.

Впервые установлены дисциркуляторные, дистрофические и некробиотические изменения, а также задержка дифференцировки легкого и почки плода при длительном введении самкам низкой и высокой концентраций свинца. В основе описанных патологических реакций лежат снижение активности Г-6-Ф-дегидрогеназы, катализирующей образование восстановленного НАДФ, необходимого для биосинтетических процессов, нарушение активности МАО, ответственной за обмен биогенных моноаминов, и снижение активности Zn-Cu-супероксиддисмутазы, влияющей на состояние антиоксидантной защиты.

Научно-практическая значимость

Обоснованы патогенетические механизмы структурно-функциональных повреждений в системе плацента-плод в условиях длительного влияния низкой концентрации свинца.

Установлено, что повышение уровня свинца в крови матери сочетается с нарушением кровообращения, дистрофическими, некробиотическими изменениями, нарушением обменных процессов и состояния антиоксидантной защиты в плаценте и органах плода, задержкой развития легкого и почки плода.

Результаты исследования могут явиться базисом для разработки мер защиты матери и плода в условиях экологического риска.

Гистохимическое выявление свинца (по Кретену в модификации Фархолла) в структурных элементах плаценты и органах плода в эксперименте явилось предпосылкой для апробации данного метода на материале плаценты человека. По этому разделу работы опубликовано информационное письмо (Применение метода с хроматами для выявления солей свинца в тканях последа и новорожденных детей при аутопсии: информационное письмо / , , . - М.: Министерство здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации, 19с.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Низкая концентрация свинца (0,3 мг/л) при различной длительности воздействия на самку крыс приводит к повышению уровня свинца в крови самки крысы, увеличению до - и постимплантационной гибели эмбрионов.

2. Низкая (0,3 мг/л) концентрация свинца при длительном воздействии вызывает циркуляторные расстройства, различной степени выраженности повреждение и снижение метаболической активности в структурах плаценты.

3. Длительное введение низкой концентрации свинца экспериментальным животным вызывает структурно-метаболические нарушения и снижение антиоксидантной защиты в органах плодов, что сопровождается задержкой их роста и дифференцировки.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на II-ом съезде акушеров-гинекологов Северного Кавказа, Ростов-на-Дону (1998); на XIII-ом съезде психиатров России, Москва (2001); на IV-ом Российском форуме “Мать и дитя”, Москва (2002); на VI-ой Международной конференции “БИОАНТИОКСИДАНТ”, Москва (2002); на VI-ом Российском форуме “Мать и дитя”, Москва (2004) г; на VII-ом Российском форуме “Мать и дитя”, Москва (2005); межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (октябрь 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 31 таблицей и 57 рисунками. Библиографический указатель включает 210 работ цитируемых авторов, из них 68 отечественных и 142 зарубежных. Материал, представленный в диссертации, собран и обработан автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено в соответствии с отечественными нормативными документами, регламентирующими экспериментальную работу с использованием лабораторных животных: «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» (1973); «Правилами по обращению, содержанию, обезболиванию и умерщвлению экспериментальных животных» (1977), ГОСТами Р 51000.3-96 и Р 51000.4-96.

Объект исследования и модель эксперимента

Объектом исследования служили самки крыс породы Вистар, их кровь, плоды и плаценты. Животных содержали в индивидуальных пластиковых клетках на стандартном рационе. Исходная масса половозрелых самок составляла 180 – 190 г. Подопытные крысы получали в качестве единственного источника жидкости раствор нитрата свинца. Применялись две концентрации свинца, которые в растворе рассчитывали по иону свинца: низкая - 10 ПДК (0,3 мг/л) и высокая -100 ПДК (3,0 мг/л) для питьевой воды. Было поставлено три серии эксперимента: в 1-й серии воздействие обеих концентраций свинца продолжалось в течение всей беременности (с 1-го по 20-й день), во 2-й – в течение одного месяца до наступления беременности и во время всей беременности, в 3-й – в течение пяти месяцев до наступления беременности и во время всей беременности. Соответствующим контролем служили самки, не получавшие вне - и во время беременности свинец в питьевой воде. Характеристика групп исследования представлена в табл. 1.

Для получения датированной беременности, самок в стадии проэструс-эструс подсаживали на ночь к интактным самцам в соотношении 2:1. Наличие сперматозоидов в вагинальных мазках на следующее утро свидетельствовало о наступлении первого дня беременности.

Состояние материнского организма (82 самки крысы) во время беременности оценивали по еженедельному приросту массы тела, визуальной оценке двигательной активности, суточному объёму потребляемой жидкости, отношению к корму, качеству шёрстного покрова. На 21-й день беременности у самок, длительно получавших свинец и в контроле (II и III серии), под общим комбинированным наркозом (калипсол – 30 мг/кг массы тела и реланиум 2 мг/кг) забирали кровь из сердца для определения концентрации свинца (52 определения) и плоды из рогов матки.

Таблица 1. Характеристика групп исследования

Серия опыта	Группа наблюдения	Концентрация свинца	Исследовано
самок	плодов
I	К	-	10	90
НКС	0,3 мг/л	10	95
ВКС	3,0 мг/л	10	111
II	К	-	10	106
НКС	0,3 мг/л	9	92
ВКС	3,0 мг/л	9	101
III	К	-	8	78
НКС	0,3 мг/л	8	72
ВКС	3,0 мг/л	8	62

Обозначения: К – контрольная группа; НКС – подопытная группа с воздействием свинца 0,3 мг/л; ВКС – подопытная группа с воздействием свинца 3,0 мг/л.

Массметрически исследовали 807 плацент и 807 плодов. Проводили осмотр плодов, их взвешивание, измерение краниокаудального размера, отмечали наличие и локализацию подкожных геморрагий и внешних уродств. Плаценты взвешивали, штангенциркулем измеряли минимальный и максимальный диаметры, толщину, учитывали нарушения формы плаценты и характер патологических изменений.

В яичниках самок крыс подсчитывали число жёлтых тел беременности, в рогах матки определяли число мест имплантаций, учитывали количество живых и погибших плодов. Проводилась оценка доимплантационной, постимплантационной и общей эмбриональной гибели.

Гистологические методы

В зависимости от задач исследования плаценты и органы плодов фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина (для гистологических методов) или в растворе Рего (для гистохимического выявления свинца в тканях). Кусочки ткани проводили по спиртам восходящей крепости, заливали в парафин; приготавливали срезы толщиной 5 - 7 мкм. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологически исследовали плаценту, легкое и почку плода.

Гистостереометрический метод

Использовался для определения объёмной плотности (удельного объёма) структур лабиринтного отдела плаценты на тотальных поперечных срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, в соответствии с правилами стереометрии [Степанов и др., 1991; Милованов, 1999]. Удельный объём различных компонентов плаценты определяли по количеству совпадений структур с пересечениями 100-точечной сетки, вмонтированной в окуляр микроскопа. Рабочим увеличением было х 400. Учёт точек в полях зрения вели по пяти компонентам: материнские лакуны, ядра и цитоплазма трофобласта, сосудистое русло эпителиальных балок и ядра эндотелиоцитов сосудистого русла. В каждом случае исследовали по 10 полей зрения.

Гистохимические методы

В парафиновых срезах плаценты и органов плода выявляли: а) соли свинца по методу Кретена в модификации Файрхолла. В нефиксированных криостатных срезах плаценты и лёгких плода определяли активность а) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД) по Гессу, Скарпелли и Пирсу; б) моноаминоксидазы (МАО) по Гленнеру и др.; в) НАДФ•Н-дегидрогеназы по Нахласу, Уокеру и Зелигману.

Активность ферментов на гистохимических препаратах плаценты и лёгкого плода оценивали по десятибалльной шкале (от 0,5 до 5 баллов) с учётом размера, интенсивности окраски, количества гранул формазана и плотности их распределения. При увеличении х 400 оценивали активность ферментов в 100 гигантских клетках плаценты и в 100 клетках бронхиального эпителия легкого; в негликогенных клетках, эпителии лабиринтных балок плаценты и альвеолярной паренхиме легкого – в 20 полях зрения.

Определение активности Zn-Cu-супероксиддисмутазы (СОД), ключевого фермента антиоксидантной защиты, в ткани печени и мозга плодов (всего 100 определений) проводили по методу, основанному на способности СОД ингибировать аутоокисление адреналина в щелочной среде [Misra H. P., Fridovich I., 1972]. Активность фермента выражали в условных единицах на 1мг белка. За единицу активности принимали количество фермента, требуемое для ингибирования аутоокисления адреналина на 50 % в условиях эксперимента. Белок определяли по методу Лоури.

Определение свинца в крови (52 исследования) проводили методом атомно-абсорбционной спектроскопии по Nise G. и Vesterberg O. (1978) на приборе ААS-3 Карл Цейсс (Германия) с электротермическим атомизатором Е ТА-3.

Статистические методы

Использовали программу “Statistica – 6.0”. Определяли параметры распределения признаков: среднее арифметическое (М), ошибку среднего арифметического (m), стандартное отклонение (δ), медиану (Ме). Характер распределения анализируемых параметров в выборках оценивали критерием Колмогорова-Смирнова.

В случае нормально распределенных показателей сравнивали выборки и параметры их распределений с использованием критерия Стъюдента для сравнения средних, критерия Фишера для сравнения дисперсий, кроме того, применяли одно - и многофакторный дисперсионный анализ (ANOVA/MANOVA). Для отличных от нормального распределений использовали непараметрические критерии: U-критерий Манна – Уитни (M-W), критерий парных сравнений Колмогорова-Смирнова (K-S), критерий χ2 для сравнения дискретных распределений, ранговый дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса (K-W) и медианный тест (Mt). Зависимости между признаками выявляли с помощью корреляционного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние свинца на гибель эмбрионов

Согласно результатам непламенной атомно-абсорбционной спектрометрии, поступление в организм самок крыс раствора нитрата свинца (0,3 мг/л – низкая или 3 мг/л – высокая концентрация) с питьевой водой во II и III сериях эксперимента приводит к достоверному увеличению концентрации свинца в крови (Pbк) животных, по сравнению с соответствующими контролями (табл. 2). Установлено, что в условиях воздействия ВКС уровни Pbк повышаются значительнее, чем у крыс, потреблявших в аналогичные сроки НКС (p = 0,05). Длительность введения как высокой, так и низкой концентраций свинца не оказало достоверного влияния на его содержание в крови самок (p > 0,05).

Таблица 2. Концентрация свинца в крови крыс (мкг/ л)

Группа животных	Количество животных	Концентрация свинца (мкг/ л)	Результаты сравнений (t-критерий)
К (II)	10	161,6±14,75	ВКС (II) - НКС (II) р = 0,05
НКС (II)	9	206,9±19,96	К (II) - НКС (II) р = 0,046
ВКС (II)	9	255,09±35,38	К (II) - ВКС (II) р = 0,0016
К (III)	8	169,3±13,34	ВКС (III) - НКС (III) р = 0,05
НКС (III)	8	189,25±10,56	К (III) - НКС (III) р = 0,047
ВКС (III)	8	227,83±41,16	К (III) - ВКС (III) р = 0,023

Обозначения: II – вторая серия опыта, III – третья серия опыта.

При анализе эмбриотропного влияния свинца в подопытных группах (НКС - II, - III и ВКС - III) отмечено статистически значимое увеличение, по сравнению с контролем, доимплантационной, постимплантационной и общей гибели плодов (во всех случаях χ² ≥ 3,62, p < 0,05).

Учитывая данные других исследователей, можно полагать, что увеличение доимплантационной гибели под влиянием свинца связано с недостаточным синтезом прогестерона желтым телом яичника [Jacquet P. et al., 1977] и/или снижением чувствительности клеток-мишеней к прогестерону. В основе этого может лежать цитотоксическое действие свинца на гранулезные клетки фолликула, изменение состояния рецепторного аппарата клеток и снижение активности ключевых ферментов стероидогенеза [Priya P. N. et al., 2004; Nampoothiri L. P. Gupta S., 2006]. Нельзя исключать также нарушение механизмов гипоталамо-гипофизарного контроля эндокринной деятельности яичника [Sokol R. Z., 1987; Gustafson A. et al., 1989], негативный вклад оксидантного стресса [Qian et al., 2005; Nampoothiri L. P. et al., 2007] и генотоксическое действие свинца, вызывающее хромосомные аберрации [Rajah T., Ahuja Y. R., 1995] в половых и соматических клетках.

Повышение постимплантационный гибели в условиях воздействия свинца, вероятно, связано с прямым действием на плод токсиканта, проходящего через плацентарный барьер [Odland J. O. et al., 2004]. По нашему мнению, это может быть обусловлено и плацентарной недостаточностью вследствие поражения плаценты свинцом.

2. Морфофункциональное состояние плаценты, органов и тканей плода в условиях воздействия на самку крыс нитрата свинца в течение беременности

Исследование плаценты не выявило значительных гистологических и гистостереометрических изменений у крыс, получавших в течение беременности НКС или ВКС, по сравнению с контролем.

Наряду с этим, воздействие свинца во время беременности сопровождалось уменьшением, относительно контроля, силы корреляционной связи между объёмной плотностью материнских лакун и цитоплазмой трофобласта эпителиальных балок, более выраженное у самок, потреблявших ВКС (К: R = - 0,816; НКС: R = - 0,619; ВКС: R = - 0,384). При влиянии НКС ослабевала, по сравнению с контролем, корреляционная зависимость объёмной плотности материнских лакун от объёмной плотности сосудистого русла в балках лабиринта (К: R = - 0,445, НКС: R = - 0,348). В плацентах крыс, получавших ВКС, регистрировалась сильная отрицательная связь между объёмной плотностью цитоплазмы трофобласта и плотностью сосудистого русла в балках (R = - 0,706), которая не наблюдалась в контроле и при воздействии НКС. Все это свидетельствует о наличии начальных этапов развития патологических изменений в плаценте, ещё не выявляемых микроскопически.

Об этом же свидетельствует и изменение активности ферментов в структурах этого органа. В подопытных группах крыс активность НАДФ•Н-дегидрогеназы в гигантских клетках (ГК) плаценты уменьшалась относительно контроля (К-НКС, p = 0,02; К – ВКС, p = 0,023) (табл. 3). При влиянии высокой концентрации свинца это сочеталось с повышением, по сравнению с контролем и НКС-группой, уровня активности НАДФ•Н-дегидрогеназы в трофобласте эпителиальных балок (ТЭБ) (p < 0,000 и p < 0,05, соответственно).

Разнонаправленные изменения активности фермента в структурных элементах плаценты при воздействии ВКС, вероятно, отражают дискоординацию метаболических превращений в этих условиях. Увеличение активности НАДФ•Н-дегидрогеназы в лабиринте плаценты демонстрирует наличие компенсаторных резервов в трофобласте и косвенно свидетельствует о возможностях интенсификации биосинтетических реакций.

В литературных источниках не обнаружены данные о влиянии свинца на активность НАДФ•Н-дегидрогеназы в плаценте крысы. Однако, известно о снижении активности фермента в печени крысы и её плодов (p < 0,05 и p < 0,01, соответственно) в условиях потребления самками в течение 20 дней беременности питьевой воды с нитратом свинца (0,3 мг/л) [ и др., 1991]

Воздействие НКС в серии I приводило к снижению активности МАО в негликогенных клетках (НК) плаценты крыс (K-S, p < 0,001) (табл. 3), ВКС – к повышению активности МАО во всех её структурных элементах (К(I) – ВКС(I): p < 0,001).