Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека

На правах рукописи

КЛАДОВА Анна Юрьевна

АССОЦИАЦИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ КОЖИ С ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА.

14.00.11. – кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московской медицинской академии имени и на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Московский Государственный Медико-Стоматологический Университет (МГМСУ)

Защита диссертации состоится «____» ______________ 2007 г. в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.040.10 при Московской медицинской академии имени

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени г. Москва, Нахимовский проспект.

Автореферат разослан «____» ______________ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Актуальность проблемы.

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) – одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некоторые авторы называют «бесшумной эпидемией» [ и др. 2004; Glass A. et al. 1989; Nguen T. et al. 2002; Holme S. et al. 2000]. Изучение этиологии и патогенеза ЭОК, остающихся в настоящее время детально не исследованными, представляет значительный интерес, прежде всего, с точки зрения оптимизации лечения и профилактики этих опухолей [ C. и др. 2004; и др. 2006; Kirkwood J. Et al. 1984; Cornell R. et al 1990; Greenway H. 1992].

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены, а также ионизирующее излучение [Tolbert P. et al. 1997; Armstrong B. et al. 2001]. Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [ и др. 2006, C. 2004; Grossman D. et al. 1997]. В последние годы в связи с достижениями в области молекулярной биологии сложились предпосылки для изучения новых аспектов этиологии и патогенеза ЭОК. В частности, предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК – плоскоклеточного рака, базальноклеточного рака, актинического кератоза, кератоакантомы, себорейного кератоза [Shamanin V. et al. 1996; Harwood A. et al. 2000; Iftner A. et al. 2003].

Число больных, страдающих заболеваниями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает непрерывно увеличиваться [Walboomers J. et al. 1999]. В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папиллом, из них к родам, инфицирующих человека, относятся alpha-, beta-, gamma-, mu- и nu. Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высокой онкогенности отдельных разновидностей вируса [Lorincz A. et al. 1992]. Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны основным этиологическим агентом рака шейки матки и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 1996]. Эпидемиологические и молекулярно-биологических данные позволяют предполагать, что ВПЧ рода beta могут обусловливать формирование ряда ЭОК, однако данная взаимосвязь в настоящее время окончательно не обоснована. Частота выявления ВПЧ в различных ЭОК существенно различается [Shamanin V. et al. 1996; Harwood C. et al. 2000; Iftner A. et al.2003 Forslund O. et al. 2003; de Villier E.-M. et al. 1999]. Это обусловлено разнообразием используемых с этой целью лабораторных методов: менее чувствительные - способны обнаруживать вирус только при его высокой концентрации, более чувствительные – даже единичные копии вируса в коже [Meyer T. et al. 2000]. Кроме того, предполагают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь в популяции жителей Восточной Европы, жителей Центральной Европы и Америки [zur Hausen P. et al., 2005]. В России подобные исследования не проводились.

В последнее время стало очевидным, что простое обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым доказательством этиологической роли ВПЧ в развитии данных состояний. Обнаружение ВПЧ в патологически измененном эпителии кожи может быть следствием, как активной вирусной инфекции, так и независимой бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов. Поэтому, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки [Snijders P. 2003]. Определение вирусной нагрузки является сравнительно новым подходом в диагностике ВПЧ-инфекции, показавшим свою высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной папилломавирусной инфекции [Snijders P. 2003]. Таким образом, в настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа вирусных геномов в ЭОК, что позволит более объективно судить о характере присутствия ВПЧ в опухолях кожи, а следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК с ВПЧ [Harwood C. 2004; zur Hausen P. 2005; Weissenborn S. 2005; Peter J. 2006].

Наиболее интересной моделью для изучения связи вирусной нагрузки ДНК ВПЧ с клинической динамикой течения опухолевого процесса представляет кератоакантома. Известно, что эта опухоль быстро проходит стадию роста и стабилизации, а затем спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др. 1980; и др. 2006, Schwartz et al.] Однако в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению. Названные особенности течения кератоакантомы привлекают внимание к ней многих исследователей как к удобной модели изучения вирус-индуцированного канцерогенеза в коже [ и др. 2006; Shwartz R. et al. 1994, Zelickson A. et al. 1961; Forslund O. et al. 2003].

С учетом вышеизложенного, проведение исследований, изучающих ассоциацию ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК с ВПЧ.

Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусом папилломы человека на основе количественного анализа ДНК ВПЧ.

Задачи исследования:

1.  Разработать методику количественного выявления ДНК ВПЧ в коже.

2.  Изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с ВПЧ.

3.  Определить вирусную нагрузку ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

4.  На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Научная новизна.

Впервые разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с использованием ПЦР в режиме реального времени.

С помощью количественного анализа впервые детально изучена ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta.

На примере кератоакантом продемонстрировано ранее не описанное изменение вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1.  Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК не менее чем в 70% случаев ассоциированы с инфекцией ВПЧ рода beta.

2.  Концентрация ДНК ВПЧ у больных ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа).

3.  Динамика вирусной нагрузки ВПЧ может описывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом.

Внедрение в практику.

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. , кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. , а также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов (Москва 2005, 2007); на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25-26 апреля 2006 года; научно-практической конференции «Современная диагностика и лечение урогенитального хламидиоза», Москва 26-27 апреля 2007 года; 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September постерный доклад); на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», М., 2006.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 29 отечественных и 179 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 3 фотографиями, 10 рисунками и 16 таблицами.

Содержание работы.

Материалы и методы.

Группа лиц, вошедших в исследование, была сформирована в соответствии с данными мировой научной литературы, согласно которым ВПЧ рода beta ассоциирован c отдельными вариантами доброкачественных (бородавка, себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (плоскоклеточный рак, базальноклеточный рак) ЭОК [].

В настоящее исследование включены 135 больных с доброкачественными, предраковыми и злокачественными новообразованиями кожи, в том числе 10 больных себорейным кератозом (СК), 21 больной кератоакантомой (КА), 15 больных актиническим кератозом (АК) и 5 больных болезнью Боуэна (ББ), 74 больных базальноклеточным раком (БКР) кожи, 10 больных плоскоклеточным раком (ПКР) кожи (табл.больных имели единичные (солитарные) очаги поражения, 46 - множественные. Среди них было 68 мужчин и 65 женщины в возрасте от 33 до 79 лет. Во всех группах больных преобладали лица пожилого возраста: средний возраст при БКР составил – 65,2 ± 10,4 года, при ПКР – 69,4 ± 6,9 лет, при АК 66,5 ± 12,5 лет, при КА 67 ± 10,2, при СК 63,6 ± 11,7 лет, при ББ – 60 ± 10,7 лет. Контрольная группа была представлена 49 добровольцами – 21 мужчина и 28 женщин в возрасте от 29 до 78 лет (средний возраст 58 ± 14,5 года), у которых кожные заболевания, в том числе, ассоциированные с кожными типами ВПЧ, отсутствовали.

Таблица 1.

Распределение больных по нозологиям.

Группа новообразований	Нозологическая форма	Количество больных	Количество исследованных опухолевых очагов
Доброкачественные опухоли кожи	Себорейный кератоз	10	16
Кератоакантома	21	21
Предраковые состояния	Актинический кератоз	15	15
Болезнь Боуэна	3	3
Злокачественные опухоли кожи	Базальноклеточный рак	74	82
Плоскоклеточный рак	10	10
Всего:		133	147

Помимо общепринятых методов исследования – физических, инструментальных, лабораторных, всем больным проводили цитологическое и/или гистологическое исследование.

Генодиагностика ВПЧ-инфекции. Материалом для молекулярно-биологического исследования служили микробиоптаты кожи размером 0,2 х 0,2 см, полученные с помощью малоинвазивной модификации взятия биопсии бритвенным способом, или суспензия клеток, полученная методом соскоба, который использовался только для взятия материала из зон новообразований, где имелись нарушения сцепления между клетками, и скарификация обеспечивала получение достаточного количества клеточной массы.

Исследуемый материал помещали в отдельные пробирки, содержащие 1 мл транспортной среды (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва). Для максимального сохранения количества клеточной и вирусной ДНК пробирки замораживали сразу после взятия материала и хранили до проведения ПЦР-анализа при -70 С.

Пробоподготовка исследуемого материала осуществлялась методом обработки ткани протеиназой К с последующим выделением ДНК методом аффинной сорбции на силикагеле с использованием набора для выделения «ДНК-сорб-С» согласно инструкции производителя (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Элюция проводилась в 100мкл ТЕ-буфера. Образцы, содержащие очищенную ДНК, использовались в реакции амплификации нуклеиновых кислот.

Для разработки методики количественного определения ВПЧ рода beta, а так же оценки ее чувствительности и специфичности, использовались рекомбинантные плазмидные положительные контроли, содержащие последовательность полных геномов ВПЧ кожных типов рода alpha, gamma, mu, nu и beta - 1, 3, 4, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 27, 37, 38, 49, 50, 65 (M. Favre Institut Pasteur, Unite Postulante Genetique, Papillomavirus et Cancer Humain, France; E.-M. de Villiers, Abteilung tumorvirus-Charakterisierung Referenzzenturum fur Humanpathogene Papillomviren, Germany), а также контрольные плазмиды фрагмента β-глобинового гена человека (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

Для выявления ДНК ВПЧ рода beta использовались четыре системы олигонуклеотидов (группоспецифических праймеров и зондов):

1-я - для выявления генотипов вида β1 (5, 8, 12, 14, 21, 19, 25, 47, 36);

2-я - для выявления генотипов вида β2 (9, 15, 17, 22, 23, 38, 37, 80);

3-я - для выявления генотипов вида β3 (49, 75, 76);

4-я - для выявления генотипов вида β4 (92), β5 (96), β1 (20,24 и 93 типы).

Последовательности всех олигонуклеотидов для 25 типов ВПЧ beta рода были выбраны при анализе известных последовательностей ВПЧ, взятых из Интернет ресурса “NCBI GeneBank” (http://www. ncbi. nlm. nih. gov) и обработаны при помощи программы AlignX пакета Vector NTI 6 (InforMax Inc., 2000). Во все четыре системы введены олигонуклеотиды к последовательности β-глобинового гена человека, что позволяло проводить оценку адекватности забора, хранения и обработки образцов (принцип внутреннего контроля).

Выявление ДНК ВПЧ в подготовленных образцах проводилось в мультиплексном формате, в четырех пробирках. Каждая пробирка содержала одну из групп олигонуклеотидов для выявления ВПЧ, а также олигонуклеотиды для выявления β-глобинового гена человека.

В состав реакционных смесей для ПЦР входили следующие компоненты: олигонуклеотидные праймеры и зонды; нуклеотиды в концентрации 0,2 мМ каждого; ПЦР-буфер (66мМ Tris-HCl, PH 8,8, 17 мМ(NH4)2SO4, 4 мM MgCl2, 0,01% Tween 20); TaqF-ДНК-полимераза (2U в реакцию) (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва); очищенная ДНК, выделенная из клинического материала - 10 мкл.

В отдельные пробирки (вместо образца ДНК) вносили положительные и отрицательные контрольные образцы (10 мкл). Отрицательный контроль амплификации - представлял обычную реакционную смесь, в которую вместо образца ДНК добавлялся ТЕ-буфер. Положительный контроль амплификации - представлял собой фрагмент специфичной ДНК (контрольные плазмиды ВПЧ в концентрации 104 копий ДНК ВПЧ/мл).

Термоциклирование проводили на амплификаторе Mx3000P (Stratagene, США), соединенным с персональным компьютером по следующей программе: предварительный этап 95 0С – 15 мин., затем при 950С – 15 с, при 60 0С – 30с, при 65 0С – 1 мин. – 50 циклов.

Детекция продуктов амплификации осуществлялась путем измерения флуоресцентного сигнала, нарастающего по мере накопления специфического продукта реакции. Получаемая зависимость интенсивности флуоресценции от цикла реакции - кривая флуоресценции - имела в случае положительной реакции характерный S-образный вид. В соответствии с этим проводилась качественная оценка результатов реакции.

Для количественного анализа использовались десятикратные разведения (6 log – 1 log) положительных плазмидных контролей 5, 8, 15, 37, 38, 20, 24, 49 типов ВПЧ и ДНК человека (стандарты).

Для построения и математической обработки описанных кривых использовалась программа построения, обработки, анализа кривых флуоресценции и ведения документации для метода «ПЦР в реальном времени» - Mx3000P (Stratagene, США).

Статистическая обработка данных. Достоверность различия частот определяли при помощи критерия «хи-квадрат». Доверительные границы к частотам рассчитывали на основании биномиального распределения. Для анализа характерных вирусных нагрузок рассчитывали десятичный логарифм количества вирусов, анализ его связи с другими переменными проводили с использованием метода параметрической статистики: достоверность различий средних по группам вычисляли с помощью дисперсионного анализа, а доверительные границы к среднему – на основе распределения Стьюдента.

Результаты и обсуждение.

Разработка методики выявления и определения вирусной нагрузки кожных типов ВПЧ рода beta.

Аналитическая специфичность методики оценивалась на высококонцентрированных (108 копий ДНК/мл) образцах контрольной ДНК ВПЧ кожных типов (род alpha, gamma, mu, nu и beta) : 1, 3, 4, 7, 50, 65, 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49; ДНК ВПЧ слизистых типов (род alpha): 16,18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 82; ДНК, полученную из культур бактерий, потенциально колонизирующих кожные покровы и слизистые оболочки S. aureus, S. pyogenus, Ps. aeroginosa, E. coli, U. urealiticum, C. trachomatis, G. vaginalis, T. vaginalis; ДНК человека (фрагмента β-глобинового гена человека). В результате проведенных исследований перекрестных реакций не обнаружено. Положительный сигнал был получен в присутствии ДНК ВПЧ кожных типов рода beta.

Аналитическая чувствительность оценивалась с использованием 10-кратных разведений контрольной панели ДНК ВПЧ 5, 7, 8, 15, 20, 24, 37, 38, 49 типов. После определения последнего проходящего разведения осуществлялась серия 2-кратных разведений из этой точки. Далее определялось последнее стопроцентное проходящее разведение (6 точек из 6), которое расценивали как порог аналитической чувствительности.

Аналитическая чувствительность разработанной методики позволяла выявлять генотипы вида β1 (смесь Акопий ДНК ВПЧ/мл; генотипы вида β2 (смесь В) – 1000 копий ДНК ВПЧ/мл; генотипы вида β3 (смесь С) – 450 копий ДНК ВПЧ/мл; генотипы вида β4,5,1 (смесь D) – 300 копий ДНК ВПЧ/мл.

Для разработанных систем олигонуклеотидов выявления ДНК ВПЧ beta-папилломавирусов было проведено исследование наличия линейной зависимости между логарифмом концентрации исходной ДНК-матрицы в образце и циклом начала увеличения флуоресценции (пороговым циклом). Такая зависимость лежит в основе проведения количественных измерений в ПЦР в реальном времени (рис. 2).

Рисунок 1.

Корреляция логарифма концентрации ДНК ВПЧ и порогового цикла в разработанных системах олигонуклеотидов.

Смесь А Смесь В

Ct

Ct

lgC

lgC

Смесь С Смесь D

Ct

Ct

lgC

lgC

Из рисунков видно, что данные зависимости имели линейный характер в диапазоне: для смеси А- от 2,5 х 103 (3,4lg) до 109 (9lg) копий/мл, для смеси В – от 5 х 102 (2,7 lg) до 2х107 (7,3 lg) копий/мл, для смеси С – от 7 х 102 (2,8 lg) до lg) копий/мл, для смеси D – от 5 х 102 (2,7 lg) до 2х107 (7,3 lg) копий/мл. Коэффициент корреляции (R2) во всех случаях составил >0,99.

Оценка качества образцов по наличию геномной ДНК человека.

Качество клинических образцов (качество забора, транспортировки, хранения, выделения) определялось по количеству геномной ДНК (β-глобинового гена человека). Для достижения чувствительности не менее чем 100 копий ДНК ВПЧ/105 клеток человека нами было введено ограничение на минимальное количество клеток человека в образце, которое составило 5,9 log (8,0*105) копий ДНК человека/мл. В соответствие с полученными данными, все образцы, содержащие менее чем 5,9 log ДНК человека/мл, считались невалидными.

Расчет нормализованной вирусной нагрузки.

Метод ПЦР в режиме реального времени, положенный нами в основу разработки методики количественного выявления ВПЧ рода beta, позволял определять абсолютное количество ДНК ВПЧ и геномов человека в пробе. С учетом того, что при одном и том же методе взятия клинического материала из очагов ЭОК или нормального эпителия кожи количество клеток (а соответственно и копий вируса), попадающих в образец, существенно варьировало, нами была предложена методика нормирования количества вируса на количество клеток человека, что является оправданным в отношении внутриклеточных инфекционных агентов. Подобный стандартизованный подход позволял получать надежные и достоверные данные о вирусной нагрузке при различных патологиях кожи.

Расчет нормализованной вирусной нагрузки производился по формуле:

ВН = Log ((Кол-во ДНК ВПЧ / Кол-во ДНК чел.)* 105).

Выявление и определение вирусной нагрузки кожных типов ВПЧ рода beta (25 генотипов) у больных эпителиальными опухолями кожи.

Выявление и определение вирусной нагрузки кожных типов ВПЧ рода beta (25 генотипов) у больных ЭОК проводилось в два этапа. Первоначально все образцы кожи больных ЭОК и контрольной группы были протестированы на присутствие ДНК ВПЧ рода beta (табл.2).

Таблица 2.

Выявляемость ДНК ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях и образцах нормальной кожи.

Исследуемые образцы	Кол-во образцов	Количество ВПЧ - образцов	Количество ВПЧ + образцов
Абс.	%	Абс.	%
Себорейный кератоз	16	4	25,0	12	75,0
Кератоакантома	21	5	23,8	16	76,2
Актинический кератоз	15	1	6,7	14	93,3
Болезнь Боуэна	5	1	20,0	4	80,0
Базальноклеточный рак	82	15	18,3	67	81,7
Плоскоклеточный рак	10	3	30,0	7	70,0
Нормальная кожа	49	26	53,1	23	46,9
Всего	196	47	27,0	126	73,0

Как видно из табл. 2, злокачественные (ПКР, БКР), а также предраковые (АК, ББ) и доброкачественные (СК, КА) опухоли кожи в довольно высоком проценте случаев были ассоциированы с ВПЧ: последовательности ДНК ВПЧ рода beta выявлялись в 75% случаев СК, 76,2% - КА, 93,3% - АК, 80,0% - ББ, 81,7% - БКР, 70% - ПКР. Наряду с этим, ВПЧ beta рода обнаруживался в микробиоптатах нормальной кожи здоровых доноров в 46,9%.

Известно, что потенциальный риск персистенции и прогрессии ВПЧ-инфекции зависит от типа или вида ВПЧ (т. к. филогенетическое родство различных генотипов ВПЧ в пределах одного вида определяет их сходные биологические свойства), а также от совместной инфицированности клеток эпителия генотипами одного или нескольких видов ВПЧ [Munoz N. Et al., 2004]. С учетом этого мы проанализировали данные о частоте обнаружения различных видов ВПЧ рода beta, а также данные о частоте их ассоциаций в образцах ЭОК и нормальной коже.

Было установлено, что как в ЭОК, так и нормальной коже выявлялся весьма широкий спектр генотипов ВПЧ рода beta, принадлежащих к различным видам (β1, β2, β3, β4, β5). В образцах доброкачественных (СК и КА) ЭОК, а также в нормальной коже представители различных видов ВПЧ - β1, β2, β3, β4, β5 - встречались приблизительно с одинаковой частотой. В образцах предраковых и злокачественных (БКР и ПКР) ЭОК папилломавирусы β1 и β2 видов встречались в 1,5-2 раза чаще, чем представители β3, β4-β5 видов (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнительная частота обнаружения различных видов ВПЧ рода beta в эпителиальных опухолях и нормальной коже.

Исследуемые образцы	Кол-во ВПЧ+ образцов	Виды ВПЧ
beta-1* (%)	beta-2* (%)	beta -3* (%)	beta - 4,5* (%)
Себорейный кератоз (n=16)	12	6 (50,0)	7 (58,3)	5 (41,6)	6 (50,0)
Кератоакантома (n=21)	16	10 (62,5)	11 (68,7)	8 (50,0)	9 (56,2)
Актинический кератоз (n=15)	14	12 (85,7)	14 (100)	7 (50,0)	5 (35,7)
Базальноклеточный рак (n=82)	67	50 (74,6)	51 (76,1)	24 (35,8)	11 (16,4)
Плоскоклеточный рак (n=10)	7	6 (85,7)	5 (71,4)	2 (28,5)	1 (14,2)
Нормальная кожа (n=49)	23	8 (34,0)	11 (47,0)	6 (26,0)	11 (47,0)

*в том числе в ассоциации с другими видами

В 66,6% - 100% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta. Обратная ситуация констатирована при изучении ВПЧ положительных образцов здоровой кожи лиц контрольной группы: наибольший процент наблюдений (78,3%) составили случаи инфицирования только одним видом ВПЧ рода beta (р<0,01) (табл.4).

Таблица 4.

Встречаемость одного или нескольких видов ВПЧ рода beta в образцах эпителиальных опухолей и нормальной коже.

Исследуемые образцы	Кол-во ВПЧ+ образцов	Один вид ВПЧ в образце	2 и > видов ВПЧ в образце
Абс.	%	Абс.	%
Себорейный кератоз	12	4	33,3	8	66,6
Кератоакантома	16	4	25,0	12	75,0
Болезнь Боуэна	4	-	-	4	100
Актинический кератоз	14	-	-	14	100
Базальноклеточный рак	67	21	31,4	46	68,6
Плоскоклеточный рак	7	-	-	7	100
Нормальная кожа	23	17	78,3	5	21,7

Таким образом, полученные нами при использовании разработанной методики результаты не противоречат данным зарубежных исследователей, использовавшим для обнаружения ВПЧ в коже высокочувствительные и высокоспецифичные неколичественные методы ПЦР-анализа [Berchout J. 1995; de Villiers E. 1999; Boxman I. 2000; Forslund O. 2003]. Это позволяет использовать наш метод выявления ВПЧ рода beta в дальнейшем для изучения ВПЧ – ассоциированных заболеваний кожи.

Вместе с тем, широкое распространение ВПЧ как в ЭОК, так и нормальном эпителии кожи, продемонстрированное в работах зарубежных авторов [Astori G. 1998;; Boxman I. et al. 1999, 2000; Atonsoon А. et al. 2000] и подтвержденное нами, не позволяет категорически утверждать непосредственное участие ВПЧ в формировании опухолевых заболеваний кожи. В связи с этим, на следующем этапе исследования был проведен количественный анализ, включающий определение вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в ВПЧ-положительных образцах ЭОК и нормальной кожи и нормирование количества ДНК ВПЧ на количество клеток человека.

В результате проведенного количественного анализа было установлено, что средние показатели вирусной нагрузки ДНК ВПЧ во всех ВПЧ положительных ЭОК превышали средние показатели вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 логарифма на 100 тыс. клеток), причем при СК (3,0 ± 0,7 логарифма на 100тыс. клеток), КА (3,2 ± 1,6 логарифма на 100 тыс. клеток), АК (4,5± 1,2 логарифма на 100 тыс. клеток) и БКР (2,08 ± 1,4 логарифма на 100 тыс. клеток) различия имели достоверный характер (рис. 2).

Рисунок 2.

Средний логарифм вирусной нагрузки в эпителиальных опухолях и нормальной коже.

log ДНК ВПЧ/105 клеток

* - p < 0,05 ** - p < 0,0001

Количественный анализ, примененный нами, продемонстрировал, что при высоких показателях ассоциации ВПЧ с ЭОК и нормальной кожей, вирусная нагрузка в большинстве ЭОК достоверно превышает этот показатель в нормальной коже. Увеличение вирусной нагрузки в образцах ЭОК, по сравнению с нормальной кожей, указывает на активацию ВПЧ и может свидетельствовать, на наш взгляд, о роли ВПЧ либо как об этиологическом факторе, либо как о факторе, влияющем на течение и/или прогноз заболевания.

Таким образом, количественное измерение вирусных частиц позволяет более точно судить о характере присутствия вируса в опухолевой ткани и может рассматриваться как предпочтительный метод для изучения связи вируса с развитием, течением или прогрессированием заболевания.

Специально была проанализирована зависимость вирусной нагрузки ДНК ВПЧ в образцах КА с учетом цикличности ее течения. Было установлено, что в фазу роста КА, т. е. в период наиболее интенсивного деления клеток, средняя вирусная нагрузка ДНК ВПЧ составила 3,1 ± 1,6 логарифмов на 100 тыс. клеток. В фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 логарифмов на 100 тыс. клеток. В фазу регресса средняя вирусная нагрузка ДНК ВПЧ уменьшилась до 1,6 ± 1,5 логарифмов на 100 тыс. клеток (табл.5).

Таблица 5.

Средний логарифм вирусной нагрузки в зависимости от фазы

развития кератоакантом.

Фаза развития кератоакантом	Всего	Кол-во образцов ВПЧ +	Средний логарифм вирусной нагрузки (log ДНК ВПЧ/105 клеток)
Рост	6	6 (28,6%)	3,1 ± 1,6
Стабилизация	8	8 (38,1%)	3,9 ± 1,6
Регресс	7	2 (9,5%)	1,6 ± 1,5
Всего	21	16 (76,2%)

Таким образом, вирусная нагрузка, измеряемая в различных фазах эволюции КА, возрастала по мере дифференцировки опухоли. В стадии регресса КА концентрация ДНК ВПЧ уменьшалась более чем в 20 раз, причем у 5 (23,8%) пациентов не определялась, что может свидетельствовать о снижении концентрации ДНК ВПЧ ниже детектируемого уровня или о полной элиминации вируса. Следовательно, динамика концентрации ДНК ВПЧ может отражать этапы клинического течения КА, что, в свою очередь косвенно подтверждает прямое участие ВПЧ в развитии ЭОК.

ВЫВОДЫ

1.  Выявление и определение вирусной нагрузки ДНК 25 генотипов ВПЧ рода beta в коже может проводиться с помощью разработанной количественной методики на основе ПЦР в режиме реального времени.

2.  С помощью ПЦР в режиме реального времени ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ рода beta была выявлена в 75 % случаев себорейного кератоза, 76,2 % - кератоакантом, 93,3 % - актинического кератоза, 80,0 % - болезни Боуэна, 81,7 % - базальноклеточного рака кожи и 70,0% - плоскоклеточного рака кожи. В нормальной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9 % случаев.

3.  В образцах предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак кожи) ЭОК папилломавирусы β1 и β2 видов встречались в 1,5-2 раза чаще, чем представители β3, β4-β5 видов. В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta.

4.  В ходе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ДНК ВПЧ во всех ЭОК превышала вирусную нагрузку ДНК ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), причем при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный характер.

5.  На примере кератоакантом продемонстрирована ранее не показанная связь вирусной нагрузки ДНК ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса: в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 log/105 клеток, в фазу стабилизации - 3,9 ± 1,6 log/105 клеток, в фазу регресса - 1,6 ± 1,5 log/105 клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1.  , Н К проблеме патогенеза и лечения базалиомы кожи// V научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». – М., 2005.- С.58-59;

2.  , , Молочков методики количественного определения папилломавирусов рода Бета// VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика».– М.- 2006.- С. 97-98;

3.  , , Прокофьев определение вируса папилломы человека (ВПЧ) в эпителиальных образованиях и других пролиферативных заболеваниях кожи// VI научно-практическая конференция «Социально значимые заболевания в дерматовенерологии. Диагностика, терапия, профилактика». – М.- 2006.- С. 74-75;

4.  , , Козлова кожных типов вируса папиллом человека в патологиях кожи // Альманах клинической медицины. – 2006. - Том IX. – С. 44-50;

5.  , Кладова на фоне невуса сальных желез// Российский журнал кожных и венерических болезней. – 2006. - № 3. – С. 10-12;

6.  Kladova A., Kuevda D., Molochkov V., Pokrovskii V., Shipulina O., Kozlova E. Human papillomavirus –DNA loads in skin pathologies and normal skin // Abstract in 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop. – Prague, 2006. – P. 185;

7.  Kuevda D., Kladova A., Shipulina O., Molochkov V., Pokrovskii V. Novel Real-time PCR based quantitative assay for detection of broad spectrum of Beta - human papillomaviruses// Abstract in 23-d international papillomavirus conference and clinical workshop. – Prague, 2006. – P. 285;

8.  , , К ассоциации кератоакантом с вирусом папилломы человека// Альманах клинической медицины. – 2007. - Том IX. – C. 40-44;

9.  , , К проблеме гигантских базалиом// Клиническая дерматология и венерология. – 2007. - № 1. – С.9-12;

10.  Козлова А. С., , Куевда некоторых вирусо-бактериальных ассоциаций при псориазе// Альманах клинической медицины. – 2007. – Том XV. – C. 191-194.