Полиморфизм днк-маркеров, ассоциированных с воспроизводительными качествами, у свиней пород крупная белая и йоркшир (стр. 1 )

На правах рукописи

БАННИКОВА Алиса Дмитриевна

полиморфизм ДНК-МАРКЕРОВ, ассоциированных с воспроизводительными качествами, у свиней пород крупная белая и йоркшир

03.02.07 – ГЕНЕТИКА

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Дубровицы - 2012

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики животных Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства
Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ФГБНУ ВНИИ племенного дела,

заведующая лабораторией

ДНК-технологий;

кандидат биологических наук, доцент

ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный университет – МСХА им. ,

доцент кафедры технологии хранения и переработки продуктов животноводства.

Ведущая организация: ФГБГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени

Защита состоится «23» октября 2012 года, в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: Московская область, Подольский район,

п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ, тел./www. *****

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «___» __________ 2012 года.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Ученый секретарь совета Д006.013.03

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Современные тенденции развития животноводства предусматривают использование новых методов, основанных на применении ДНК-технологий, что позволяет сделать отрасль рентабельной и конкурентоспособной [, , 2002]. Значимым направлением практической генетики является маркерная селекция (Marker Assisted Selection - MAS) [ и др, 1999; и др., 2004], предусматривающая использование ДНК-маркеров, ассоциированных с уровнем проявления признаков продуктивности. Технологии, основанные на использовании ДНК-маркеров, находят широкое применение в национальных селекционных программах ряда стран с развитым свиноводством [, , 2008].

Самой многочисленной породой свиней на территории России является крупная белая, на долю которой по данным ВНИИплем (2009 г.) приходится 81,9% пробонитированного поголовья свиней России [ и др., 2009]. В последнее время для улучшения показателей мясной и откормочной продуктивности свиней этой породы активно используется племенной материал пород крупная белая и йоркшир зарубежной селекции, что приводит к изменению ее аллелофонда.

Улучшение воспроизводительных качеств свиней является одной из основных целей селекционно-племенной работы [Rothschild M. F., 1998]. Ведение прямой селекции на плодовитость характеризуется относительно низкой эффективностью, что связано, с одной стороны, с низкой наследуемостью признаков, с другой стороны, с ограниченным полом их проявлением. В этой связи актуальным является поиск и идентификация генов, ответственных за развитие данных признаков. В качестве перспективных ДНК-маркеров рассматриваются гены рецептора пролактина (PRLR), муцина 4 (MUC4), ретинол-связывающего белка 4 (RBP4) и рецептора эритропоэтина (EPOR).

Цели и задачи исследований. Целью работы явилось изучение влияния полиморфизма ДНК-маркеров PRLR, MUC4, RBP4 и EPOR на показатели воспроизводительных качеств свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Разработать молекулярно-генетические модели определения полиморфизма потенциальных ДНК-маркеров PRLR, MUC4, RBP4 и EPOR.

2. Изучить распределение частот встречаемости аллелей и генотипов изучаемых ДНК-маркеров у свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения.

3. Выполнить анализ ассоциаций генотипов ДНК-маркеров на показатели воспроизводительных качеств (многоплодие, молочность).

4. Изучить влияние комплексных генотипов по PRLR, MUC4 и RBP4 на многоплодие свиноматок корня крупной белой породы.

Научная новизна. Впервые разработаны модели анализа потенциальных ДНК-маркеров плодовитости свиней: PRLR, MUC4, RBP4 и EPOR. Показан популяционно-зависимый характер распределения частот встречаемости аллелей и генотипов вышеназванных ДНК-маркеров в популяциях свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения. Выполнен анализ ассоциаций генотипов отдельных ДНК-маркеров и комплексных генотипов по PRLR, MUC4 и RBP4 с уровнем проявления показателей воспроизводительных качеств: многоплодием и молочностью. Установлено достоверное влияние фактора генотипа по ДНК-маркерам на многоплодие свиноматок корня крупной белой породы.

Практическая значимость. Предложены молекулярно-генетические модели, позволяющие выявлять полиморфизм ДНК-маркеров PRLR, MUC4, RBP4 и EPOR. Определены частоты встречаемости аллелей и генотипов вышеназванных ДНК-маркеров у свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения. Выявлены генотипы изучаемых ДНК-маркеров, ассоциированные с показателями воспроизводительных качеств: многоплодием и молочностью у свиней пород крупная белая и йоркшир.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Предложены молекулярно-генетические модели определения полиморфизма ДНК-маркеров PRLR, MUC4, RBP4 и EPOR у свиней.

2. Установлен популяционно-зависимый характер распределения генотипов изучаемых ДНК-маркеров у свиней пород крупная белая и йоркшир различного происхождения.

3. Показано достоверное влияние фактора генотипа по PRLR, MUC4, RBP4 и EPOR на многоплодие свиноматок пород крупная белая и йоркшир.

4. Выявлены комплексные генотипы по PRLR, MUC4 и RBP4, достоверно ассоциированные с многоплодием и молочностью свиноматок.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены:

· На всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки и практики в современных условиях и пути их решения», посвященной памяти , 25-27 февраля 2009 г., г. Казань;

· На конференции «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных», посвященной 100-летию со дня рождения основателя института, заслуженного деятеля науки профессора , 3-5 июня 2009 г., Санкт-Петербург-Пушкин;

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ (Зоотехния, 2009 г., Зоотехния, 2010 г., Проблемы биологии продуктивных животных, 2011 г.).

Структура и объем работы. Диссертация написана на 129 страницах, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы. Диссертационная работа содержит 24 таблицы и 14 рисунков. Список литературы включает 231 источник, в том числе 107 источников на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в лаборатории молекулярной генетики Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 2007 по 2011 гг. по схеме, представленной на рисунке 1.

Рис. 1. Схема исследований

Объектом исследований служили свиньи пород крупная белая (13 популяций) и йоркшир (4 популяции) в количестве 1044 голов (табл. 1). В качестве материала для исследований были использованы пробы биологического материала свиней (кровь, ткань уха) и данные зоотехнического учета (показатели многоплодия и молочности свиноматок).

Табл. 1. Характеристика объектов исследований

№ п/п	По-рода	Проис- хождение	Хозяйство	Число голов	Аббре-виатура
1	Крупная белая	Россия	«Константиново»	120	КБ-1
2		Россия	«Заволжское»	142	КБ-2
3		Канада	СГЦ»	20	КБ-3
4		Россия	СГЦ»	6	КБ-4
5		Белоруссия	ПЗ «Индустрия»	108	КБ-5
6		Белоруссия	ПЗ «Тимоново»	50	КБ-6
7		Белоруссия	СГЦ «Заднепровский»	142	КБ-7
8		Голландия	св-ву «Владимирское»	27	КБ-8
9		Белоруссия	ФХ Хоцкевича	67	КБ-9
10		Россия	бекон»	34	КБ-10
11		Франция	«Константиново»	40	КБ-11
12		Россия		56	КБ-12
13		Ирландия		8	КБ-13
Итого по КБ	820	13
14	Йоркшир	Канада	бекон»	169	Й-1
15	Финляндия	«Константиново»	25	Й-2
16	Австрия	«Заволжское»	20	Й-3
17	Финляндия	СГЦ»	10	Й-4
Итого по Й	224	5
Итого	1044	17

Выделение ДНК из проб проводили с использованием колонок фирмы Nexttec (Германия) и набора реагентов для выделения ДНК Diatom TM DNA Prep100, (Россия).

Постановку ПЦР осуществляли согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [ и др., 1998].

Определение полиморфизма изучаемых ДНК-маркеров выполняли с использованием методик, разработанных в ходе выполнения диссертационной работы.

ПЦР-ПДРФ анализ фрагмента гена PRLR длиной 140 п. о., содержащего точечную мутацию C→G в позиции 202 (GenBank № U96306), проводили с использованием эндонуклеазы AluI, при этом сайт рестрикции (лат. обуславливало наличие в последовательности ДНК нуклеотида C.

ПЦР-ПДРФ анализ фрагмента гена MUC4 длиной 266 п. о., содержащего точечную мутацию A→G в позиции 243 (GenBank № DQ848681), выполняли с использованием эндонуклеазы XbaI, при этом сайт рестрикции обуславливало наличие нуклеотида A.

ПЦР-ПДРФ анализ фрагмента гена RBP4 длиной 184 п. о., содержащего точечную мутацию C→T в позиции 514 (GenBank № DQ344026), проводили с использованием эндонуклеазы MspI, при этом сайт рестрикции обуславливало наличие нуклеотида C.

Определение в интроне 4 EPOR точечной мутации C→T в позиции 340 (GenBank № EU293807) проводили методом ПЦР с использованием биотинилированных праймеров с последующим пиросеквенированием ПЦР продуктов на приборе PSQ 96 MA (Швеция) по оптимизированным методикам.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам [Меркурьева и др., 1991; Вейр и др., 1995; Животовский и др., 1991] с использованием программного обеспечения MS Excel, GenAlEx 6.0, STATISTICA 6.0.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка молекулярно-генетических моделей анализа полиморфизма ДНК-маркеров PRLR, MUС4, RBP и EPOR

В рамках разработки молекулярно-генетических моделей анализа ДНК-маркеров PRLR, MUС4, RBP и EPOR были подобраны специальные олигонуклеотидные праймеры, оптимизированы температурно-временные и количественные режимы для амплификации выбранных фрагментов. Разработанные нами модели определения полиморфизма позволяли четко диагностировать генотипы изучаемых ДНК-маркеров.

Как показано на рисунке 2, иллюстрирующем результаты ПЦР-ПДРФ анализа PRLR, визуализация одного нерестрицированного фрагмента длиной 140 п. о. соответствует генотипу AA (дорожки 4, 6), фрагмента длиной 106 п. о. – генотипу BB (дорожки 2, 5, 8) и двух фрагментов длиной 140 и 106 п. о. – генотипу AB (дорожки 1, 3, 7).

Description: ??

Примечание: 1, 3, 7 – генотип АВ, 2, 5, 8 – генотип BB, 4, 6 – генотип AA, М – маркер длины Fastroler Low range

Рис. 2. Результаты гель-электрофореза продуктов ПЦР-ПДРФ анализа гена PRLR в 3,5% агарозном геле

Как следует из данных рисунка 3, разработанная нами модель позволяла четко диагностировать генотипы MUC4: наличие одного фрагмента длиной 266 п. о. соответствует генотипу СС (дорожки 1, 3, 6), наличие фрагментов длиной 140 и 126 п. о. (визуализируются в геле как один фрагмент) – генотипу GG (дорожки 2, 8), в то время как наличие двух фрагментов длиной 266 и 140+126 п. о. – генотипу CG (дорожки 4, 5, 7).

Description: ????

Примечание: 1, 3, 6 – генотип СС, 2, 8 – генотип GG, 4, 5, 7 – генотип СG, М – маркер длины Fastroler Low range

Рис. 3. Результаты гель-электрофореза продуктов ПЦР-ПДРФ анализа гена MUC4 в 3,5% агарозном геле

Как следует из данных рисунка 4, иллюстрирующего результаты ПЦР-ПДРФ анализа RBP4, визуализация одного фрагмента длиной 184 п. о. соответствует генотипу АА (дорожки 3, 5, 7), наличие фрагментов длиной 94 и 90 п. о. (визуализируются в геле как один фрагмент) – генотипу BB (дорожки 2, 4), в то время как наличие двух фрагментов длиной 184 и 94+90 п. о. – генотипу АВ (дорожки 1, 6, 8).

Description: ??°

Примечание: 1, 6, 8 – генотип АВ, 2, 4 – генотип BB, 3, 5, 7 – генотип АА, М – маркер длины Fastroler Low range

Рис. 4. Результаты гель-электрофореза продуктов ПЦР-ПДРФ анализа гена RBP4 в 3,5% агарозном геле

G A T C G T C A G

Форма представления результатов анализа полиморфизма EPOR c использованием разработанной модели приведена на рисунке 5.

E S G A T C G T C A G

Рис. 5. Скриншот результатов генотипирования образцов по EPOR с использованием метода пиросеквенирования

Разработанные нами модели были использованы для характеристики полиморфизма различных популяций свиней пород крупная белая и йоркшир (раздел. 3.2).

3.2. Характеристика аллелофонда свиней пород крупная белая и йоркшир по ДНК-маркерам

Результаты анализа частот встречаемости аллелей и генотипов по PRLR приведены в таблице 2.

Табл. 2. Распределение аллелей и генотипов по PRLR в исследованных популяциях свиней пород крупная белая и йоркшир

Популяция*	Число голов	Частоты аллелей, %	Частоты генотипов, %
А	В	АА	АВ	ВВ
Й-1	144	43,5	56,5	18,1	45,1	36,8
Й-2	24	32,4	67,6	4,2	41,7	54,2
Й-3	20	52,5	47,5	20,0	65,0	15,0
Й-4	10	40,0	60,0	10,0	50,0	40,0
Итого по Й	198	42,1	57,9	13,1	50,5	36,5
КБ-1	27	45,9	54,1	26,0	37,0	37,0
КБ-2	142	50,9	49,1	26,8	49,3	23,9
КБ-3	20	23,1	76,9	0,0	30,0	70,0
КБ-4	6	60,0	40,0	33,3	66,7	0,0
КБ-5	43	33,3	66,7	2,3	46,5	51,2
КБ-6	49	26,6	73,4	4,1	30,6	65,3
КБ-7	142	32,5	67,5	6,2	38,9	54,9
КБ-8	10	42,9	57,1	20,0	40,0	40,0
КБ-9	67	47,6	52,4	19,4	53,7	26, 9
КБ-10	34	47,1	52,9	20,6	50,0	29,4
КБ-11	40	37,3	62,7	7,5	47,5	45,0
КБ-12	56	43,0	57,0	19,6	41,1	39,3
КБ-13	8	20,0	80,0	0,0	25,0	75,0
Итого по КБ	644	39,2	60,8	14,3	42,8	44,3
Итого	842	40,7	59,3	13,7	46,6	40,4

Примечание: * обозначение популяций приведено в таблице 1.

Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5

Полиморфизм днк-маркеров, ассоциированных с воспроизводительными качествами, у свиней пород крупная белая и йоркшир (стр. 1 )

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.2. Характеристика аллелофонда свиней пород крупная белая и йоркшир по ДНК-маркерам

Домашний очаг

Справочная информация

Техника

Общество

Образование и наука

Мир

Бизнес и финансы