Фармако-токсикологическая характеристика диоксигена (стр. 1 )

На правах рукописи

МИХАЙЛОВ Александр Андреевич

Фармако-токсикологическая характеристика

ДИОКСИГЕНА

16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Воронеж – 2009

Работа выполнена в отделе фармакологии ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии» Россельхозакадемии.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

кандидат биологических наук

Ведущая организация: ГНУ «Краснодарский научно-исследовательский

ветеринарный институт» РАСХН

Защита состоится «28» декабря 2009 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии Россельхозакадемии (ВНИВИПФиТ) 14-б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ

Автореферат разослан «___» ноября 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на значительные достижения ветеринарной науки, бактериальные инфекции телят и поросят продолжают наносить значительный ущерб специализированным хозяйствам: даже в случае удовлетворительных зоогигиенических условий переболевают ими до 50-70 % поголовья. При тяжелых формах течения болезни смертность может достигать 90% от общего числа заболевших животных.

Для современного животноводства
характерно, что большинство повседневных патологий «открытых полостей» - желудочно-кишечный, респираторный тракты, мочеполовая система – типа гастроэнтероколитов, бронхопневмоний, метритов, маститов, протекают с участием не одного, а одновременно нескольких возбудителей. (, 1985, 1999; , 1999; с соавт. 1999; , 1999).

Специфическая профилактика многих бактериальных инфекций является недостаточно эффективной, поэтому, ведущая роль в борьбе с ними принадлежит химиотерапевтическим препаратам, в частности, антибиотикам, сульфаниламидам, нитрофуранам.

Учитывая, что заболевания редко протекают в виде моноинфекций, а чаще в сочетании друг с другом, для борьбы с ассоциациями требуются препараты широкого спектра действия, в том числе и комплексы антибиотиков, одновременно действующих на нескольких возбудителей (, , 1991; , 2008).

Проблема антибиотикотерапии в интенсивном животноводстве состоит в том, что фармацевтические компании фактически не ведут разработки принципиально новых молекул, как это происходит в медицине. Наиболее успешно эта проблема решается с помощью использования комбинированной антибиотикотерапии.

Нередко, комплекс антибактериальных веществ обладает синергидным эффектом, что позволяет снизить дозу препарата или разработать более удобную схему лечения, уменьшив тем самым риск возникновения побочных эффектов.

В связи с этим перспективным является разработка нового антибактериального комбинированного препарата на основе гентамицина сульфата и диоксидина.

Обоснованность этой комбинации связана с тем, что в лекарственной форме одновременно сочетаются два бактерицидных агента, обеспечивающих синергидный эффект за счет того, что эти препараты действуют в одну фазу клеточного роста, но на разные метаболические пути.

В основе антибактериального действия диоксидина лежит избирательное подавление синтеза ДНК. Кроме этого препарат снижает активность внеклеточной нуклеазы и плазмокоагулазы у микроорганизмов, что приводит к нарушению функции генетического аппарата микробной клетки и в результате подавляется биосинтез биологически активных макромолекул, являющихся факторами патогенности.

Механизм действия гентамицина связывают с нарушением синтеза полипептидов микробной клетки в рибосомах.

Основной целью сочетанного применения диоксидина и гентамицина, является расширение спектра антибактериального действия, восполнение пробелов в спектре каждого из компонентов комбинации, и предупреждение формирования устойчивости микроорганизмов.

Цель и задачи исследований. Целью исследования являлась разработка оптимального состава комплексного антибактериального препарата диоксиген, проведение его фармако-токсикологической оценки и изучение клинической эффективности.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

- разработать лекарственную форму нового комплексного антибактериального препарата диоксиген;

- изучить острую, хроническую токсичность, местно-раздражающее и аллергизирующее действие, кумулятивные, эмбриотоксические и тератогенные свойства в опытах на лабораторных животных;

- изучить влияние диоксигена на организм крупного рогатого скота в субхроническом опыте;

- изучить фармакокинетику и определить остаточные количества компонентов препарата диоксиген в организме телят;

- испытать в условиях производства диоксиген при респираторной патологии телят;

- разработать и представить для согласования и утверждения в установленном порядке проект инструкции по применению диоксигена при респираторной патологии телят.

Научная новизна. Теоретически и экспериментально обоснован состав нового комплексного антибактериального препарата диоксиген, изучены его фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность при респираторной патологии телят. Установлены особенности распределения, накопления и сроки выведения остаточных количеств диоксигена из организма крупного рогатого скота после его применения. В условиях животноводческих хозяйств подтверждена терапевтическая эффективность и целесообразность применения препарата при респираторной патологии телят. Новизна исследований подтверждена патентом РФ «Способ лечения респираторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных» № 000 от 01.01.01 г.

Практическая значимость. Полученные результаты послужили основанием для разработки нового комплексного антибактериального препарата, технологии его производства, контроля качества и инструкции по применению для лечения респираторных болезней бактериальной этиологии у телят, которые вошли в разработанную и утвержденную нормативно-техническая документация на препарат диоксиген (СТО 09-2008 и инструкции, утверждённой заместителем руководителя Россельхознадзора РФ за №ПВР-2-1.8/02137 от 22.г.)

Апробация работы. Основные результаты исследований были пред-ставлены на заседании методической комиссии ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» протокол №1 от 01.01.2001 года; Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - будущее в развитии АПК» (Воронеж, 2007); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2008); научно-практической конференции Фармакологов РФ, посвященной 85-летию со дня рождения профессора «Фармакологические и экотоксикологические аспекты ветеринарной медицины» (Троицк, 2008); Первом съезде фармакологов России (Воронеж, 2007).

Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 7 печатных работах, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария и кормление», рекомендованном ВАК Минобразования РФ, 1 патенте.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 32 таблицами и 7 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и практических предложений. Список литературы состоит из 315 источников, из которых 66 иностранных.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

- фармако-токсикологические свойства диоксигена;

- результаты изучения фармакокинетики и остаточных количеств препарата в организме телят после применения диоксигена;

- терапевтическая эффективность диоксигена при респираторной патологии телят.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Настоящая работа выполнена в отделе фармакологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН в период с гг. в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданию 08.04.01. «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. рег. 15070..06.8.001.2), программа фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации Россельхозакадемии на г. г.

Лабораторные и опытные образцы препарата диоксиген изготовлены в отделе фармакологии ВНИВИПФиТ Россельхозакадемии.

Проведение научно-производственных и экспериментальных опытов осуществлялось в соответствии с требованиями к врачебно-биологическому эксперименту по подбору аналогов, постановке контроля, а также соблюдению одинаковых условий кормления и содержания животных во время проведения работы и учета результатов. Перед проведением экспериментов животные выдерживались на карантине в течение 2 недель. Доступ к воде и корму был свободным, световой режим естественным.

В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии , , , и другие, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.

При выполнении работы проводили токсикологические, физико-химические, гематологические, биохимические исследования с применением современных методов.

В опытах было использовано следующее количество животных: беспородные белые мыши обоего пола массой 18-22 г (191 гол.); беспородные белые крысы обоего пола массой 180-230 г (234 гол.); морские свинки обоего пола массой 270-310 г белого цвета или имеющих крупные белые пятна на боках туловища (24 гол.); кролики массой 2-2,5 кг (8 гол.); телята массой 45-50 кг (46 гол.). Клинические испытания препарата в производственных условиях проведены на телятах (421 гол.) с массой кг, 2-2,5 мес. возраста.

Изучение антимикробной активности и оптимального соотношения компонентов (гентамицина и диоксидина) в препарате диоксиген проводилось in vitro методом серийных разведений ( с соавт, 1986; с соавт., 1988; с соавт, 1995). В качестве тест-культур использовали референтные и полевые (патогенные) штаммы микроорганизмов – возбудителей респираторных болезней телят, типированных по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим и серологическим свойствам.

Минимальную бактериостатическую концентрацию (МБсК) изучаемых препаратов определяли методом серийных разведений в мясопептонном бульоне (МПБ); минимальную бактерицидную концентрацию – путем высева из пробирок с прозрачной средой на плотные питательные среды (МПА), не содержащие препарат.

В опытах in vivo определена эффективность гентамицина и диоксидина, а также этих компонентов в различных соотношениях проводили в модельных опытах при экспериментальном заражении белых мышей Staphylococcus aureus 209Р (500 млн м. к./мышь) и Pasteurella multocida 1тыс. м.к./мышь).

Острую, хроническую и субхроническую токсичность оценивали в соответствии с «Методическими указаниями по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утвержденными ГУВ СССР (1991), аллергенную активность в соответствии с «Методическими рекомендациями по оценке аллергенных свойств фармакологических средств» (1988), эмбриотоксическую и тератогенную активность - в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению репродуктивной токсичности фармакологических средств» (1997).

Параметры токсичности препарата определяли в остром опыте по общепринятой методике (, 1963; , 1970). Эксперименты проведены на половозрелых конвенциональных нелинейных разнополых белых мышах (172 гол.) и белых крысах (132 гол.) при однократном пероральном, внутримышечном и внутрибрюшинном введении диоксигена. Наблюдение за животными проводили непрерывно на протяжении первого дня после введения препарата. В последующем состояние животных отмечали дважды в сутки в течение 14 дней. Регистрировали общий статус и поведение животных, состояние нервно-мышечных и вегетативных функций, шерстного покрова, поедание корма, потребление воды. Особое внимание уделяли развитию признаков токсикоза, оценивали их тяжесть, продолжительность, время выздоровления или гибели животных. Павших животных и особей с признаками отравления препаратом, подвергали патологоанатомическому вскрытию.

Изучение хронической токсичности препарата проводили на 60 белых крысах-самцах с массой г при внутримышечном введении препарата в течение 21 дня. Общетоксическое действие препарата оценивали по динамике массы тела животных при взвешивании 1 раз в неделю, гематологическим показателям – при исследовании крови у крыс 1 раз в неделю на протяжении 3-х недель введения диоксигена, состоянию системы гемостаза – по окончании курса инъекций и через неделю восстановительного периода.

В опыте использовали контрольную группу животных той же численности и состава, что и подопытные. Контрольным животным вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия.

Влияние диоксигена на функциональное состояние почек оценивали по состоянию спонтанного суточного диуреза и диуреза, индуцированного водной нагрузкой, содержанию в моче белка, глюкозы, крови, лейкоцитов.

Спонтанный диурез изучали в обменных клетках с подачей воды и корма при температуре 22±10С. Регистрировали количество суточной мочи, которую подвергали химическому и микроскопическому анализу.

Для оценки диуретической функции почек методом водной нагрузки крысам-самцам интрагастрально вводили теплую водопроводную воду (380С) в объеме 3 мл/100 г и за каждый час на протяжении последующих 5 часов регистрировали объем выделяемой мочи, который выражали в % к объему введенной воды.

Изучение кумулятивной способности препарата проводили по методу Лима. Для изучения кумулятивных свойств диоксигена были подобраны две группы белых крыс: 1-я – контрольная (10 крыс), которым внутримышечно вводили стерильный физиологический раствор; 2-я – опытная (10 крыс), которым внутримышечно вводили диоксиген дробно в возрастающих дозах в соответствии со схемой (табл. 1).

Таблица 1

Схема введения диоксигена при изучении кумулятивных свойств

Доза диоксигена	Дни введения
1-4	5-8	9-12	13-16	17-20	21-24	25-28
Ежедневно вводимая доза в частях от однократной ЛД50	0,10	0,15	0,22	0,34	0,50	0,75	1,12
Суммарная доза за 4 дня в частях от однократной ЛД50	0,40	0,60	0,90	1,40	2,00	3,00	4,50
Суммарная доза по периодам введения в частях от однократной ЛД50	0,40	1,00	1,90	3,30	5,30	8,30	12,80

Субхроническую токсичность изучали на 15 клинически здоровых телятах в возрасте 15-20 дней средней массой кг, которые были разделены на три группы по 5 телят в каждой. Первая группа – контрольная. Вторая группа получала в течение 10 дней препарат диоксиген в дозе 0,1 мл/кг внутримышечно 2 раза в сутки, третья – в дозе 0,5 мл/кг внутримышечно 2 раза в сутки. Токсическое действие препарата при его внутримышечном применении оценивали по ежедневному клиническому наблюдению с учетом общего состояния, температуры тела и дыхания. В начале опыта и на 10 день брали кровь у телят из яремной вены в утреннее время (до кормления) для морфологического и биохимического исследования.

Изучение эмбриотоксического и тератогенного действия диоксигена проведено по методике с соавт. (1977) на самках белых крыс массой 180,0±15,0 г. Фазу полового цикла устанавливали путем исследования вагинального содержимого. Первым днем беременности считали день обнаружения спермиев после подсадки самцов к самкам. Животные были разделены на три группы: контрольную и две опытные. Крысам первой опытной группы - на 5-й день беременности (период имплантации) и второй опытной группы - на 10-й день беременности (период органогенеза), вводили диоксиген в дозе 0,8 мл/кг массы тела внутримышечно. Для выявления повреждающего действия препарата на плод половину самок убивали на 19-20 день беременности. Проводили осмотр матки, плацент и плодов, подсчитывали количество желтых тел беременности, оценивали равномерность расположения плодов в рогах матки. Раннюю и позднюю резорбцию, общую эмбриональную смертность, выживаемость подсчитывали по формулам, предложенным и (1977). В целях выявления патологии внутренних органов эмбрионов, материал фиксировали в жидкости Боуэна и 700 спирте. Аномалии скелета выявляли по методу Даусона (1984).

Критериями оценки эмбриотоксического и тератогенного действия препарата служили показатели: гибель зародышей на пред - и постимплантационных стадиях развития (эмбриональный эффект), наличие аномалий развития внутренних органов и скелета (тератогенный эффект), а также уровень плодовитости крыс, масса зародышей.

Опыты по изучению раздражающего действия на кожу были проведены на кроликах с массой тела 1,9 -2,0 кг. Количество животных в опытных и контрольных группах составляло по 6 особей разных полов. Исследуемый препарат наносили в чистом виде. Площадь нанесения составляла 80-82 см2 (5% от общей поверхности тела животных). За два дня до эксперимента тщательно выстригали шерсть на спине, избегая механических повреждений кожных покровов. Препарат равномерно распределяли по поверхности участка тела в дозах от 0,02-0,12 мл/см2. Экспозиция 4 часа, после чего кожу аккуратно протирали ватным тампоном, смоченным дистиллированной водой. Реакцию кожи на воздействие препарата оценивали через 1 и 16 часов после однократного нанесения, учитывая, что функциональные нарушения кожи характеризуются появлением различной степени выраженности эритемы, отека, трещин, изъязвлений, изменением температуры. Раздражающее действие диоксигена на слизистые изучено с помощью коньюктивальной пробы (по , 1976) на 2 кроликах массой тела 1,9 -2,0 кг. Под верхнее веко правого глаза вносили по 0,05 мл подогретого до 400 С раствора препарата. Для контроля в левый глаз тем же животным по 1 капле физиологического раствора. Через 0,5; 1; 2; 3; 4; 5; 6 и 24 часа после инстилляции препарата учитывалось клиническое состояние животных (температура тела, частота пульса, количество дыхательных движений), в том числе изменение кровенаполнения конъюнктивы, состояние век и роговицы, наличие выделений. Оценку проводили в баллах согласно таблице 2.

Таблица 2

Оценка степени раздражающего действия на конъюнктиву

Интенсивность реакции	Оценка в баллах	Раздражающий эффект
Отсутствие реакции	0	Отсутствует
Слабая гиперемия	2	Слабый
Выраженная гиперемия	4	Слабо выраженный
Наличие лакримации	6	Умеренный
Наличие выделений	8	Выраженный
Отек век	10	Сильно выраженный

Влияние препарата на качество мясопродуктов изучено с использованием слепого метода по 9-ти бальной шкале для органолептической оценки качества вареного мяса и бульона разработанного ВНИИМП (1985), на двух группах кроликов-аналогов, со средней массой тела 2,6 кг по три животных в каждой. Кролики первой группы препарат не получали - контрольная группа. Животным второй группы диоксиген вводили в дозе 0,1 мл/кг массы тела два раза в сутки внутримышечно в течение 7 дней. Через одни сутки после окончания применения диоксигена кроликов забивали и проводили комиссионную органолептическую оценку вареного мяса и бульона.

Опыты по изучению терапевтической эффективности диоксигена при респираторной патологии проведен в трех опытах на телятах 2-2,5-месячного возраста весом 55-95 кг. Первый опыт проведен в Хохольского района Воронежской области, второй - в СХА «Свобода» Россошанского района Воронежской области и третий - в дубрава» Липецкого района Липецкой области.

Диагноз на заболевание устанавливали комплексно на основании данных клинического обследования животных, лабораторных исследований, патологоанатомического вскрытия, с учетом эпизоотической ситуации в хозяйстве.

Фармакокинетику диоксигена в крови и остаточные количества в органах и тканях изучали после однократного и двукратного внутримышечного введения препарата в дозе 0,1 мл/кг массы тела по показателям концентрации действующих веществ в крови через 0,5, 1, 3, 6, 8, 12, 24 часа после введения препарата. При проведении исследований руководствовались «Методическими указаниями по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства» № 000-84 от 29.06.84 г. Приготовление тест-культур, микробной взвеси, агаризованных сред и буферных растворов, основного и промежуточных растворов стандартов антибиотиков и построение стандартных кривых проводили по методикам, описанным в справочнике «Антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны в ветеринарии» ( с соавт., 1988).

Определение гентамицина в плазме крови проводили микробиологическим методом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus pumilus NCTC 8241, основанном на сравнении величин зон задержки роста, образуемых испытуемым биоматериалом и стандартного образца гентамицина известной концентрации. Определение диоксидина проводили спектрофотометрическим методом с использованием калибровочных кривых.

С целью характеристики общего состояния животных при проведении модельных опытов общепринятыми методами, описанными в соответствующих руководствах ( с соавт., 2004) в крови определяли количество эритроцитов (1012/л); гемоглобина (г/л); СОЭ (мм/ч); лейкоцитов (109/л). Фракции белка определяли электрофорезом в агарозном геле, концентрацию общего белка, липидов и билирубина наборами фирмы «Vital Diagnostics», концентрацию мочевины, фосфора, холестерина, глюкозы, креатинина, кальция, активность аспартат– и аланинаминотрасфераз (АсАТ и АлАТ), щелочной фосфатазы и γ-глутамилтрансферазы – на биохимическом анализаторе «Hitachi-902».

Статистическая обработка результатов проведена с пользованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel», «Statistica 5,0» на PC «Pentium III». Достоверность отличий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента (, 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Антибактериальная активность диоксигена

Антибактериальную активность диоксигена изучали совместно с сотрудниками отдела микробиологии, вирусологии и иммунологии ВНИВИПФиТ (зав. отд. ).

Активность диоксигена (табл. 3) в отношении стафилококков находилась в пределах 0,39-0,78 мкг/мл, в отношении полевых штаммов стрептококков – 0,78 мкг/мл. В отношении музейных и полевых штаммов пастерелл минимальная бактериостатическая концентрация диоксигена составила 3,12-6,25 мкг/мл.

Таблица 3

Антимикробная активность диоксигена в отношении возбудителей

респираторной патологии

Культура микроорганизмов	МБсК	МБцК
Staphylococcus aureus 209Р	0,78	3,12
Staphylococcus aureus (п)	0,39	1,56
Streptococcus pneumoniae (п)	0,78	1,56
Pasteurella multocida 1314	3,12	6,25
Pasteurella multocida (п)	6,25	12,5
Bordetella bronchiseptica	6,25	12,5

Активность препарата в отношении бордетелл также была высокой – 6,25 мкг/мл. Бактерицидное действие диоксигена в отношении изученных культур превышало бактериостатическое - в 2 раза.