Исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества (стр. 2 )

Содержание дубильных веществ в ЛРС в пересчете на танин, определенное методом спектрофотометрии и перманганатометрии (поГФ ХI).

ЛРС	Х сумма дубильных веществ в пересчете на танин, % (спектрофотометрия)	Х сумма дубильных веществ в пересчете на танин, % (перманганатометрия)	Норма по НД, % (не менее)
Корневище змеевика	19,72 ± 0,22	25,38 ± 1,34	15
Корневище бадана	27,69 ± 0,31	30,90 ± 1,54	20
Корневище лапчатки	17,27 ± 0,37	24,30 ± 1,18	20
Корневище и корни кровохлебки	25,19 ± 0,70	32,50 ± 1,50	14
Плоды черники	3,12 ± 0,10	5,97 ± 0,48	не регла-ментируют
Плоды черемухи	2,73 ± 0,08	4,56 ± 0,28	1,7
Соплодия ольхи	18,99 ± 0,54	19,01 ± 0,32	20
Кора дуба	5,96 ± 0,23	12,49 ± 0,91	8
Кора калины	3,94 ± 0,14	6,16 ± 0,27	4
Лист сумаха	35,26 ± 0,45	не определяют перманганато-метрически	15
Лист скумпии	27,60 ± 0,91	15
Лист чая	11,76 ± 0,38	8,30 ± 0,27	не регла-ментируют
Трава зверобоя	20,08 ± 0,76	14,39 ± 0,52

Разработка методики определения полифенольных соединений в ЛРС с использованием реактивов осаждения пересчете на галловую кислоту.

Европейская фармакопея в качестве показателя содержания действующих веществ в ЛРС, приводит показатель – содержание дубильных веществ, осаждаемых гольевым порошком, в пересчете на пирогаллол. Этот показатель по сравнению с показателем содержания дубильных веществ в пересчете на танин (по ГФ ХI) значительно ниже. Так как по ГФ ХI под названием «дубильные вещества» определяется сумма всех полифенольных соединений, извлекаемых водой и титруемых перманганатом калия 0,02М в присутствии индигосульфокислоты. Нами разработана методика определения содержания полифенольных соединений в пересчете на галловую кислоту после осаждения дубильных веществ 1% раствором коллагена.

Методика проведения анализа.

Около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм, помещают в колбу вместимостью 500 мл, заливают 250 мл нагретой до кипения воды и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин при периодическом перемешивании. Охлаждают до комнатной температуры, фильтруют через вату, отбрасывая первые 50 мл фильтрата. Аликвоту переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, и доводят водой до метки (раствор А). Параллельно к 30 мл водного извлечения добавляют раствор коллагена 1%. Смесь взбалтывают 60 мин, фильтруют через бумажный фильтр. Определенное количество, соответствующее конкретному виду ЛРС переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят водой до метки (раствор В). Измеряют оптическую плотность обоих растворов на спектофотометре при длине волны 277 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют воду.

Cодержание дубильных веществ, осаждаемых раствором коллагена 1% в пересчете на галловую кислоту и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) в ЛРС определяют как разницу между содержанием дубильных веществ в растворах А и В. Результаты количественного определения представлены в Таблице 4. Метрологичесие характеристики разработанных методик представлены в Таблице 5.

УФ-спектры поглощения водных извлечений ЛРС представлены на рисунках 13,– водное извлечение ЛРС (сумма полифенольных соединений), 2 – водное извлечение после адсорбции дубильных веществ реактивом осаждения (1% раствором коллагена)).

Рис. 13. Корневища змеевика	Рис. 14. Кора дуба

Таблица 4

Содержание осаждаемых дубильных веществ, суммы полифенольных соединений, не осаждаемых фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту, определенных методом спектрофотометрии (Х,%).

ЛРС	Х осаждаемых дубильные вещества, %	Х не осаждаемых полифенольные соединения, %	Х сумма полифенольных соединений, %
Корневища змеевика	8,75 ± 0,62	3,15 ± 0,12	12,00 ± 0,08
Корневища бадана	12,47 ± 0,29	6,02 ± 0,44	18,48 ± 0,66
Корневища лапчатки	7,28 ± 0,02	3,92 ± 0,07	11,20 ± 0,08
Корневища и корни кровохлебки	8,43 ± 0,73	7,06 ± 0,11	15,49 ± 0,62
Плоды черники	0,59 ± 0,04	1,56 ± 0,03	2,16 ± 0,04
Плоды черемухи	0,61 ± 0,01	1,17 ± 0,01	1,79 ± 0,02
Соплодия ольхи	6,16 ± 0,08	6,11 ± 0,16	12,27 ± 0,20
Кора дуба	2,12 ± 0,03	1,82 ± 0,08	3,93 ± 0,06
Кора калины	0,95 ± 0,03	1,73 ± 0,05	2,68 ± 0,04
Лист сумаха	12,71 ± 0,14	10,14 ± 0,21	22,85 ± 0,32
Лист скумпии	10,93 ± 0,04	6,71 ± 0,29	17,64 ± 0,30
Лист чая	4,15 ± 0,22	4,05 ± 0,15	8,21 ± 0,37
Трава зверобоя	5,03 ± 0,27	8,36 ± 0,26	13,39 ± 0,40

Таблица 5

Метрологические характеристики методики количественного определения дубильных веществ, осаждаемых 1% раствором коллагена в пересчете на галловую кислоту методом спектрофотометрии.

№	ЛРС	f	X¯	S2	S	P, %	t(F, P)	ΔX	ΔX¯	E, %	E¯, %
1	Корневища змеевика	4	8,75	0,0496	0,2227	95	2,78	0,62	0,28	7,08	3,17
2	Корневища бадана	4	12,47	0,0109	0,1045	95	2,78	0,29	0,13	2,33	1,04
3	Корневища лапчатки	4	7,28	0,0001	0,0075	95	2,78	0,02	0,01	0,28	0,13
4	Корневища и корни кровохлебки	4	8,43	0,0681	0,2610	95	2,78	0,73	0,32	8,61	3,85
5	Плоды черники	4	0,59	0,0002	0,0143	95	2,78	0,04	0,02	6,73	3,01
6	Плоды черемухи	4	0,61	0,0001	0,0038	95	2,78	0,01	0,01	1,71	0,76
7	Соплодия ольхи	4	6,16	0,0008	0,0291	95	2,78	0,08	0,04	1,31	0,59
8	Кора дуба	4	2,11	0,0001	0,0120	95	2,78	0,03	0,01	1,58	0,71
9	Кора калины	4	0,95	0,0001	0,0093	95	2,78	0,03	0,01	2,72	1,22
10	Лист сумаха	4	12,71	0,0025	0,0498	95	2,78	0,14	0,06	1,09	0,49
11	Лист скумпии	4	10,93	0,0002	0,0141	95	2,78	0,04	0,02	0,36	0,16
12	Лист чая	4	4,15	0,0062	0,0785	95	2,78	0,22	0,10	5,26	2,35
13	Трава зверобоя	4	5,03	0,0092	0,0936	95	2,78	0,27	0,12	5,31	2,37

Оптимизация фармакопейной методики определения содержания дубильных веществ в ЛРС

При определении содержания дубильных веществ в ЛРС методом перманганатометрии установление точки эквивалентности в присутствии индигосульфокислоты в окрашенных извлечениях из-за размытого перехода окраски раствора вызывает затруднения. При сравнительном изучении определения содержания дубильных веществ в корневищах бадана перманганатометрическим титрованием с использованием индикатора индигосульфокислоты и приборного установления точки эквивалентности с использованием рН-метра рН-410 (Россия) нами были получены результаты, приведенные в Таблице 6.

Таблица 6

Результаты сравнительного определения дубильных веществ в корневищах бадана.

Метод определения	Потенциометрия	Перманганатометрия	Норма по ГФ
Содержание дубильных веществ,	19,58% ± 0,92%	30,90 ± 1,54	не менее 20%

Статистическую обработку данных проводили по ГФ ХI, используя программу Microsoft Excel. Метрологические характеристики воспроизводимости методики представлены в Таблице 7. Методика воспроизводима и не имеет систематической ошибки.

Относительная ошибка единичного определения методики количественного определения суммы дубильных веществ с 95% вероятностью составляет ±4,71%.

Таблица 7

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы дубильных веществ методом потенциометрического титрования в пересчете на танин (Р=95, n=6).

F	X¯	S2	S	P, %	t(F, P)	ΔX	E, %
5	19,58	0,1285	0,3584	95	2,57	0,92	4,71

Разработка ВЭЖХ-методики определения отдельных компонентов дубильных веществ в коре дуба.

Для определения содержания свободной и связанной галловой кислоты, эллаговой кислоты в водных извлечениях коры дуба, а также для изучения осаждения полифенольных соединений 1% раствором коллагена был выбран метод ВЭЖХ.

Методика проведения анализа:

Извлечение готовили как указано в методике на стр. 17 (раствор А). Определение содержания свободной и связанной галловой кислоты проводили до и после кислотного гидролиза: к 10 мл раствора А прибавляют 2 мл хлористоводородной кислоты разведенной 1:1, кипятят с обратным холодильником 30 мин, фильтруют (раствор A`).

Параллельно готовят 0,05% растворы сравнения в спирте 60%: галловой, эллаговой кислот. Полученные результаты представлены в Таблице 8.

Для определения возможности использования нового реактива осаждения – 1% раствора коллагена проводили ВЭЖХ водных извлечений до и после осаждения дубильных веществ 1% раствором коллагена. На примере эллаговой кислоты показано, что 1% раствор коллагена, осаждает 97 ± 2% эллаговой кислоты из водного извлечения коры дуба.

Таблица 8

Содержание свободной и связанной галловой кислоты в коре дуба

Содержание свободной галловой кислоты, %	Содержание связанной галловой кислоты, %	Суммарное содержание свободной и связанной галловой кислоты, %
0,46 ±0,04	0,56 ±0,05	1,02 ±0,25

Полученные результаты подтверждают правильность выбора 1% раствора коллагена в качестве реактива осаждения для количественного определения осаждаемых дубильных веществ в ЛРС методом спектрофотометрии.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1.  Проведен анализ нормативной и научной литературы по стандартизации ЛРС и препаратов, содержащих дубильных вещества, выявлены тенденции в использовании современных физико-химических методов для идентификации и определения содержания дубильных веществ.

2.  Изучена вариабельность диагностических признаков подземных органов змеевика, бадана, лапчатки и кровохлебки, коры дуба и калины, плодов черники и черемухи, соплодий ольхи при измельчении. Выявлены наиболее вариабельные элементы: проводящие пучки и их части, механические волокна, цепочки друз оксалата кальция в подземных органах; конгломераты каменистых клеток и лубяные волокна в корах; фрагменты проводящих пучков и эндокарпия в плодах.

3.  При сравнительном изучении порошков ЛРС выявлены и описаны диагностические признаки, позволяющие идентифицировать порошки близких видов сырья различных морфологических групп, подтвержденные фотоматериалами.

4.  Разработаны методики пробоподготовки для идентификации изучаемых видов сырья методом микроскопии и получения спектральных характеристик порошков ЛРС разных морфологических групп.

5.  Получены ИК - и КР-спектры для 11 видов ЛРС и 8 стандартных образцов: глюкозы, крахмала, фруктозы, танина, пирогаллола, галловой и эллаговой кислот, рутина; описаны их характеристики. Полученные спектры рекомендованы для идентификации сырья.

6.  Подобраны оптимальные условия для идентификации ЛРС методом ТСХ для 11 видов сырья; разработаны хроматографические характеристики, которые рекомендованы для включения в НД.

7.  Разработаны методики определения содержания суммы дубильных веществ в ЛРС методом спектрофотометрии в пересчете на танин и галловую кислоту. Ошибка методов составила в среднем соответственно 2,79% и 1,53%.

8.  Разработана ВЭЖХ-методика идентификации и определения содержания свободной и связанной галловой кислоты в коре дуба.

9.  Предложен новый реактив осаждения дубильных веществ в водных извлечениях из 13 видов ЛРС. Приоритетность научных исследований по возможности использования реактивов осаждения подтверждена заявкой на изобретение «Способ определения содержания дубильных веществ в растительном сырье» №2

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  Гринько вариабельности диагностических признаков корневищ бадана (Rhizomata Bergeniae) при измельчении. // Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни. ХI международный конгресс "Здоровье и образование в ХХ I веке. М. – 2010 г. – С. 73 – 75.

2.  Гринько выбора метода количественного определения дубильных веществ в лекарственном растительном сырье. // Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни. ХI международный конгресс "Здоровье и образование в ХХ I веке. М. – 2010 г. – С. 76.

3.  Гринько российской и европейской фармакопей к методикам определения содержания дубильных веществ в лекарственном растительном сырье. // Фармация. 2010. – № 5. – С. 49 – 53.

4.  , Самылина вариабельности диагностических признаков лекарственного растительного сырья кровохлебки при измельчении. // Гомеопатический ежегодник. Материалы ХХI Московской международной гомеопатической конференции "Развитие гомеопатического метода в современной медицине. М. – 2011 г. – С.204–209.

5.  , Самылина диагностических признаков лекарственного растительного сырья соплодий ольхи (Fructus Alni). // Гомеопатический ежегодник. Материалы ХХI Московской международной гомеопатической конференции "Развитие гомеопатического метода в современной медицине. М. – 2011 г. – С. 207 – 214.

6.  Гринько исследование требований фармакопей к качеству лекарственного растительного сырья кора дуба (Cortex Quercus). // Научно-методическая конференция "Гаммермановские чтения – 2011". – СПб.: Издательство СПХФА. – 2011 г. – С.24–26.

7.  , Самылина проявляемости диагностических признаков в корневищах бадана (Rhizomata Bergeniae) при измельчении. // Научно-методическая конференция "Гаммермановские чтения – 2011". – СПб.: Издательство СПХФА. – 2011 г. – С. 26 – 27.

8.  , Самылина признаки плодов черники (Fructus Myrtilli) в цельном, измельченном сырье и порошке. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты. – Самара. – 2011. – С. 111 – 112.

9.  , Самылина диагностических признаков в микропрепаратах корневищ змеевика при измельчении. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты». – Самара. – 2011. – С. 109 – 110.

10.  , Самылина вариабельности диагностических признаков лекарственного растительного сырья бадана при измельчении. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск: Пятигорская ГФА. – 2011. – Вып. 66. – С. 45 – 48.

11.  , Самылина изучение диагностических признаков цельного, измельченного сырья и порошка плодов черемухи (Padus Avium Mill.). // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Пятигорск. – 2011. – Вып. 66. – С. 48 – 50,

12.  , , Харитонов ИК - и КР-спектров корневищ змеевика. Сообщение 1. // Фармация. 2011. – № 6. – С. 24 – 27.

13.  , Самылина содержания дубильных веществ в коре дуба методом ВЭЖХ. // Традиционная медицина. 2011. – № 5 (28). – С. 180 – 183.