На правах рукописи

ИССЛЕДОВАНИЯ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ДУБИЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА.

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2011 г.

Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский

государственный медицинский университет имени

Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

член-корр. РАМН, профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук
Доктор фармацевтических наук

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита диссертации состоится «___» ____________ 201 г. в на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке Первого МГМУ им. (ЦНМБ) г. Москва, Нахимовский проспект.

Автореферат разослан «___» _____________ 201 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

доктор фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения в России составляет более 40%. Лекарственное растительное сырье (ЛРС), содержащее дубильные вещества широко применяется для получения лекарственных препаратов, обладающих вяжущим, кровоостанавливающим, противовоспалительным действием. Эта группа растительного сырья включена в ГФ XI, ГОСТы, ФС.

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

Измельченное ЛРС, содержащее дубильные вещества, отпускается из аптечных учреждений без рецепта для приготовления настоев и отваров в домашних условиях. ЛРС должно быть стандартизированным и соответствовать высоким нормам фармакопейных требований.

В Государственную Фармакопею ХI издания (ГФ ХI) включено 11 статей на ЛРС, содержащее дубильные вещества, а также общая фармакопейная статья «Определение содержания дубильных веществ в ЛРС», которые требуют совершенствования и гармонизации с международными фармакопейными требованиями.

Актуальным является разработка и совершенствование методик по идентификации ЛРС, в том числе измельченного и порошка, определения содержания действующих веществ; создание проектов современной нормативной документации на ЛРС, содержащее дубильные вещества.

Цель исследования. Проведение комплексных теоретических и экспериментальных исследований по стандартизации фармакопейного ЛРС, содержащего дубильные вещества.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— провести анализ требований отечественной и зарубежной нормативной документации и научных данных по стандартизации ЛРС, содержащего дубильные вещества;

— изучить вариабельность диагностических признаков цельного, измельченного и порошка ЛРС с использованием микроскопического метода;

— изучить спектральные и хроматографические характеристики ЛРС;

— разработать характеристики подлинности ЛРС с использованием современных физико-химических и микроскопических методов анализа;

— оптимизировать фармакопейные методики определения содержания дубильных веществ в ЛРС с использованием современных физико-химических методов анализа.

— изучить возможность использования нового реактива осаждения для определения содержания дубильных веществ в ЛРС.

Научная новизна. На основании микроскопического анализа разных морфологических групп сырья, получены новые данные по вариабельности диагностических признаков при измельчении сырья, позволяющие идентифицировать порошки 9 видов ЛРС, содержащего дубильные вещества.

При сравнительном изучении диагностических признаков измельченного сырья корневищ бадана, змеевика, лапчатки, имеющих пучковый тип строения; корневищ (беспучковый тип строения) и корней (вторичное строение) кровохлебки, выявлены отличия в строении и размерах сосудов ксилемы, механических волокон (змеевик, лапчатка), особенностей формы и размеров кристаллических включений оксалата кальция.

Диагностическое значение в измельченном сырье коры дуба и калины имеют лубяные волокна и каменистые клетки.

Измельченное сырье плодов черники, черемухи, ольхи имеет характерные особенности в строении эпидермиса, каменистых клеток, формах кристаллических включений оксалата кальция.

Разработаны характеристики подлинности для 13 видов ЛРС на основе изучения морфолого-анатомических особенностей сырья и физико-химических свойств биологически-активных веществ (БАВ), содержащихся в ЛРС.

На основании изучения анатомического строения измельченного ЛРС различных морфологических групп предложены оптимальные условия пробоподготовки ЛРС для получения ИК - и КР-спектров. Впервые получены и описаны ИК - и КР-спектры 11 видов сырья и 8 стандартных образцов; подобраны оптимальные условия проведения тонкослойной хроматографии (ТСХ) для 11 видов сырья.

На основании результатов реакции взаимодействия 1% раствора коллагена с комплексом дубильных веществ, содержащихся в водных извлечениях 13 видов сырья, предложен способ определения содержания дубильных веществ в сырье, включенный в Патент, подтвержденный Заявкой на изобретение № 2от 01.01.2001г.

Практическая значимость работы.

Полученные результаты по идентификации 11 видов ЛРС с использованием микроскопического и физико-химических методов предложены для включения в проекты фармакопейных статей.

Методика определения содержания суммы дубильных веществ, методом спектрофотометрии предложена для включения в проект ОФС «Определение содержания дубильных веществ в ЛРС».

Полученные данные микроскопического изучения измельченного сырья и ТСХ внедрены в учебный процесс на кафедре фармакогнозии Первого МГМУ им. .

Основные положения, выдвигаемые на защиту. Вариабельность и сравнительное изучение диагностических признаков цельного, измельченного сырья и порошка ЛРС, содержащих дубильные вещества; ТСХ-характеристики, спектральные характеристики (ИК, КР) и обоснование оптимальных условий пробоподготовки ЛРС для их получения; результаты определения содержания дубильных веществ и отдельных компонентов в ЛРС методом спектрофотометрии и ВЭЖХ; совершенствование фармакопейной методики определения содержания дубильных веществ в ЛРС.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены и обсуждены на Научно-практической конференции "Стандартизация готовых лекарственных средств"., Москва, 25.05.2010г.; Итоговой Всероссийской научной конференции молодых исследователей с международным участием "Татьянин день", Москва, 24–26.01.2011г.; ХХI Московской международной гомеопатической конференции "Развитие гомеопатического метода в современной медицине", Москва, 28–29.01.2011г.; Научно-методической конференции "Гаммермановские чтения", Санкт-петербург, 1–3.02.2011г.; Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств", Харьков, Украина, 20–21.04.2011г.

Личный вклад автора. Вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику. Автором лично проведена аналитическая и статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведённого исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 5 и 6 паспорта фармацевтической химии, фармакогнозии.

Связь задач исследований с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в рамках отраслевой научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (№ государственной регистрации 012.). Тема включена в план научных исследований кафедры фармакогнозии «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов, оценки качества и сертификации».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 3 в ведущих изданиях, входящих в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 165 страницах и содержит 34 таблицы, 78 рисунков.

Работа состоит из введения, обзора литературы, четырех экспериментальных глав, общих выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 152 источников литературы, из них 36 зарубежных.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе приведены результаты информационно-аналитического исследования библиографических данных о химическом составе, уровне стандартизации лекарственного растительного сырья, фармакологической активности, применении лекарственного растительного сырья, содержащего дубильные вещества.

В «Экспериментальную часть» включены главы 2–5. Во второй главе «Объекты и методы исследования» приведены данные об объектах исследования, используемых методах, приборах и реактивах, другие сведения методического характера.

В третьей главе представлены результаты изучения вариабельности диагностических признаков различных морфологических групп сырья при измельчении, проявляемости диагностически значимых признаков, дана информация о размерах диагностических признаков для 9 видов ЛРС, а также приводятся сравнительные характеристики подлинности цельного, измельченного сырья и порошка при микроскопическом изучении.

Четвертая глава посвящена разработке характеристик подлинности сырья, основанных на физико-химических свойствах БАВ и включает разработку методики идентификации дубильных веществ в ЛРС, хроматографические и спектральные (ИК и КР) характеристики сырья.

В пятой главе излагаются результаты исследований по разработке современных методик определения содержания дубильных веществ с использованием спектрофотометрии, ВЭЖХ, потенциометрии.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в таблицах, проиллюстрированы графиками, рисунками и фотографиями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили кора дуба, кора калины, корневища змеевика, корневища бадана, корневища лапчатки, корневища и корни кровохлебки, плоды черники, плоды черемухи, соплодия ольхи, листья сумаха, листья скумпии, собранные в Ботаническом саду Первого МГМУ имени в 2008 – 2010 годах, а также измельченное сырье, фасованное в пачки и порошок в фильтр-пакетах, выпускаемое фармацевтическими предприятиями.

Отбор проб для анализ проводился в соответствии с ОФС 42–0013–03 «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб». Микроскопический анализ проводили в соответствии со статьей «Техника микроскопического анализа» (ГФ ХI, вып.2, с.277 – 285).

Микроскопическое исследование проводили на микроскопе ЛОМО МИКМЕД-5 (Россия) с окуляром х10, объективами х4, х10, х40, х100. Фотосъемка велась цифровой камерой Panasonic DMC-LC80 (Япония).

Хроматографическое изучение веществ полифенольной природы проводили методами тонкослойной хроматографии на пластинках "Сорбфил" 10х15см и высокоэффективной жидкостной хроматографии на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 (США). Сбор и обработку хроматограмм осуществляли с помощью программы "ChemStation B.03.01".

КР-спектры порошков растительного сырья измеряли на КР-спектрометре с РАМАН-модулем Thermo Nicolet FT-Raman (США) с детектором InGaAs при мощности лазера 40 W.

ИК-спектроскопию порошков проводили на ИК-спектрометре Thermo Nicolet 6700 с приставкой неполного внутреннего отражения (НПВО) (США) . ИК - и КР-спектры получали в диапазоне 4000–100 см-1. Обработку данных проводили с помощью программы OMNIC Software Version 7.3 Thermo Electron Corporation.

Определение содержания дубильных веществ методом перманганатометрического титрования в пересчете на танин проводили по методике ГФ ХI, вып. 2.

Спектрофотометрическое определение дубильных веществ в ЛРС проводили на спектрофотометре Varian CaryUV 4000 UV-Vis Spectrophotometer (США).

Потенциометрическое определение дубильных веществ проводили на портативном рН-метре рН-410 (Россия) с использованием реакции окислительно-восстановительных взаимодействий. Использовали платиновый электрод-детектор и хлорсеребряный электрод сравнения.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Изучение вариабельности диагностических признаков различных морфологических групп сырья при измельчении.

В существующей нормативной документации микроскопические характеристики измельченного ЛРС и порошка исследуемой группы описаны неполно или отсутствуют. Для составления характеристик подлинности нами была изучена вариабельность диагностических признаков в разных морфологических группах сырья при измельчении.

Установлено, что наиболее вариабельными являются те элементы, размеры которых в результате технологического процесса претерпевают наибольшие изменения: проводящие пучки и их части, механические волокна, цепочки друз оксалата кальция в подземных органах; конгломераты каменистых клеток и лубяные волокна в корах; фрагменты проводящих пучков и эндокарпия в плодах. Для определения подлинности нами предложено использовать фракции порошков с размером частиц от 2,0 до 0,5 мм, в которых встречаются диагностические признаки.


Рис. 1. Кора дуба. Поперечный срез. Ув. х 100. 1 – пробка, 2 – колленхима, 3 – механический пояс каменистых клеток, 4 – лубяные волокна с кристаллоносной обкладкой, 5 – сердцевинный луч.	Рис. 2. Кора дуба. Давленный препарат. Ув. х 100. 1 – каменистые клетки, 2 – лубяные волокна с кристаллоносной обкладкой.

Рис. 3. Кора калины. Поперечный срез. Ув. х 100. 1 – чечевичка, 2 – пробка, 3 – колленхима, 4 – друза оксалата кальция, 5 – лубяные волокна, 6 – сердцевинный луч.	Рис. 4. Кора калины. Давленный препарат. Ув. х 400. 1 – лубяные волокна, 2 – паренхимные клетки, 3 – каменистые клетки, 4 – друза.

Проведено сравнительное изучение диагностических признаков цельного, измельченного сырья и порошка коры дуба и калины, корневищ змеевика, корневищ бадана, корневищ лапчатки, корневищ и корней кровохлебки, плодов черники и черемухи, соплодий ольхи. Охарактеризованы диагностические признаки, позволяющие отличить близкие виды сырья. (Таблица 1, 2; Рис. 1 – 4).

Таблица 1.

Диагностические признаки коры дуба в цельном (поперечный срез), измельченном (давленный препарат) сырье и порошке.

Диагностический признак	Цельное сырье (поперечный срез)	Измельченное сырье и порошок (давленный препарат)
Покровная ткань	Пробка бурого цвета, состоящая из 5 – 8 рядов клеток (длина 28 – 50 мкм, ширина 4 – 8 мкм). Чечевички встречаются редко.	Фрагменты бурой пробки
Колленхима	Клетки округлой или овальной формы (длина 10 – 57 мкм, ширина 4 – 22 мкм), содержат друзы оксалата кальция.	Округлые клетки (встречаются редко).
Паренхима коры	Клетки неправильной формы (длина 12 – 70 мкм, ширина 10 – 30 мкм), встречаются многочисленные клетки с красно-коричневым содержимым (флобафены), клетки с друзами оксалата кальция.	Клетки многоугольной неправильной формы (диаметр 10 – 45 мкм), содержат друзы оксалата кальция.
Вторичная кора	Механический пояс, многочисленные группы лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой и каменистых клеток.	Идентифицируются отдельные ткани: паренхима, механические элементы.
Сердцевинные лучи	Однорядные, состоят из клеток паренхимы, возле камбия содержат группы каменистых клеток.	Идентифицируется как клетки паренхимы коры.
Механические элементы	Механический пояс, состоящий из чередующихся групп лубяных волокон (диаметр 5 – 20 мкм) и групп каменистых клеток (диаметр до 55 мкм), группы (до 30) лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой.	Группы лубяных волокон (длина 60 – 110 мкм, ширина 5 – 20 мкм) с кристаллоносной обкладкой, группы каменистых клеток, образующие конгломераты.
Кристаллические включения	Друзы оксалата кальция диаметром до 35 мкм.

Результаты исследования по изучению вариабельности были положены в основу микроскопических характеристик подлинности 9 видов измельченного ЛРС, подтвержденых фотоматериалами.

Таблица 2

Сравнительное микроскопическое изучение коры дуба и калины.

Распределение диагностических признаков по тканям.

	Кора дуба	Кора калины
Покровная ткань	Пробка бурого цвета, состоящая из 5 – 8 рядов клеток (длина 28 – 50 мкм, ширина 4 – 8 мкм). Чечевички встречаются редко.	Пробка бурого цвета, состоящая из 5 – 8 рядов вытянутых клеток (длина 20 – 50 мкм, ширина 4 – 10 мкм), многочисленные чечевички.
Паренхима коры	Клетки неправильной формы (длина 12 – 70 мкм, ширина 10 – 30 мкм), встречаются многочисленные клетки с красно-коричневым содержимым (флобафены), клетки с друзами оксалата кальция.	Клетки округлые (диаметр 15 – 60 мкм), редко встречаются клетки с красно-коричневым содержимым (флобафены), многочисленные клетки с друзами оксалата кальция.
Механические элементы	Механический пояс, состоящий из чередующихся групп лубяных волокон (диаметр 5 – 20 мкм) и групп каменистых клеток (диаметр до 25 мкм), группы (до 30) лубяных волокон с кристаллоносной обкладкой.	Одиночные или расположенные группами по 2 – 4 лубяные волокна (диаметр 10 – 25 мкм) с толстыми, неодревесневшими, пористыми стенками. Каменистые клетки крупные (диаметр 14 – 20 мкм), расположены тангентально вытянутыми группами по 2 – 6, реже одиночные, одревесневшие, желтого цвета, с пористыми стенками.
Кристаллические включения	Друзы оксалата кальция диаметром до 35 мкм.	Друзы оксалата кальция диаметром 5 – 35 мкм.

Разработка характеристик подлинности сырья, основанных на физико-химических свойствах БАВ.

Качественная реакция осаждения дубильных веществ.

Для идентификации дубильных веществ в ЛРС в ГФ ХI используется реакция с солями железа (III). Соли железа образуют окрашенный комплекс с дубильными веществами, простыми фенолами и их производными. Европейская фармакопея 7 изд. наряду с солями железа использует гольевой порошок, который осаждает только дубильные вещества.

Нами была изучена возможность использования для осаждения дубильных веществ нового реактива – раствора коллагена различной концентрации и показано, что оптимальным является использование 1% раствора коллагена. При сравнительном изучении использования гольевого порошка и коллагена с водными извлечении из 13 видов ЛСР, содержащего дубильные вещества, было установлено, что 1% раствор коллагена может использоваться в качестве реактива осаждения дубильных веществ, наравне с гольевым порошком.

ТСХ-характеристика ЛРС.

Идентификация ЛРС хроматографическими методами анализа широко используется в отечественной и зарубежной НД. В ГФ ХI хроматографические методы не нашли своего применения для анализа ЛРС, содержащего дубильные вещества. Нами было проведено исследование по разработке методик идентификации ЛРС методом ТСХ.

Исследования проводили в нейтральных и подкисленных подвижных системах: №1: эфир – уксусная кислота ледяная – гексан – этилацетат (20:20:20:40), №2: муравьиная кислота безводная – этилацетат – толуол (10:30:60), №3: бутанол – уксусная кислота – вода (4:1:2), №4: этилацетат – муравьиная кислота безводная – вода (80:10:10), №5: хлороформ – вода – спирт (60:30:20).

Обнаружение зон адсорбции БАВ проводили в УФ-свете при длине волны 254 и 365 нм, с последующей обработкой раствором железа (III) аммония сульфата 1% (квасцов железоаммониевых раствор 1% (ЖАК)), ванилина раствором в хлористоводородной кислоте 2%, алюминия хлорида спиртовым раствором 2%.

В результате хроматографического исследования было установлено, использование системы № 2 позволяет охарактеризовать комплекс полифенольных соединений в 8 видах ЛРС разных морфологических групп (корневища змеевика, бадана, лапчатки, корневища и корни кровохлебки, кора дуба, кора калины, плоды черники, соплодия ольхи) (Рис. 5).

Наилучшее разделение полифенольных соединений плодов черемухи, и листьев скумпии происходит в системе № 3, листьев сумаха – в системе № 4, корневищ бадана и лапчатки – в системе №1.

Результаты хроматографического изучения были использованы при составлении ТСХ-характеристик подлинности изучаемого ЛРС.

Рис. 5. ТСХ. Подвижная фаза 2. Муравьиная кислота безводная – этилацетат – толуол (10:30:60). Детектор УФ 365 нм.

1 – галловая кислота, 2 – танин, 3 – кверцетин, 4 – кора дуба, 5 – соплодия ольхи,

6 – корневища и корни кровохлебки, 7 – корневища змеевика, 8 – корневища бадана,

9 – корневища лапчатки, 10 – плоды черники, 11 – плоды черемухи, 12 – кора калины,

13 – листья сумаха, 14 – листья скумпии – извлечения спиртовые 60% (1:10).

Спектральные (ИК, КР) характеристики ЛРС.

В анализе ЛРС находят применение только УФ-спектральные характеристики. Для изучения ИК - и КР-спектров сырья нами была разработана пробоподготовка, которая предусматривала удаление пробки, механических элементови и измельчение сырья до однородного порошка с частицами, проходящими сквозь сито с диаметром отверстий 0,1 мм.

Для получения КР-спектра использовали спрессованный в таблетку порошок сырья. ИК-спектр снимали с помощью приставки неполного внутреннего отражения (НПВО), позволяющей проводить анализ с сухим порошком. Полученные таким образом спектры ЛРС (Рис. 10 – 11) сравнивали со спектрами стандартов: танин, галловая кислота, глюкоза, крахмал, фруктоза, пирогаллол, эллаговая кислота, рутин (Рис. 6 – 9).

Для каждого исследуемого объекта описаны волновые числа (см-1) наиболее интенсивных характерных максимумов полос (ИК НПВО) и линий (КР). Для корневищ змеевика ИК-и КР-спектры имеют следующие максимумы: КР-спектр: 2957 υ(CH), 1622 υas(COO), 1530 υs(COO) + υ (кольца). ИК-спектр: 3308 υas(OH), 2926 υ(CH), 1607 υas(COO), 1538 δ(COH), 1443 υs(COO), 1324 υ(кольца), 1225 υas(кольца), которые свидетельствуют о наличии галловой кислоты, танина, глюкозы и крахмала (Рис. 10).

Результаты исследования КР - и ИК-спектров порошков ЛРС дают возможность рекомендовать спектральные характеристики для идентификации изучаемого ЛРС.

Рис. 6. Спектры галловой кислоты.