Кератоакантома (дифференциальная диагностика с плоскоклеточным раком кожи, совершенствование методов лечения и профилактика озлокачествления) (стр. 1 )

На правах рукописи

Кератоакантома

(дифференциальная диагностика с плоскоклеточным

раком кожи, совершенствование методов лечения и

профилактика озлокачествления)

14.00.11 – кожные и венерические болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва

2007

Работа выполнена в Московском областном научно-исследовательском клиническом институте им.

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится «___»___________г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.10 при Московской медицинской академии им. ( Москва, ул. Трубецкая, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. ( Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «___»_______________2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.208.040.10 доктор медицинских наук, профессор Светлана Ильинична Эрдес

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Кератоакантома (КА) – эпидермальная опухоль кожи, в одних случаях спонтанно инволюцирующая в сроки до 3 месяцев от начала заболевания (типичная КА), в других - длительно персистирующая, достигающая гигантских (более 2 см в диаметре) размеров, рецидивирующая, трансформирующаяся в рак (атипичная КА) /,1993; и др., 2006; Kopf A. W.,1968/.

Столь непредсказуемое клиническое течение КА наряду с трудностью, а зачастую и невозможностью ее дифференциальной диагностики с плоскоклеточным раком (ПКР) кожи /., 1980; Lever W., 2004 / обусловливают актуальность совершенствования методов варификации КА с использованием иммуногистохимических маркеров.

Попытки изучения с этой целью иммуногистохимической экспрессии белков пролиферации (Ki67, PCNA) /Lu S., Tiekso J. et al. 1999.; Matsatu M., Kimura S. et al., 1996.; Ren Z. P., Ponten F., 1996; Sagol O., Kurtoglu B., 1998; Narayan S., De Berker D. et al, 2002/, регуляторов клеточного цикла (циклин А и В) / Tran T. A., Ross J. S., Boehm J. R et al, 1999/, гена супрессора апоптоза р53 / Lee Y.-S., Teh M. 1994; Cain S. T. et al.1995/ пока не увенчались успехом. Причины этого лежат прежде всего в ненадежности диагностических критериев КА при изучении тангенциальных гистологических срезов инцизионных биоптатов, не дающих полного представления о типичной для КА архитектонике новообразования, что может быть поводом для ошибочной диагностики хорошо дифференцированного плоскоклеточного рака кожи /,1973; Fisher E. R. et al.,1972/.

Отсутствие аргументированной концепции патогенеза КА и надежных клинико-лабораторных критериев отличия атипичных форм КА от ПКР кожи привело к тому, что взгляды на тактику ведения больных КА существенно различаются, варьируя от предложения ограничиваться выжиданием в надежде на спонтанную инволюцию опухоли /Emerson C. W. et al.1971; Wolf C. T. et al.,1986/ до назначения такого же лечения как при ПКР кожи /Reymann I.,1977; Penmetcha M. et al.,1987; Humm J. C. et al.,1990; Krunic A. L. et al.1998/.

Однако использование неадекватных для КА хирургических, лучевых и химиотерапевтических методов лечения не только приводит к тяжелым косметическим дефектам, иногда с нарушением функции органа (при локализации процесса на веке, половом члене, ушной раковине), но и далеко не всегда предотвращает рецидив, существенно повышающий частоту трансформации КА в ПКР /, 1993; Lawrence N., Reed R. J.,1990; Hodak E. et al.,1993/.

С другой стороны, данные последних лет о важной роли иммунных механизмов в патогенезе КА / и др., 2006; Lowes M. A. et al.,1999/ подтверждаются сообщениями об эффективности ее лечения иммунотропными препаратами /Samai B., Hallo P.,2000/. Однако доказательств патогенетической обоснованности применения при атипичных КА препаратов интерферона не приводится. В этой связи важно учитывать, что разработка методов иммунотерапии КА должна основываться не только на обоснованном выборе иммунотропного препарата, но и на обеспечении достоверной дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи. /,2006/.

Цель исследования

Изучение клинических особенностей атипичных солитарных кератоакантом, совершенствование методов их дифференциальной диагностики с плоскоклеточным раком кожи на основе иммуногистохимического выявления Ki67 и р63 и иммунотропной терапии реафероном.

Задачи исследования:

1. Выделить клинико-морфологические варианты атипичных кератоакантом и установить частоту их трансформации в плоскоклеточный рак.

2. Оценить различия атипичных кератоакантом и плоскоклеточного рака кожи на основе сравнительной оценки ряда информативных цитологических и гистологических признаков.

3. Разработать объективные критерии дифференциальной диагностики атипичных кератоакантом и плоскоклеточного рака кожи при изучении экспрессии иммуногистохимического маркера пролиферации Ki67 и маркера резервных полипотентных клеток р63 в опухолевом эпидермисе.

4. Разработать на основе изучения иммунного и интерферонового статуса больных атипичными кератоакантомами эффективный метод их иммунотропной терапии рекомбинантным интерфероном α2b реафероном.

Научная новизна

В работе с целью проведения дифференциальной морфологической диагностики атипичных КА и ПКР кожи впервые применено иммуногистохимическое изучение экспрессии белков Ki67 и р63. (Получен патент № 000 на изобретение способа дифференциальной диагностики кератоакантомы и плоскоклеточного рака кожи.)

На основе изучения иммунологического и интерферонового статуса разработан новый метод лечения больных атипичными КА Реафероном.

Научно-практическая значимость

Впервые с целью проведения дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи применен иммуногистохимический метод с использованием маркеров Ki67 и р63. Выявлены различия экспрессии этих маркеров в эпидермальных клетках КА и ПКР кожи.

Разработан эффективный, патогенетически обоснованный метод внутритканевой терапии атипичных КА отечественным препаратом Реаферон, установлена его высокая клиническая эффективность и нормализующее действие на иммунный и интерфероновый статус больного.

Положения, выносимые на защиту.

- Среди больных атипичными КА трансформация в ПКР кожи наблюдалась в 11,4% случаев.

- Экспрессия белка ядер пролиферирующих клеток Ki67 и регуляторного протеина p63, маркирующего полипотентные клетки, в КА выявляется по периферии акантотических разрастаний эпидермиса, в их базальных отделах. В ПКР кожи ядра, экспрессирующие р63 и Ki67, хаотично разбросаны в акантотических выростах и отшнурованных комплексах атипичного эпителия, т. е. выявляются и по периферии, и в центральных отделах опухолевых разрастаний эпидермиса.

- Иммуногистохимическое выявление маркера пролиферации Ki67 и регуляторного протеина p63 позволяет объективизировать проведение дифференциального диагноза между КА и ПКР кожи.

- Метод внутритканевой терапии Реафероном эффективен при лечении атипичных КА и позволяет добиться клинического выздоровления у 96% больных.

- Рецидивы атипичных КА после деструирующих методов лечения встречаются в 27,3% , после реаферонотерапии рецидивы в сроки от 2 до 5 лет (в среднем 3+0,4 года) отсутствуют, а ее патогенетическая обоснованность доказана нормализацией после лечения эффекторных звеньев иммунитета (фагоцитоза, цитотоксичности, NK-клеток), повышением способности субпопуляций лимфоцитов периферической крови к апоптозу и увеличением ИФНα и ИФНγ – продуцирующей способности лейкоцитов крови.

Внедрение результатов исследования

Разработанный метод лечения атипичных КА внедрен в практику отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, разработанный метод дифференциальной диагностики КА и ПКР кожи внедрен в практику патолого-анатомического отделения МОНИКИ. Полученные данные включены в лекционный материал кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. , кафедры патологической анатомии ФППОВ ММА им. .

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на совместном заседании отделения дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ, патолого-анатомического отделения МОНИКИ, кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ, кафедры кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. (2004г.), на научно-практической конференции дерматовенерологов центрального округа Российской Федерации пролиферативные заболевания кожи (Москва 2006г.), на заседании Московского областного общества дерматовенерологов (Москва 2006г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 11 печатных работ, в том числе 1 монография.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит их введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, иллюстрирована 35 рисунками, 51 таблицей. Библиографический указатель включает 15 отечественных и 167 иностранных источников.

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии МОНИКИ им. . Гистологическое и иммуногистохимическое исследования проводились в патологоанатомическом отделении МОНИКИ им. . Иммунологические исследования проводились на базе лаборатории национального справочного центра по интерферону НИИЭМ им. РАМН.

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на основании обследования и лечения 44 больных атипичными КА и 20 больных плоскоклеточным раком (ПКР) кожи. Диагноз в каждом случае устанавливался на основании анамнестических сведений, клинической картины и результатов патоморфологического исследования.

Среди больных атипичными КА мужчин было 24(54,5%), женщин 20(45,5%). Соотношение мужчин и женщин – 1,2:1. Возраст пациентов варьировал от 22 до 89 лет, средний возраст 59,98+1,4 лет.

С целью отработки алгоритма дифференциальной диагностики атипичной КА и ПКР кожи с использованием иммуногистохимического исследования в работу были включены 20 больных инфильтративно-язвенной формой ПКР кожи T1N0M0, госпитализированных в отделение ЧЛХ МОНИКИ для хирургического лечения; среди больных ПКР мужчин было 12(60%), женщин 8(40%); соотношение мужчины и женщин – 2,1:1; возраст пациентов варьировал от 35 до 74 лет, (в среднем 61,88+2,1 лет).

В работе использовали как общепринятые рутинные так и специальные методы исследования. Проточную цитофлуориметрию проводили в реакции непрямой поверхностной иммунофлюоресценции. Определяли уровни экспрессии дифференцировочных антигенов CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD16, CD20, молекул адгезии, CD11, CD50; активационных антигенов HLA-DR, CD38, CD25, CD71. Количество иммуноглобулинов классов G, A, M в сыворотке крови определяли методом радиальной иммунодиффузии в геле.

Оценка интерферонового статуса. Исследование проводилось по методу (1991): определяли количество сывороточного ИФН, уровень продукции αИФН лейкоцитами при его индукции вирусом болезни Ньюкасла (ВБН), уровень продукции γИФН при его индукции стафилококковым энтеротоксином А (СЭА).

Гистологическое и иммуногистохимическое (ИГХ) исследование.

Использована методика Taylor С. R., Cote R. и Sternberger L. A.. Биопсийный материал фиксировали в 10%-ном растворе формалина, забуфференном по Лилли (рН 7,2), затем проводили по батарее спиртов и ксилолов и заливали в парафин по стандартной методике. Использовали специальный парафин с температурой плавления 54°С. Готовили серийные парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с полилизиновым покрытием. Депарафинизацию осуществляли по стандартной схеме. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Перед инкубацией с первичными антителами срезы обрабатывали в микроволновом режиме при мощности 750 Вт в цитратном буфере (с рН 6,0) - 2 раза по 5 минут, затем охлаждали при комнатной температуре не менее 15-20 минут и наносили соответствующие первичные антитела. Инкубация с первичными антителами: 30 минут при комнатной температуре, затем на ночь (14-18 часов) при 4°C. Инкубированные срезы тщательно промывали в фосфатном буфере при рН 7,4-7,6, затем наносили комплекс EnVision (anti-mouse и anti-rabbit, фирмы DAKO) и инкубировали 30-40 минут при комнатной температуре, тщательно промывали в фосфатном буфере при рН 7,4-7,6, и наносили красящий раствор диаминобензидина (ДАВ) - DAB+ фирмы DAKO, визуализирующий реакцию. Затем срезы отмывали в дистиллированной воде и докрашивали гематоксилином Майера.

Индекс пролиферации по экспрессии Ki67 и индекс p63 вычисляли как среднее количество меченых ядер на 100 опухолевых клеток (при учете опухолевых клеток). Подсчет меченых ядер проводился в репрезентативных (от фр. полях зрения с относительно равномерным распределением опухолевых клеток, сверху вниз и слева направо. Края срезов, где чаще всего наблюдается неспецифическое фоновое окрашивание, не учитывались.

Методика внутритканевого введения Реаферона. Препарат вводили по 1млн. МЕ ежедневно методом внутриочаговых иньекций, курсовая доза препарата составила 10 млн. МЕ. Использовали инсулиновый шприц с длиной иглы 8 мм., толщина иглы не более 8G. Иглу вводили на границе опухоли со здоровой кожей, срез иглы направляли вниз, при каждом последующем введении отступали на 15 минут по или против часовой стрелки.

Статистическая обработка результатов проведена по общепринятым методикам с использованием пакета анализа МS Offis XP для Windows 2002, Primer of biostatistics, version 5.0.

Результаты исследования и их обсуждение.

Среди 44 больных атипичными КА были диагностированы следующие клинические формы этой опухоли: у 12(27,3%) - стойкие, у 17(38,6%) - гигантские, у 2(4,6%) - центробежные, у 2(4,6%) – мультинодулярные, у 1(2,3%) - грибовидная, у 4(9,1%) - в форме кожного рога, у 6(13,6%) – рецидивные, в том числе один случай КА при синдроме Мюир-Торре.

КА в 95,5% случаев возникала на фоне здоровой кожи, лишь у 1 пациента развитие КА отмечалось на фоне предшествующего красного плоского лишая и у 1 - базалиомы.

Атипичные КА локализовались преимущественно на открытых участках кожного покрова -,5%), как правило, на лице (таблица 1).

Таблица 1.

Локализация атипичных кератоакантом.

локализация	лоб	Височная обл	периорбит. обл	Носогубная складка	Скат носа	Спинка носа	щеки	Околоушная обл.	спина	губы	подбородок	шея	плечо	Предплечье, кисть	бедро
Атипичная КА	Абс	3	2	3	4	3	4	3	2	2	2	3	2	3	6	2	44
%	6,8	4,6	6,8	9,1	9,1	6,8	4,6	4,6	4,6	6,8	6,8	4,6	6,8	13,6	4,6	100

Среди больных с атипичными КА было 6 пациентов с рецидивными КА. Развитию рецидива предшествовало применение деструирующих методов лечения, которые предпринимались на стадии роста КА: хирургического иссечения в щадящих пределах (с захватом 3-5 мм от края опухоли) - в 3 случаях, электрокоагуляции - в 2, криодеструкции - в 1.

Рецидивы возникали в сроки от 7 до 14 дней после удаления новообразования.

В 5 из 6 случаев рецидивные КА трансформировались в ПКР. Таким образом, частота трансформации атипичных КА в ПКР среди обследованных нами больных составила 11,4%. В 3 из 5 случаев озлокачествившиеся КА не имели клинических отличий от КА и только в 2 случаях в них отмечалось характерное для ПКР кожи изъязвление.

Из 44 наблюдаемых нами больных атипичными КА у 27 предварительно была произведена краевая диагностическая биопсия, а у 17 опухоли были удалены полностью, что позволило оценить их гистоархитектонику.

Гистологически КА характеризуется значительным гиперкератозом и бородавчато-акантотическими разрастаниями эпидермиса. На сагиттальных срезах, проходящих через центр опухоли, видно, что акантотический эпидермис окаймляет кратер, заполненный роговыми массами. Часть пролиферирующего эпидермиса по краям кратера, истончаясь, клювовидно нависает над ним, охватывая ортокератозные роговые массы в виде «воротничка». Это напоминает чашу, заполненную рогом, что является характерной особенностью кератоакантомы. Эпидермис, выстилающий дно «чаши» неравномерно разрастается, погружаясь в дерму, на некоторых участках достигая уровня потовых желез, образуя анастомозирующие тяжи и отшнурованные комплексы неправильных очертаний.

Сущностью гистологических изменений при КА является так называемая псевдокарциноматозная гиперплазия, которую трудно, а в ряде случаев невозможно, отличить от высокодифференцированного ПКР кожи, в особенности если гистологический срез прошел через край опухоли, а не через ее центр, как обычно бывает в диагностических биоптатах.

В целях объективизации проведения дифференциальной гистологической диагностики КА и ПКР кожи мы провели в этих опухолях сравнительный анализ выраженности и диагностической информативности 19 патоморфологических признаков: клеточного полиморфизма, атипии ядер, инвазии акантотических тяжей и отшнурованных эпидермальных комплексов, частоты митозов, наличия патологических митозов, наличия зоны дисплазии эпидермиса по периферии опухоли, выраженности рогового кратера («чаши»), формирования и распада роговых жемчужин, ороговения отдельных клеток, наличия апоптотических телец, выраженности имунно-воспалительного инфильтрата в дерме и его состава (эозинофилы, плазматические клетки, лимфоциты, сегментоядерные лейкоциты), инфильтрации лейкоцитами эпидермальных комплексов, акантолиза, очагов некроза.

Оценку выраженности признака проводили полуколичественным методом [+, ++, +++]. Митотическую активность определяли по количеству фигур митоза на 10 репрезентативных полей зрения (РПЗ) с большим увеличением (х400). Количество митозов < 10 на 10 РПЗ оценивали как [+], >10 и < 20 как [++] и >20 как [+++]. Частоту патологических митозов выражали в % к общему числу учтенных митозов: < 10% -[+], < 30% - [++], 30% и более - [+++] (табл.2).

Таблица № 2.

Сравнительная оценка ряда патоморфологических признаков в атипичных кератоакантомах и плоскоклеточном раке кожи.

Форма (тип) опухоли Признак	Атипичная кератоакантома п=44	Плоскоклеточный рак кожи n=20
Общее число положи тельно оцененных случаев	Выраженность патоморфологического признака среди положительно оцененных случаев	Общее число положи тельно оцененных случаев	Выраженность патоморфологического признака среди положительно оцененных случаев
+	++	+++	+	++	+++
Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%	Абс	%
Клеточный полиморфизм	34	77,3	18	40,9	14	31,8	2	4,5	19	95	5	25	12	60	2	10
Атипия ядер	35	79,5	19	43,2	14	31,8	2	4,5	19	95	5	25	12	60	2	10
Митотическая активность	25	56,8	17	38,6	6	13,6	3	6,8	17	85	7	35	4	20	6	30
Патологические митозы	18	40,9*	13	29,5	3	6,8	2	4,5	14	70	6	30	6	30	2	10
Инвазия акантотических тяжей	37	84,1	14	31,8	14	31,8	9	20,5	20	100	6	30	8	40	6	30
Формирование роговых жемчужин	34	77,3	23	52,3	5	11,4	6	13,6	16	80	5	25	7	35	4	20
Распад роговых жемчужин	9	20,5*	4	9,1	2	4,5	3	6,3	14	70	12	60	2	10	-	0
Ороговение отдельных клеток	23	52,3	19	43,2	4	9,1	-	0	14	70	4	20	8	40	2	10
Наличие апоптотических телец	41	93,2	7	15,9	16	36,4	18	41	16	80	2	10	8	40	6	30
иммунно-воспалительный инфильтрат	42	95,5	26	59,1	3	6,8	13	29	20	100	6	30	6	30	8	40
Инфильтрация лейкоцитами эпидермальных комплексов	28	63,6	9	20,5	8	18,2	11	25	15	75	9	45	4	20	2	10
Зона дисплазии эпидермиса по периферии	4	9,1	4	9,1	-	0	-	0	4	20	2	10	2	10	-	0
Акантолиз	7	15,9*	7	15,9	-	0	-	0	6	30	6	30	-	0	-	0
Некроз опухолевых комплексов	-	0*	-	0	-	0	-	0	3	15	3	15	-	0	-	0

* - статистически достоверное отличие между группами (p<0,05)