Биологические аспекты совершенствования крупного рогатого скота в условиях Таджикистана (стр. 1 )

на правах рукописи

АМИРШОЕВ Файзулло Сафарович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В УСЛОВИЯХ ТАДЖИКИСТАНА

03.02.07 – Генетика

03.03.01 – Физиология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Дубровицы - 2012

Диссертационная работа выполнена на кафедре разведения и генетики сельскохозяйственных животных Таджикского аграрного университета им. Шириншоха Шохтемура и в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Научные консультанты:	Багиров Вугар Алинияз оглы доктор биологических наук, член-корреспондент Россельхозакадемии Рахимов Шарофжон Тохирович доктор сельскохозяйственных наук, Таджикского НИИ животноводства , заведующий лабораторией воспроизводства и биотехнологии сельскохозяйственных животных
Официальные оппоненты:	Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич доктор биологических наук, профессор, по племенной работе, начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы
	доктор биологических наук, профессор, Всероссийский НИИ племенного дела, заведующий отделом биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных
	доктор биологических наук, ГНУ Всероссийский НИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных, ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярной цитогенетики
Ведущая организация:	ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени академика

Защита состоится "25" декабря 2012 года, в 10 часов, на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института:142132. Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, тел./www. *****.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан "_____" ________________ 2012 г.

Ученый секретарь Совета Д 006.013.03

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время биологическая наука располагает фундаментальными и прикладными знаниями, обеспечивающими значительное повышение эффективности селекционной работы за счет реализации генетического потенциала высокоценных животных [ и др., 2008]. Возможность длительного хранения в замороженном состоянии семени и эмбрионов от особо ценных в племенном отношении животных, позволят радикально ускорить генетический прогресс, в частности, в молочном скотоводстве [, , 2004; и др. 2010].

Однако современные достижения в повышении эффективности селекционно-племенной работы могут быть реализованы лишь при достаточном уровне воспроизводства в стадах. Созданию надлежащей племенной базы в Таджикистане, препятствует, прежде всего, низкий уровень воспроизводства, ведь необходимо получение потомства в количестве, по крайне мере, обеспечивающем ремонт маточного стада [, 1986; 1986].

Современное состояние животноводства Республики Таджикистан выдвигает на первый план поиск путей обеспечивающих рациональное использование имеющегося генетического потенциала и улучшение племенных и продуктивных качеств разводимого скота. Острота проблемы усугубляется ростом населения страны, с одной стороны, и относительно низкими показателями уровня продуктивности крупного рогатого скота, с другой. В республике на душу населения производится 10-12 кг мяса и 60-70 кг молока в год, что значительно ниже медицинских норм питания [, 1984; , 1987].

Генетический прогресс пород невозможен без контроля достоверности происхождения животных, который во всем мире преимущественно осуществляется с использованием в качестве базового приема метода ПЦР анализа микросателлитных маркеров [, , 2011].

В последние 20 лет комплексные исследования, предусматривающие улучшения племенных и продуктивных качеств разводимого скота с точки зрения генетики, биотехнологии и физиологии, не проводились, хотя за этот период в мировом животноводстве произошел существенный прогресс.

В связи с чем, назрела настоятельная необходимость проведения комплексных исследований, направленных повышение эффективности использования генетических, биотехнологических и физиологических методов, и разработка на их основе научно-обоснованной системы совершенствования продуктивности молочного скота современного Таджикистана.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилась разработка генетических и физиологических методов повышения продуктивности молочного скота в условиях Республики Таджикистан.

В связи с этим решали следующие задачи:

-изучить генетические, средовые факторы, влияющие на продуктивность коров черно-пестрой породы и таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота;

-изучить влияние различных генотипических и паратипических факторов на репродуктивные качества быков-производителей в Таджикистане;

-изучить с использованием ДНК-маркеров аллелофонд разводимого на территории республики Таджикистан крупного рогатого скота;

-на основе анализа аллельных профилей дать оценку
генетических особенностей молочного скота в Республике Таджикистан;

-провести анализ популяционно-генетических параметров по микросателлитам;

-провести цитогенетическую оценку молочного скота, разводимого в Таджикистане;

-выявить эффективность применения профилактических приемов повышения воспроизводительной способности коров и телок;

-определить рациональные приемы использования гормональных и витаминных препаратов в регулировании полового цикла и повышении оплодотворяемости коров и телок;

-изучить состояние генетического материала в сперматозоидах быков-производителей, используемых в республике Таджикистан;

-определить оплодотворяющую способность семени быков, в зависимости от влияния различных генотипических и паратипических факторов;

Научная новизна работы. Впервые с использованием ДНК-технологии проведена сравнительная характеристика молочного скота, разводимого в Республике Таджикистан. Изучены генетические связи между популяциями скота, разводимого на территории Таджикистана.

Впервые в условиях Республики Таджикистан для молочного скота черно-пестрой породы и таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота разработаны генетико-физиологические методы улучшения продуктивности. Изучено влияние генетических и средовых факторов на продуктивные качества молочных коров. Установлено влияние различных генотипических и паратипических факторов на репродуктивные качества быков-производителей. Дана цитогенетическая характеристика молочного скота, разводимого в республике Таджикистан. Разработаны биологические методы повышения продуктивных качеств молочного скота в условиях Таджикистана.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований являются теоретическим обоснованием современных программ разведения молочного скота в условиях Таджикистана, с учетом влияния различных генетических и физиологических факторов на повышение продуктивности.

Дана генетическая характеристика молочного скота разводимого в республике Таджикистан с использованием ДНК-технологий, цитологического и цитогенетического анализа. Разработаны методы, позволяющие мультитиражировать высокоценные генотипы и ускорить селекционный процесс в молочном скотоводстве Таджикистана. Применение ДНК-технологий позволяет управлять племенной работой. Изучение состояния генетического материала у быков-производителей, используемых в Таджикистане, способствует улучшению репродуктивных показателей скота.

Результаты исследований включены в республиканские комплексные научные программы ТАУ им. Шириншох Шохтемур «Пути повышения и создание новых высокопродуктивных пород сельскохозяйственных животных», рег. № ТД , гг., «Усовершенствование, и повышение продуктивности сельскохозяйственных животных, птиц и рыб», рег. № ТД 05 81, гг., а также широко применяются в молочном скотоводстве республики. Основные положения диссертации включены в концепцию развития животноводства в Республике Таджикистан.

Основные положения, выносимые на защиту:

-на основе ДНК-технологии дана сравнительная характеристика молочного скота, разводимого в Республике Таджикистан;

-изучены генетические связи между популяциями скота, разводимого на территории Таджикистана;

-на основе анализа аллельных профилей дана оценка генетических особенностей молочного скота Республики Таджикистан;

-изучено состояние генетического материала в сперматозоидах быков-производителей, используемых в Республике Таджикистан;

-разработаны генетико-физиологические методы улучшения продуктивности молочного скота;

-изучено влияние генетических и физиологических факторов на продуктивные качества молочных коров;

-дана цитогенетическая характеристика молочного скота разводимого в Республике Таджикистан;

-разработаны биологические методы повышения продуктивных качеств молочного скота в условиях Таджикистана;

-разработаны методы мультитиражирования высокоценных генотипов, позволяющие ускорить селекционный процесс в молочном скотоводстве Таджикистана;

-изучены средовые факторы, влияющие на продуктивность коров черно-пестрой породы и таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота;

Апробация работы. Результаты работы доложены и получили положительные оценки:

-на ежегодных заседаниях кафедры разведения и генетики сельскохозяйственных животных Таджикского аграрного университета ();

-на заседаниях Ученого Совета зооинженерного факультета ТАУ (1;

-на научно-практической конференции молодых ученых Таджикского аграрного университета, Душанбе (1999);

-на научно-практической конференции по актуальным проблемам развития агропромышленного комплекса Республики Таджикистан, Душанбе (2000);

-на международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию со дня рождения д. с.-х. н., профессора, заслуженного работника сельского хозяйства Кыргызской Республики , Бишкек (2004);

-на международной конференции «Пути повышения устойчивого развития сельского хозяйства» Таджикского аграрного университета (2008);

-на республиканской конференции Академии сельскохозяйственных наук Республики Таджикистан в честь «20-летие ТАСХН»– Душанбе – 2011;

-на научно-практической конференции «Практическое использование современных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота» - Быково-2011;

-на международной научной молодежной конференции-школе «Биотехнологии в сельском хозяйстве: современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных, БиоТехЖ-2012»-Дубровицы-2012;

-на заседании Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии (март 2012 г.).

Публикации результатов исследования. Всего опубликовано 42 научные работы, в том числе по материалам диссертации 40 работ, из них 20 – в журналах входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК (Теоретический и научно-практический журнал «Кишоварз» / Земледелец, Таджикского аграрного университета, «Доклады Таджикской Академии сельскохозяйственных наук», «Вестник Таджикского национального университета», «Достижения науки и техники АПК», «Проблемы биологии продуктивных животных», «Вестник Казанского государственного аграрного университета») и патент №TJ 167 Республики Таджикистан.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 257 страницах, содержит 61 таблиц, 42 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и библиографический список, который включает 382 цитируемых источника, из них 168 - на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнены в период гг. на телках и коровах черно-пестрой породы и таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота совхоза «Гулистон» Вахдатского района, «Яван-2» Яванского района, кооперативного производства «Ватан» и им. Латифа Муродова Гиссарского района и на быках-производителях этих же генотипов центральной государственной племенной станции искусственного осеменения сельскохозяйственных животных Рудакинского района и на животных Республиканского центра биотехнологии скота Института животноводства Таджикской академии сельскохозяйственных наук и в лабораториях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Для опытов были сформированы группы коров и телок таджикского заводского типа черно-пестрой породы, таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота первого и второго поколения, швицской породы и местного зебувидного скота по принципу аналогов с учетом возраста, живой массы, физиологического состояния организма. Отбор быков-производителей таджикского заводского типа черно-пестрой породы и таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота, проводили с учетом их породной принадлежности и по биологической полноценности сперматозоидов.

Материалом для молекулярно-генетических исследований служили пробы ткани (ушной выщип) крупного рогатого скота, разводимого в Хатлонской области Таджикистана, в количестве 129 голов, в т. ч. таджикского типа черно-пестрой (ЧП_ТДЖ, n=14) и швицкой пород (ШВ_ТДЖ, n=14) из ОПХ Центра биотехнологии Таджикского НИИ животноводства, местного зебувидного скота крестьянских хозяйств (МЗС, n=20), а так же помесей 1-го поколения от скрещивания животных Таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота со швицкими быками (F1, n=48) и помесей 2-го поколения от скрещивания животных F1 с быками Таджикского внутрипородного типа швицезебувидного скота (F2, n=33), принадлежащих ПЗ «им. Бегова». Выделение ДНК проводили с помощью набора реагентов для выделения ДНК DIAtomTM DNA Prep100 ( Изоген» Россия). Анализ ДНК и постановку ПЦР проводили согласно «Методическим рекомендациям по использованию метода полимеразной цепной реакции в животноводстве» [ и др., 1998]. с использованием методических разработок Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии. Набор маркеров для анализа состоял из 11 микросателлитов - TGLA126, TGLA122, TGLA227, ILST005, ILST006, ETH185, ETH10, ETH225, BM1818, BM2113 и BM1824. Фрагменты амплификации идентифицировали на генетическом анализаторе ABI Prism 3130xl («Applied Biosystems», США).

Рис. 1. Схема опыта

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам [ 1995] с использованием программного обеспечения GENALEX 6 [Peakall, R., Smouse P. E., 2006] и PAST.

Для проведения цитогенетических и тонких микроскопических исследований использовали микроскоп, оборудованный цифровой камерой и программным обеспечением Image Scope (Производитель для микроскопии и анализа», г. Москва).

Материалом для цитогенетического анализа служили лимфоциты периферической крови, полученные стерильно из яремной вены. В качестве митогена использовали коноковалин А (ПанЭко, Москва).

Степень фрагментации ДНК в хроматине определяли с использованием акридин-оранжевого теста. Акридин оранжевый (АО) является одним из наиболее эффективных, и менее токсичных метахроматических красителей. При окраске этим красителем под действием ультрафиолета при длине волны 530 нм, сперматозоиды с фрагментированной (одноцепочечной) ДНК флюоресцируют в красной области спектра, а с нормальной (двухцепочечной) молекулой ДНК в зеленой.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам, применяя программное обеспечение MS Excel, MSA_WIN v. 2.65, GenAlEx 6.0, Phylip.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Генетический потенциал молочного скота в Республике Таджикистана

При оценке генетического потенциала крупного рогатого скота в республике нами проанализирована структура и продуктивность молочного скота (таб.1).

Таблица 1

Динамика численности крупного рогатого скота и структура стада в период гг. в Республике Таджикистан

Показатели	Годы
1990	1995	2000	2005	2010
Численность КРС, тыс. голов	1349,2	1147,4	1057,9	1371,9	1837,7
в т. ч. коров, тыс. голов	538,6	532,0	523,6	719,7	950,8
%, от общего поголовья	39,9	46,4	49,5	52,5	51,7
Средний годовой удой на корову, кг	2404	1801	1164	1603	1428

Как показывают данные таблицы 1, произошедшие изменения в обществе (поэтапное формирование акционерных, фермерских, дехканских хозяйств и др.) оказали отрицательное влияние на поголовье скота. Численность животных в периоды 1995 и 2000 гг. снизилась по сравнению с 1990 годом на 15,0 и 27,5%, а в период с 2005 по 2010 гг., поголовье крупного рогатого скота увеличилось на 36,2%, не смотря на увеличение поголовья животных, уровень молочной продукции стал на 976 кг меньше чем в 1990 г.

Рис. 2. Выход телят на 100 коров по годам

Данные рисунка 2 показывают, что за последние 20 лет произошло существенные снижение выхода телят. В среднем по республике он оказался на уровне, не обеспечивающем ремонта стада – 58 телят на 100 коров соответственно (29 телочек на 100 коров и это только при рождении).

3.2. Молекулярно-генетическая характеристика молочного скота, разводимого в Таджикистане.

Аллелофонд крупного рогатого скота Республики Таджикистан, исследованный с помощью 11 микросателлитами, совокупно представлен 108 аллелями с вариациями от 62 у черно-пестрой породы крупного рогатого скота до 91 аллеля у F1. Число аллелей в отдельных локусах МС варьировало от 6 до 14 в локусе TGLA227 и от 2 до 11 в локусе TGLA122. У швицкого скота, F2 швицезебувидного и местного зебувидного скота идентифицировано 67, 78 и 85 аллелей, соответственно. В среднем в исследованных породах выявлено в общей сложности 76,6 аллеля, что составляет 6,96±0,31 аллеля на микросателлитный локус. Анализ полученных ДНК-профилей крупного рогатого скота выявил существенно меньшее генетическое разнообразие таджикских популяций черно-пестрой и швицкой пород (рис. 3).

А) Число аллелей	Б) Уровни гетерозиготности

Рис. 3.Число выявленных аллелей и уровень гетерозиготности в изученных таджикских популяциях крупного рогатого скота

Примечание: ось Х – исследуемые популяции скота (ШВ_ТДЖ – швицкая порода, ЧП_ТДЖ – черно-пестрая порода, МЗС – местный зебувидный скот, F1, F2 – швицезебувидный скот); (А) ось Y – число аллелей, Na – среднее число аллелей, Na Freq.>=5% – число информативных аллелей с частотой встречаемости ≥5%, Ne – число эффективных аллелей; (Б) осьY – уровень гетерозиготности, Но – наблюдаемая гетерозиготность, Не – ожидаемая гетерозиготность, UНе – объективно ожидаемый уровень гетерозиготности.

Среднее число аллелей в микросателлитном локусе варьировало от 8,27±0,84 в F1 до 5,64±0,47 черно-пестрой породы, местный зебувидный скот, являвшийся материнской основой при создании таджикского типа зебувидного скота, отличался высоким генетическим разнообразием, которое выражалось в высоком числе информативных и эффективных аллелей: 7,23±0,68 и 4,95±0,50, соответственно. Животные F2, являющиеся основным массивом для создания современного высокопродуктивного молочного типа швицезебувидного скота, занимают промежуточное положение по Na и Ne: 7,09±0,67 и 3,72±0,45, соответственно (рис.3А). Все используемые в исследовании микросателлиты оказались на 100% полиморфными.

У местного зебувидного и швицкого скота было выявлено достоверное отклонение от генетического равновесия по 4 из 11 микросателлитных локусов, у черно-пестрой породы - по 2 из 11 локусов, в то время как в F1 и F2 выявлено достоверное смещение равновесия, соответственно, в 9 и 7 локусах. Отклонение от равновесия следует рассматривать как указание на возможную инбридированность популяций, обусловленную, по всей видимости, использованием ограниченного числа производителей и групповой технологией разведения.

Анализ гетерозиготности изучаемых популяций скота показал (рис. 3Б), что уровень наблюдаемой гетерозиготности (Ho) варьировал от 0,602 в черно-пестрой породы до 0,681, в местный зебувидный скот, при этом уровень ожидаемой гетерозиготности (He) составил 0,648-0,771, что сопоставимо с данными, полученными при исследовании пород и популяций крупного рогатого скота, разводимого в Российской Федерации: 0,631-0,846.

Анализ данных наблюдаемой и ожидаемой степеней гетерозиготности показал, что во всех изучаемых группах скота отмечался дефицит гетерозигот (рис. 3Б), который был минимальным в популяциях черно-пестрой породы (4,63%) и швицкой породы (4,64%) и максимальным - в популяции F1 (12,26%). В популяции местный зебувидный скот дефицит гетерозигот составил 8,95%. О дефиците гетерозиготных генотипов свидетельствуют также положительные значения индекса фиксации - Fis, которые варьировали от 5,7% в швицкий пород до 16,5% в F1.

Установлено, что максимальное число приватных аллелей - 5 и 4 было идентифицировано в популяциях черно-пестрой породы и местный зебувидный скот, соответственно (рис. 4). При этом максимальная частота встречаемости установлена для трех аллелей: 307 локуса ILST006 и 222 локуса ETH185 в популяции черно-пестрой породы и 225 локуса ETH10 в популяции местный зебувидный скот. Данный факт указывает на генетическую уникальность таджикских популяций черно-пестрого скота и зебувидного скота.

Рис. 4. Приватные аллели, выявленные в исследованных популяциях крупного рогатого скота

Примечание: ось Х – частоты встречаемости аллелей, ось Y –популяции скота.

Расчет значений Rst (AMOVA) показал, что доля межпопуляционной изменчивости в общей изменчивости по МС составляет 22,9%, в то время как на внутрипопуляционную изменчивость между и внутри индивидуумами приходится, соответственно, 75,8 и 1,3%. Таким образом, географическая общность региона разведения изучаемых пород и популяций крупного рогатого скота и является ведущим фактором в формировании генетического разнообразия скота Республики Таджикистан. (таб.2).

Табл. 2.

Информативные показатели панели из 11 микросателлитов (МС)

Показатели	Крупный рогатый скот Республики Таджикистан
ЧП_ТДЖ	ШВ_ТДЖ	МЗС	F1	F2
PI	7,42*10-10	2,51*10-11	3,05*10-13	8,50*10-14	1,16*10-10
PX1	99,88	99,67	99,99	99,99	99,94
PX2	97,71	98,99	99,77	99,86	98,59
PX3	99,999	99,999	100	100	99,999

Оценка информативности панели из 11 микросателлитов для проведения генетической экспертизы происхождения в таджикских популяциях скота показала (табл.2), что вероятность совпадения генотипов (PI) в исследованном массиве скота по всем группам животных была менее 1*10-10. Точность подтверждения происхождения по обоим (PX1) и одному (PX2) родителю была выше 97,7%, а точность исключения родителей не ниже 99,999%, что говорит об исключительной информативности данного подхода ДНК анализа достоверности происхождения животных и функциональной емкости используемой панели микросателлитов.