Последствия воздействий ионизирующих излучений: цитогенетические изменения в лимфоцитах крови человека (стр. 4 )

a - значения, достоверно отличающиеся от аналогичных показателей в группе ликвидаторов, работавших в Чернобыле в гг., р<0,05, t - критерий Стьюдента.

Таким образом, подводя итоги многолетнего изучения цитогенетических эффектов у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС, необходимо отметить, что на протяжении всего периода наблюдения средняя частота хромосомных аберраций в группах ликвидаторов, работавших в зоне аварии в 1986 – 1989 гг., превышает контрольный уровень. Со временем после облучения наблюдается постепенное снижение частоты ацентрических фрагментов и аберраций хроматидного типа. При этом частота дицентриков и центрических колец – маркеров радиационного воздействия - фактически не изменяется и превышает аналогичный показатель в контрольной группе в 3,5 – 5 раз в зависимости от сроков работы и длительности нахождения в зоне аварии. Частота транслокаций, исследованная с помощью FISH метода, также превышает контрольный уровень (в 1,5 – 3 раза) и зависит от продолжительности работы в зоне аварии.

Не обнаружено связи частоты дицентриков и центрических колец, а также частоты транслокаций с величиной дозы, официально зарегистрированной в документах ликвидаторов.

Результаты цитогенетического обследования свидетельствуют, что более надежными показателями при анализе последствий облучения ликвидаторов являются дата въезда в зону радиоактивного загрязнения или, иными словами, год работы в Чернобыле и продолжительность проведения восстановительных работ.

3. Применение цитогенетических показателей крови для биологической индикации и дозиметрии ионизирующего излучения

3.1. Анализ зависимостей «доза-эффект» при воздействии гамма - и бета-излучения и построение калибровочных кривых для частоты дицентриков и транслокаций

3.1.1. Гамма-излучение. Зависимость «доза-эффект» для гамма-излучения 60Co исследована при двух режимах облучения образцов крови – при мощности дозы 0,1 Гр/мин и 0,47 Гр/мин. Для построения калибровочной кривой выбраны дозы в диапазоне от 0 до 4 Гр.

С целью построения максимально адекватной калибровочной кривой «доза-эффект» проанализированы результаты цитогенетического исследования для пяти (облучение с мощностью дозы 0,1 Гр/мин) и трех (облучение с мощностью дозы 0,47 Гр/мин) доноров. При обоих режимах облучения данные, полученные для разных доноров, после предварительной проверки на однородность были объединены. Всего проанализировано 55007 метафаз, т. е. около 5000 клеток на каждую точку кривой при облучении образцов крови с мощностью дозы 0,1 Гр/мин и 10510 метафаз, т. е. около 1500 клеток на каждую точку кривой при облучении образцов крови с мощностью дозы 0,47 Гр/мин.

Регрессионные уравнения, описывающие дозовую зависимость, вычислены с помощью метода наименьших квадратов с весами, величины которых обратно пропорциональны дисперсиям частот хромосомных аберраций. Установлено, что наиболее значимым для оценки дозы показателем является частота дицентриков и центрических колец (р=6 ´ 10-14 при облучении с мощностью дозы 0,1 Гр/мин и р=3 ´ 10-11 при облучении с мощность дозы 0,47 Гр/мин). Дозовые зависимости для этого показателя лучше всего описываются линейно-квадратичным уравнением. Сравнение двух дозовых зависимостей, полученных при разных режимах облучения образцов крови, не выявило существенных различий (рис. 13). Значения линейных и линейно-квадратичных коэффициентов практически не отличаются или отличаются в пределах ошибки (р>0,05).

Таким образом, результаты экспериментального исследования позволяют констатировать, что мощность дозы в исследуемом диапазоне не оказывает влияния на частоту хромосомных аберраций.

В дальнейшем для реконструкции доз по частоте дицентриков применяли калибровочные кривые «доза-эффект», полученные при облучении образцов крови гамма-излучением с мощностью дозы 0,1 Гр/мин. Соответствующая регрессионная зависимость, имеет вид:

y = 0,1 + 1,5 D +6,3 D2 , где

y - частота аберраций на 100 клеток, D - доза облучения. Значимость модели: р=6´10-14.

Рис. 13. Зависимость «доза-эффект» для частоты дицентриков и центрических колец при двух режимах облучения.

Дозовая зависимость для частоты стабильных хромосомных аберраций - транслокаций при облучении образцов крови гамма-излучением с мощностью дозы 0,1 Гр/мин получена с помощью FISH метода. Всего проанализировано 21087 метафаз, т. е. в среднем 2636 метафаз на каждую точку кривой. При построении калибровочной кривой учитывали суммарное значение реципрокных и нереципрокных транслокаций. Соответствующая регрессионная зависимость имеет вид:

y = 0,24 + 0,70 D +0,14 D2, где

y - частота транслокаций с участием хромосом 1, 4 и 12 на 100 клеток, D - доза облучения. Значимость модели: р=6,3х10-4.

Известно, что клетки с нестабильными хромосомными аберрациями (дицентриками и центрическими кольцами) постепенно элиминируют из циркулирующей крови в силу особенностей структурной организации, что и является основной причиной, не позволяющей использовать их для ретроспективной дозиметрии. При анализе стабильных хромосомных аберраций – транслокаций, с увеличением дозы радиационного воздействия повышается вероятность появления клеток, содержащих как стабильные, так и нестабильные хромосомные аберрации. Элиминация таких клеток в пострадиационном периоде может привести к тому, что доза, рассчитанная по частоте транслокаций, будет недооценена. Поэтому очень важно иметь достоверную информацию том, в каком диапазоне доз можно применять анализ стабильных хромосомных аберраций для ретроспективной дозиметрии, не вводя поправку на снижение частоты нестабильных клеток, в которых могут содержаться транслокации. Анализ частоты клеток только со стабильными хромосомными аберрациями показал, что только в диапазоне доз до 2 Гр можно проводить ретроспективную оценку уровня облучения по частоте транслокаций, не учитывая процессы элиминации (рис. 14).

Рис. 14. Зависимость «доза-эффект» для частоты транслокаций.

Анализ частоты дицентриков и центрических колец, проведенный с помощью FISH метода после облучения образцов крови гамма-излучением (мощность дозы 0,1 Гр/мин) показал, что зависимость «доза-эффект» очень близка к полученной при применении классического цитогенетического метода (рис. 15). Различия между показателями статистически недостоверны. Этот, несомненно, важный результат является подтверждением корректности формулы, предложенной (Lucas et al., 1993) для пересчета частоты транслокаций с участием окрашенных хромосом на весь геном.

Рис. 15. Дозовая зависимость для частоты дицентриков и центрических колец (FISH метод). Сплошной линией обозначена калибровочная кривая для частоты дицентриков и центрических колец, полученная с помощью классического метода.

3.1.2. Бета-излучение оксида трития (НТО). Зависимость «доза-эффект» после воздействия бета-излучения НТО изучена при двух режимах облучения – при постоянном времени облучения - 24 ч (мощность дозы изменялась от 0,042 до 1,03 мГр/мин) и при постоянной мощности дозы бета-излучения НТО - 0,522 мГр/мин (время облучения варьировало от 1,6 до 48 ч) в диапазоне доз от 0,05 до 1,5 Гр.

На основании результатов цитогенетического анализа (посчитано 15329 клеток, в среднем по 2000 клеток на точку) с помощью метода наименьших квадратов с весами получены уравнения регрессии, описывающие дозовую зависимость при двух режимах облучения. Результаты экспериментального исследования показали, что при пролонгированном радиационном воздействии в течение 24 ч с низкой мощностью доз, варьирующей от 0,042 до 1,03 мГр/мин, дозовая зависимость частоты дицентриков и центрических колец лучше всего соответствует линейной модели регрессии (у=0,21+10,76D, р=4х10-6). При облучении с постоянной мощностью дозы 0,522 мГр/мин при разном времени радиационного воздействия (от 1,6 до 48 ч) дозовая зависимость имеет линейно-квадратичный вид (у=0,07+4,47D+9,03D2 , р=2x10-6).

Анализ экспериментальных данных показал, что дозовые зависимости для обоих режимов облучения в диапазоне до 1 Гр практически одинаковые. И только при дальнейшем увеличении дозы наблюдаются различия. При облучении образцов крови с постоянной мощностью дозы - 0,522 мГр/мин в течение 48 ч резко возрастает частота хромосомных аберраций. По-видимому, в исследуемом диапазоне мощностей доз (0,522 – 1,03 мГр/мин) определяющим фактором могло быть время радиационного воздействия, отличающееся в 2 раза (48 и 24 ч, соответственно), и которое в совокупности с особенностями биологического действия бета-излучения трития, привело к наблюдаемому эффекту.

3.2. Относительная биологическая эффективность излучений разного качества.

Для количественной оценки биологического действия разных по качеству ионизирующих излучений определяют коэффициенты относительной биологической эффективности (ОБЭ). Численные значения ОБЭ не только представляют самостоятельный интерес для радиобиологии, определяя степень опасности излучения, но и служат основанием для оценки весового множителя излучений (Wr), который является поправочным коэффициентом при определении качества излучения и необходим для преобразования поглощенной дозы (Гр) в эквивалентную (Зв) (МКРЗ, публикация 60, 1990).

3.2.1. Оценка относительной биологической эффективности бета-излучения НТО in vitro. Определение коэффициента ОБЭ бета-излучения НТО проводили, сравнивая частоту дицентриков и центрических колец с данными, полученными при облучении in vitro гамма-излучением 60Co с мощностью дозы 0,1 Гр/мин:

.

Отсюда:

Максимальное значение коэффициента ОБЭ трития, равное 2,2 , было получено при дозе 0,03 Гр. При увеличении дозы значение коэффициента ОБЭ плавно снижается, приближаясь к величине 1,2 при дозе в 1 Гр.

Причины более высокой эффективности бета-излучения трития обусловлены в первую очередь особенностями его биологического действия. Известно, что из-за низкой энергии и малого пробега бета-частиц трития средняя плотность ионизации значительно возрастает, что может приводить к повышению дозы на порядок (Pinson et al., 1980). Важным фактором является включение тритиевой воды в гидратированные оболочки ДНК, что приводит к дополнительным повреждениям молекул ДНК и, соответственно, увеличению реальной поглощенной дозы (Mathur-de Vre, Binet, 1984; Baumgartner, 2002). Также важно учитывать, что при радиационном распаде трития проявляется трансмутационный эффект – превращение атома трития в атом гелия, что реализуется в более выраженной деструкции генетических структур (например, замена пар оснований) и может проявляться в виде точечных мутаций. Возникновение таких точечных повреждений в молекуле ДНК трудно обнаруживается системой репарации, что постепенно приводит к накоплению дефектов молекулярной структуре и, как следствие, потери генетической информации. Показано, что эффект трансмутации может значительно превосходить эффект ионизации (Грачева, Королев, 1977; Commerford, 1984 Balonov et al., 1984).

Наиболее важная с практической точки зрения информация о значениях ОБЭ бета-излучения трития касается области малых доз. Увеличение ОБЭ при действии низких доз может быть связано как с нарушением взаимоотношений между основными системами клетки, ответственными за реализацию радиационных повреждений, так и с повышением продукции активных форм кислорода, губительно влияющих на структуры клеток (Федоренко, 2006). При малых дозах излучения степень повреждения клеток за счет образования свободных радикалов на единицу поглощенной дозы значительно возрастает по сравнению с областью высоких доз.

3.2.2. Оценка ОБЭ бета-излучения трития и космического излучения in vivo. Для определения ОБЭ бета-излучения трития и космического излучения был проведен сравнительный анализ результатов цитогенетического обследования профессионалов г. Сарова и космонавтов, имевших близкие значения частот стабильных хромосомных аберраций (транслокаций). У этих людей, подвергавшихся радиационному воздействию в процессе профессиональной деятельности, имеется достаточно надежная информация о дозе, полученная с помощью физических и расчетных методов дозиметрии.

Значение коэффициента, характеризующего ОБЭ бета-излучения трития и космического излучения по сравнению с гамма-излучением, определяли как отношение средних равноэффективных доз, индуцирующих одинаковую частоту транслокаций (табл. 8). Значение коэффициента ОБЭ для бета-излучения трития составило 2,5 при средней дозе бета-излучения НТО 157 мЗв. Эта величина несколько превышает значение ОБЭ трития, полученное в экспериментальной части работы. Однако представленные результаты позволяют с уверенностью говорить о большей эффективности бета-излучения трития по сравнению с гамма-излучением, особенно в области малых доз.

В группе космонавтов дозы, вызывающие эффект, близкий наблюдаемому в группе профессионалов, подвергавшихся действию гамма-излучения, в 1,9 раз ниже. Это значение вполне реально и не противоречит данным, представленным в работ по экспериментальной оценке ОБЭ космического излучения (Методические указания, 1991; Ballarin, Ottolenghi, 2005; Петров и др., 2007). Полученные данные являются наглядным подтверждением более высокой ОБЭ космического излучения, обусловленной входящими в его состав тяжелыми ионами высокой энергии.

Таблица 8

Средние значения коэффициентов ОБЭ бета-излучения трития и космического излучения, рассчитанные по частоте транслокаций in vivo

Группы	Доза, мЗв	Частота транслокаций на 100 кл. ± m	Коэффициент ОБЭ
Профессионалы, бета-излучение	157	1,94± 0,50	2,5
Космонавты	203	1,84±0,61	1,9
Профессионалы, гамма-излучение	386	1,77±0,71	-

Оценка ОБЭ космического излучения и бета-излучения трития проведена непосредственно по реакции организма, с учетом его индивидуальных особенностей. Естественно, эти результаты нельзя считать бесспорными. Однако такой подход, на наш взгляд, позволяет реально оценить степень опасности разных видов ионизирующего излучения и может быть полезен при разработке рекомендаций по обеспечению радиационной безопасности лиц, профессионально контактирующих с источниками облучения.

3.3. Реконструкция доз ионизирующего излучения по частоте хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови (биологическая дозиметрия)

Для оценки и прогноза последствий облучения в первую очередь важно иметь достоверную информацию о дозе радиационного воздействия. Одним из возможных подходов в случае отсутствия или ограничения данных физической дозиметрии является оценка доз с помощью цитогенетических методов (WHO, 1976; IAEA, 1986, 2001; UNSCEAR, 1986). Располагая результатами цитогенетического обследования людей, подвергшихся облучению в результате аварийных и чрезвычайных ситуаций, нам представлялось вполне обоснованным применить их для оценки доз, используя калибровочные кривые, полученные в настоящей работе. Принимая во внимание, что все обследованные лица подвергались пролонгированному или хроническому облучению в течение длительного времени, для определения доз использовали только линейную компоненту уравнения регрессии: у= с+αD (Obe, 2007).

3.3.1. Космонавты. Только для космонавтов была возможность оценить дозы по частоте нестабильных хромосомных аберраций, т. к. цитогенетический анализ проводился сразу после окончания КП. По частоте дицентриков были рассчитаны дозы, полученные космонавтами за время первого КП (табл. 9).

Необходимо отметить, что полученные значения доз рассчитаны без учета реальных условий облучения в космосе, а именно, без учета ОБЭ космического излучения, а также величины мощности дозы. Несмотря на это, данные биологической дозиметрии свидетельствуют о более значительном воздействии космического излучения на организм космонавтов, чем это следует из данных физической дозиметрии. Причем в случае краткосрочных полетов различия между биологическими и физическими дозами достигают значений 17 – 26, в то время как в случае длительных полетов эта величина составляет всего 3 – 4. Одним из объяснений данного факта может быть длительное (около полугода) пролонгированное облучение, во время которого в циркулирующей крови космонавтов во время КП протекают одновременно два противоположных процесса – образование хромосомных аберраций под воздействием радиации и элиминация клеток с нестабильными хромосомными аберрациями. Оценка дозы проводилась после окончания КП, т. е. по остаточной частоте дицентриков, что, естественно, могло привести к недооценке радиационного эффекта у космонавтов, участвующих в ЭО. Также нельзя не учитывать и возможность влияния на уровень хромосомных аберраций дополнительных факторов КП, таких как стресс, невесомость, перегрузки, измененный состав газовой среды. Сочетанное воздействие факторов радиационной и нерадиационной природы может приводить к аддитивному или даже синергетическому эффекту. Непропорционально высокий уровень хромосомных аберраций, наблюдаемый у космонавтов после краткосрочных полетов, может быть связан и с особенностями космического излучения, характеризующегося высокой плотностью ионизации, при действии которого в поврежденных клеточных структурах отсутствуют или крайне слабо выражены восстановительные процессы. Именно вследствие этого ОБЭ излучений с высокой ЛПЭ возрастает по мере снижения суммарной дозы и достигает максимальных значений при хроническом воздействии в малых дозах (Москалев, 1983).

Таблица 9

Биологическая оценка доз у космонавтов по частоте дицентриков и центрических колец

Экспедиция	Станция	Среднее значение физической дозы (диапазон), мГр	Число обследованных	Частота диц+ц. к на 100 кл.±m	«Биологическая» доза (диапазон), мЗв
ЭП	«Мир»	6 (2-11)	4	0,26±0,09	107 (47 – 167)
МКС	2 (1-3)	13	0,18±0,04	53 (27–80)
ЭО	«Мир»	71 (7-109)	14	0,44±0,06	227 (187–267)
МКС	29 (18-46)	6	0,27±0,07	113 (67–160)

Биологическая оценка доз у космонавтов проведена также по частоте стабильных хромосомных аберраций – транслокаций, которые были проанализированы с помощью FISH метода (табл. 10). Среднее значение дозы, рассчитанное по частоте транслокаций в группе космонавтов после первого КП, оказалось близким к дозе, которая была определена по частоте дицентриков. Несколько сниженное значение последней, возможно, обусловлено процессом элиминации клеток с дицентриками из циркулирующей крови космонавтов во время длительного КП. Как и в случае оценки доз по частоте дицентриков, доза после первого КП, рассчитанная по частоте транслокаций, 4 раза превышает значение дозы, полученной на основании данных физической дозиметрии.

Таблица 10

Биологическая оценка доз у космонавтов по частоте стабильных хромосомных аберраций – транслокаций (FISH метод)

Группа	Число обследованных	Данные физической дозиметрии (суммарная доза), мГр	Частота транслокаций FP на 100 кл. ± m	«Биологическая» доза (диапазон), мЗв
До 1-го КП	5	-	0.30 ± 0.06	-
После 1-го КП	10	45 ± 4	0.43 ± 0.09	186 (0 –314),
После 2-го и 3-го КП	8	181±18	0,46 ± 0.06	229 (143 –314)

3.3.2. Профессионалы г. Сарова. Индивидуальная оценка доз проведена спустя несколько десятилетия с начала работы в радиационно-опасных условия производства только для тех профессионалов, у которых частота транслокаций достоверно отличалась от контрольного уровня.

В «гамма» группе значения доз составили от 243 до 1757 мЗв. Несмотря на наблюдаемую тенденцию связи между дозами, полученными с помощью физических методов дозиметрии и «биологическими» дозами, статистический анализ не выявил достоверной корреляции (коэффициент корреляции 0,64, р=0,06).

Оценка доз у профессионалов «бета» группы проведена с использованием двух подходов:

- по частоте транслокаций с помощью калибровочной кривой «доза-эффект», для бета-излучения трития, представленной в работе (Deng et. al., 1998);

- по частоте транслокаций с помощью собственной калибровочной кривой «доза-эффект» для гамма-излучения 60Со с учетом коэффициента ОБЭ бета-излучения трития, полученного в настоящей работе.

Значения индивидуальных доз при использовании первого подхода составили от 01.01.01 мЗв, второго - от 115 до 2530 мЗв, т. е. в 1,5 – 2 раза в среднем выше. Установлена достоверная корреляция между дозами, полученными расчетными методами дозиметрии и дозами, реконструированными по частоте транслокаций. Коэффициенты корреляции составили 0,68 (p=0,004) для доз, рассчитанных по калибровочной кривой для бета-излучения трития и 0,80 (p=0,0002) для доз, рассчитанных по калибровочной кривой для гамма-излучения 60Со с учетом коэффициента ОБЭ трития.

Наибольшие различия между расчетными и «биологическими» дозами наблюдаются в области малых доз – до 100 мЗв (табл. 11). При низких уровнях облучения (по данным физической дозиметрии) значения «биологических» доз превышают расчетные как минимум в 6 раз. В области более высоких доз (>100 мЗв) данные физической и биологической дозиметрии очень близки, особенно при оценке доз по калибровочной кривой для бета - излучения трития. При определении доз по калибровочной кривой для гамма-излучения 60Со с учетом ОБЭ трития данные физической и биологической дозиметрии отличаются в 2 раза.

Таблица 11

Соотношения «биологических» доз и доз, полученных расчетными методами дозиметрии у профессионалов «бета» группы.

Группы, диапазон доз, мЗв	Число обследованных	Расчетная доза, мЗв	«Биологическая» доза, мЗв	Соотношение доз
< 100	8	35	212а (238)в	6,1 (6,8)
> 100	8	386		1,1 (2,1)

а - доза, рассчитанная по калибровочной кривой для бета-излучения НТО;