Совершенствование фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов с помощью гальваностатической кулонометрии (стр. 3 )

А Б

Рис. 5. Кривые кулонометрического титрования арбутина (А) и водного извлечения из бадана листьев (Б).

Методом «введено-найдено» показано отсутствие систематической ошибки, относительное стандартное отклонение не превышает 0,02 (табл. 17).

Таблица 17

Кулонометрическое определение арбутина по реакции

с электрогенерированным бромом (n =5, Р= 95%)

Введено арбутина, мкг	Найдено арбутина, мкг	Sr
138 193 275	136±3 191±4 274±7	0,018 0,019 0,020

НД рекомендует проводить стандартизацию листьев бадана, брусники и толокнянки по количественному содержанию арбутина. Недостатками методики являются длительность и трудоемкость, определению предшествуют стадия очистки от дубильных веществ методом осаждения и получение гидрохинона путем гидролиза арбутина, визуальная фиксации к. т.т. К тому же методика усложняется необходимостью предварительной стандартизации титранта. Поэтому за основу методики количественного определения была взята методика спектрофотометрического определения арбутина в бадана толстолистного листьях с предварительной хроматографической очисткой извлечения. Учитывая, что наряду с арбутином водно-спиртовое извлечение может содержать гидрохинон, который также будет взаимодействовать с электрогенерированным бромом, полученные извлечения из исследуемого сырья проверяли на наличие гидрохинона методом тонкослойной хроматографии. В качестве стандартов использовали РСО арбутина и гидрохинона.

А – спиртовый (40 %) раствор РСО арбутина

Бр1 – спиртовое (40 %) извлечение из листьев брусники до очистки

Бр2 – спиртовое (40 %) извлечение из листьев брусники после очистки

Б1 – спиртовое (40 %) извлечение из бадана листьев до очистки

Б2 – спиртовое (40 %) извлечение из бадана листьев после очистки

Т1 – спиртовое (40%) извлечение из листьев толокнянки до очистки

Т2 – спиртовое (40%) извлечение из листьев толокнянки после очистки

Г – спиртовый (40 %) раствор гидрохинона

Рис. 6. Хроматограмма спиртового (40 %) извлечения бадана толстолистного листьев до и после очистки.

Как видно из рис. 6 на хроматограмме обнаружились красно-оранжевые пятна Rf (0,80), соответствующие арбутину в извлечение до и после очистки; желтое пятно Rf (0) предположительно дубильных веществ в извлечение до очистки и в извлечении брусники до и после очистки обнаружены бледно-розовые быстроисчезающие не идентифицированные пятна Rf (0,91). Пятен гидрохинона в извлечениях нет. Следовательно, водно-спиртовые извлечения из бадана толстолистного листьев, толокнянки листьев и брусники листьев не содержат гидрохинона.

Опыты с добавками арбутина к водному извлечению из бадана листьев свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 18).

Таблица 18

Определение содержания арбутина в извлечении из бадана листьев

с добавками арбутина (n =5, Р= 95%)

Найдено арбутина, мкг	Добавлено арбутина, мкг	Рассчитано арбутина, мкг	Найдено арбутина, мкг	Sr
249 249 249	71 126 190	320 375 439	318±2 377±3 440±3	0,011 0,010 0,003

Правильность и воспроизводимость предложенной методики оценивали путем сравнения с методикой, рекомендуемой в литературе, с помощью критерия Стьюдента и критерия Фишера, соответственно. Результаты статистической обработки показали, что различие между дисперсиями (Fрассч<Fтабл= 15,98 при Р=99%) и между средними (tрассч < tтабл = 3,50 при Р=99% и f=8) статистически не значимо (табл. 19).

Таблица 19

Определение содержания арбутина в ЛРС (n =5, Р= 95%)

ЛРС	Найдено кулонометрически, %	Найдено спектрофотометрически, %
Бадана толстолистного листья, Бот. сад КГМУ, 2009 г.	16,6±0,4 eср=2,4% eед= 5,4%	17,0±0,6 eср=3,7% eед= 8,3%
Fрассч = 2,48 tрассч = 1,62
Брусники листья г. Волжск, 2008 г.	11,0±0,3 eср=2,5% eед= 5,6%	10,9±0,4 eср=3,3% eед= 7,4%
Fрассч = 1,69 tрассч = 0,67
Толокнянки листья Республика Марий-Эл 2010 г.	10,3±0,2 eср=2,4% eед= 5,4%	10,4±0,5 eср=4,8% eед= 10,7%
Fрассч = 4,24 tрассч = 0,45

Таким образом, разработаны простые и чувствительные методики определения содержания арбутина в бадане листьях, толокнянки листьях, брусники листьях. Относительная ошибка среднего кулонометрического определения арбутина не превышает 3%.

Определение содержания дубильных веществ

в ЛРС титрованием гипоиодит-ионами

Гипоиодит-ионы образуются при электролизе калия иодида в щелочной среде, вследствие диспропорционирования образующегося йода: I2 + 2OH - ® I - + IO - + H2O. Учитывая, что определение дубильных веществ по НД основано на реакции окисления, можно предложить в качестве окислителя галогены или гипогалогенит-ионы, чья окислительная способность будет определяться ОВ потенциалами пар Hal2|Hal - и HalO-|Hal-, соответственно.

А Б

Рис.7. Кривые кулонометрического титрования танина (А) и водного извлечения из дуба коры (Б).

Таблица 20

Величины окислительно-восстановительных потенциалов титрантов

ОВ пара	Условия генерации	ОВ потенциал, В отн. х. с.э.	ОВ потенциал, В отн. н. в.э.
BrO-|Br-	Фосфатный буфер рН=8,0	1,65	1,88
IO-|I-	1,05	1,28
Cl2|Cl-	0,1 M HCl	1,44	1,67
Br2|Br-	0,81	1,04
I2|I-	0,52	0,75

Таблица 21

Определение танина по реакции с гипоиодит-ионами (n = 5, Р= 95%)

Введено танина, мкг	Найдено танина, мкг	Sr
84 125 190	84±1 126±2 189±2	0,012 0,015 0,013

Таблица 22

Определение содержания дубильных веществ с добавками танина к водному извлечению из коры дуба в пересчете на танин (n = 5, Р= 95%)

Найдено дубильных веществ, мкг	Добавлено танина, мкг	Рассчитано дубильных веществ, мкг	Найдено дубильных веществ, мкг	Sr
125 125 125	56 84 102	181 209 227	182±3 208±3 227±1	0,024 0,023 0,014

Для выбора титранта и условий титрования были измерены вольтамперометрически ОВ потенциалы пар Hal2|Hal - и HalO-|Hal - на платиновом электроде (табл. 20) относительно хлорсеребряного электрода с последующим пересчетом относительно насыщенного водородного электрода. В связи с тем, что ОВ потенциал пары MnO4-|Mn2+ при окислении дубильных веществ перманганатом калия в условиях, регламентируемых НД, составляет 1,39 В относительно н. в.э., можно предложить в качестве титранта IO-. При титровании танина гипоиодит-ионами, оказалось, что при рН 8,0 танин окисляется только на 80%. Учитывая, что потенциал пары зависит от концентрации ионов водорода, было найдено, что танин окисляется полностью при рН 9,5, что подтверждается методом «введено-найдено» (табл.21) и методом добавок (табл.22). Измеренный вольтамперометрически, ОВ потенциал пары IO-|I - в данных условиях составил 1,33 В (в пересчете относительно н. в.э.). Кривые титрования представлены на рис. 7.

Таблица 23

Определение содержания дубильных веществ в ЛРС

в пересчете на танин (n = 11, Р= 95%)

Лекарственное средство	Найдено кулоно-метрически, %	Найдено перманга-натометрически, %
Дуба кора, -склексредство», г. Красногорск	5,17±0,04 eср= 0,76% eед= 2,5%	6,4±0,2 eср= 2,4% eед= 8,0%
Лапчатки корневища -ЛТ», г. Пенза	18,5±0,2 eср= 1,1% eед= 3,6%	21,8±0,7 eср= 3,2% eед= 10,6%
Ольхи соплодия, «Фито-Эм», п. Мамонтовка	6,49±0,09 eср= 1,3% eед= 4,3%	10,5±0,3 eср= 3,2% eед= 10,6%
Кровохлебки корни и корневища, -чай», г. Москва	16,91±0,08 eср= 0,47% eед= 1,6%	21,6±0,7 eср= 3,2% eед= 10,6%
Бадана корневища -чай», г. Москва	14,9±0,2 eср= 1,2% eед= 4,0%	18,2±0,5 eср= 2,6% eед= 8,6%
Черники плоды, , г. Санкт-Петербург	2,56±0,02 eср= 0,58% eед= 1,9%	2,91±0,08 eср= 2,8% eед= 9,3%

Таблица 24

Определение содержания дубильных веществ

в растительном сырье (n = 9, Р= 95%)

Лекарственное средство	Найдено кулоно-метрически, %	Найдено перманга-натометрически, %
Черемухи обыкновенной листья, Бот. сад КГМУ, 2009 г.	6,30±0,04 eср=0,71% eед= 2,1%	8,4±0,2 eср=2,8% eед= 8,4%
Березы обыкновенной листья г. Мамадыш, 2009 г.	5,02±0,05 eср= 0,91% eед= 2,7%	6,1±0,2 eср= 3,1% eед= 9,3%
Ольхи клейкой листья г. Мамадыш, 2009 г.	3,89±0,04 eср=1,0% eед= 3,0%	6,9±0,1 eср= 1,6% eед= 4,8%
Лапчатки гусиной трава г. Мамадыш, 2009 г.	4,70±0,05 eср=0,96% eед= 2,9%	7,7±0,3 eср=4,0% eед=12,0%
Шиповника майского листья г. Балтаси, 2009 г.	10,99±0,08 eср= 0,75% eед= 2,3%	14,6±0,2 eср=1,7% eед= 5,1%
Боярышника кроваво-красного листья, Бот. сад КГМУ, 2009 г.	5,37±0,03 eср= 0,55% eед= 1,7%	6,9±0,1 eср=2,1% eед= 6,3%
Таволги вязолистной листья Бот сад КГМУ, 2009 г.	13,9±0,1 eср= 0,75% eед= 2,3%	18,4±0,3 eср=1,4% eед= 4,2%
Земляники лесной листья, Боровые Матюши, 2009 г.	8,96±0,06 eср= 0,68% eед= 2,0%	11,03±0,23 eср=2,1% eед= 6,3%
Вишни обыкновенной листья п. Константиновка, 2009 г	3,50±0,04 eср= 1,2% eед= 3,6%	4,6±0,2 eср=3,8% eед=11,4%

Содержание дубильных веществ в ЛРС в пересчете на танин определяли кулонометрическим титрованием гипоиодит-ионами при рН 9,5 и по НД (табл. 23). Относительная ошибка кулонометрического титрования не превышает 2%. Содержание дубильных веществ, найденное кулонометрически, несколько меньше найденного по НД, что связано, вероятно, с меньшим значением ОВ потенциала пары IO-|I - по сравнению с потенциалом пары MnO4-|Mn2+. Следует отметить, что перманганат-ион является жестким окислителем, а это, в свою очередь, значительно расширяет круг органических соединений, подвергающихся окислению под его действием, в том числе и не являющихся дубильными веществами. Поэтому использование перманганат-ионов может приводить к завышенным результатам.

Определено содержание дубильных веществ в растительном сырье, которое используется в научной и народной медицине (табл. 24). Содержание дубильных веществ, найденное кулонометрически, колеблется от 3,50% в вишни обыкновенной листьях до 13,9% в таволги вязолистной листьях.

Таким образом, разработаны методики определения содержания дубильных веществ в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах, отличающиеся экспрессностью и простотой проведения эксперимента. Относительная ошибка среднего кулонометрического определения дубильных веществ не превышает 2%.

ВЫВОДЫ

1.  Проведен сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечественной и зарубежной НД, для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в ЛРС и фитопрепаратах. Определена необходимость совершенствования методик с помощью гальваностатической кулонометрии.

2.  Разработанные усовершенствованные методики определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, препаратах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое» с помощью электрогенерированных из насыщенного раствора K2SO4:H2O (1:7) гидроксид-ионов предложены для включения в раздел нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 5,5%.

3.  Процедура валидации методики определения органических кислот методом гальваностатической кулонометрии в препарате «Холосас» показала обоснованность предложенной методики.

4.  Разработанные усовершенствованные методики определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и препарате «Сироп из плодов шиповника» с помощью электрогенерированного из 0,1 М раствора KI в хлороводородном буферном растворе (рН 1,2) йода предложены для включения в раздел нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 4,5%.

5.  Показано, что арбутин взаимодействует с электрогенерированным из 0,2 М раствора KBr в 0,1 М растворе серной кислоты бромом быстро и количественно, в соотношении 1:1. Усовершенствованные методики определения содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях, брусники листьях предложены для использования в разделе нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 3%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 6%.

6.  Предложенные усовершенствованные методики определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах с помощью гипоиодит-ионов, образующихся при генерации в фосфатном буферном растворе (рН 9,5) йода, могут быть использованы в разделе нормативной документации «Количественное определение». Относительная ошибка среднего не превышает 2%. Относительная ошибка единичного определения не превышает 4,5%. Методики кулонометрического титрования отличаются точностью, экспрессностью, простотой проведения эксперимента, не требуют предварительной стандартизации титранта, использования стандартных образцов или построения градуировочных графиков.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.  Валидация методики определения содержания органических кислот в препарате «Холосас»/ , , // Фармация. – 2009. – №.8 – С. 28 − 30.

2.  Агапова содержания свободных органических кислот в плодах шиповника/ // Материалы 83−й Всерос. студ. науч. конф. − Казань, 2009. − С. 253.

3.  Абдуллина, содержания органических кислот в плодах аронии черноплодной/ , , // Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции: Материалы первой Всеросс. конф. – М., 2009. – С.5−6.

4.  Абдуллина, определение содержания органических кислот в листьях каланхое/ , , // Здоровье и образование в ХХI веке: Инновационные технологии в биологии и медицине: Сб. научн. трудов Х междунар. конгресса. – М., 2009. – С.84-85.

5.  Агапова титрование в анализе препарата «Сок каланхоэ»/, , // Биотехнология и биомедицинская инженерия: Сб. тр. III Всероссийской научн.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск, 2010. – С.253-255.

6.  Кулонометрическое определение дубильных веществ в лекарственном растительном сырье /, , // Фармация –2010. – №.4 – С. 13-15.

7.  Агапова определение содержания органических кислот в свежих и сухих плодах / , , // Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров: Материалы Респ. научн.-практ. Конф. – Казань, 2010. – С.9 − 11.

8.  Агапова растительного сырья по содержанию дубильных веществ/ // Молодые ученые в медицине: Материалы XV Всероссийской научн.-практ. конф. – Казань, 2010. – С. 243.

9.  Абдуллина, свободных органических кислот в растительном сырье/ , , // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. тр. – Пятигорск, 2010. – С.6-7.

10.  Агапова содержания дубильных веществ в растительном сырье методом гальваностатической кулонометрии/ , , // Фармация и общественное здоровье: Материалы ежег. конф. – Екатеринбург, 2010. – С. 203−206.

11.  Агапова определение содержания аскорбиновой кислоты в плодах шиповника/ , , //Здоровье и образование в XXI веке. Материалы ХI международного конгресса. –М., 2010. – С. 44.

12.  Определение содержания органических кислот в плодах рябины обыкновенной / , , // Фармация. – 2011. – №.2 – С. 17 − 19.

13.  Агапова содержания арбутина в листьях бадана толстолистного/ , , //Здоровье и образование в XXI веке: Материалы ХI международного конгресса. – М., 2010. – С.540-541.

14.  Кулонометрическое определение содержания свободных органических кислот в плодах шиповника/ , , // Хим. −фарм. журн. – 2011. –Т.45–№5. – С. 25 − 27.

15.  Агапова кулонометрического титрования для анализа «Сиропа из плодов шиповника» / , , // Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты. Материалы Всерос. научн.−практ. конф. – Самара, 2011. – С.93 − 94.

16.  Абдуллина, гальваностатической кулонометрии для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов. Учебно-методическое пособие для студентов фармацевтического факультета/, , / Казань: КГМУ, 2011 − 46 с.