Совершенствование фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов с помощью гальваностатической кулонометрии (стр. 1 )

На правах рукописи

АГАПОВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ

И ФИТОПРЕПАРАТОВ С ПОМОЩЬЮ

ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКОЙ КУЛОНОМЕТРИИ

14.04.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации на кафедре фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии и кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники

Научные руководители: кандидат химических наук, доцент

кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

доктор химических наук, профессор

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «14» ноября 2011 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.070.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН ( )

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЛАР .

Автореферат разослан: « » ____________2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Д 006.070.01,

доктор фармацевтических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Среди большого ассортимента лекарственных средств, производимых в нашей стране, доля препаратов растительного происхождения составляет 25-30%, а в некоторых фармакотерапевтических группах достигает почти 70%. Повышенное внимание к лекарственному растительному сырью (ЛРС) со стороны населения и медицинских работников отражает мировую тенденцию к увеличению числа лекарственных препаратов на растительной основе. Действительно, ЛРС обладает меньшей токсичностью, мягкостью и широтой терапевтического действия, возможностью более длительного применения, особенно для лечения хронических заболеваний, минимальным проявлением побочных эффектов и аллергических реакций. Обеспечение надлежащего качества ЛРС во многом зависит от правильной организации контроля, его действенности и эффективности, а также от уровня требований, заложенных в нормативную документацию (НД), и используемых методов анализа. Стандартизация и совершенствование методов контроля качества ЛРС являются одной из актуальных задач фармакогнозии. Учитывая, что основным показателем качества ЛРС служит содержание в нем биологически активных веществ, одной из важных задач стандартизации является разработка и внедрение современных методов их количественного определения. В связи с этим всё шире внедряются в практику фармакогностического анализа хроматографические, оптические и электрохимические методы.

Весьма перспективным и доступным для широкого применения методом является гальваностатическая кулонометрия, в котором основными контролируемыми параметрами являются время и сила тока. Имеющиеся в настоящее время приборы и устройства позволяют автоматически измерять эти параметры с очень высокой точностью. На одной и той же установке можно проводить как кислотно-основное, так и окислительно-восстановительное титрование, меняя лишь состав фонового электролита в кулонометрической ячейке. Все это создает предпосылки для разработки высокочувствительных методик кулонометрического определения различных биологически активных соединений. Метод гальваностатической кулонометрии отличается высокой точностью, экспрессностью, простотой проведения эксперимента, не требует предварительной стандартизации титранта, применения стандартных образцов и построения градуировочных графиков и актуален для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов.

Цель исследования. Совершенствование стандартизации ЛРС и фитопрепаратов по содержанию органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ методом гальваностатической кулонометрии.

Задачи исследования:

1.  Провести сравнительный анализ методов, рекомендуемых отечественной и зарубежной НД, для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в лекарственном растительном сырье.

2.  Разработать кулонометрические методики определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, фитопрепаратах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое» с помощью электрогенерированных гидроксид-ионов с рН-метрической индикацией конечной точки титрования (к. т.т.) для включения в НД.

3.  Разработать кулонометрические методики определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и фитопрепарате «Сироп из плодов шиповника» с помощью электрогенерированного йода с биамперометрической индикацией к. т.т. для включения в НД.

4.  Разработать кулонометрические методики определения содержания арбутина в бадана листьях, толокнянки листьях, брусники листьях с помощью электрогенерированного брома с биамперометрической индикацией к. т.т. для включения в НД.

5.  Разработать кулонометрические методики определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах с помощью гипоиодит-ионов с биамперометрической индикацией к. т.т. для включения в НД.

Научная новизна. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, в лекарственных средствах «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое»; схемы методик кулонометрического определения содержания органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в малины плодах, смородины черной плодах, в лекарственном средстве «Холосас». Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и лекарственном средстве «Сироп из плодов шиповника». Определены стехиометрические коэффициенты в реакции арбутина с электрогенерированным бромом в кислой среде и предложена схема реакции. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания арбутина в бадана листьях, брусники листьях и толокнянки листьях. Предложены усовершенствованные методики кулонометрического определения содержания дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах. Найдены стандартные условия получения электрогенерированного йода и предложено проверять эффективность кулонометрического титрования по стандарт-титру «Натрий серноватистокислый 5-водный».

По материалам исследования получено положительное решение о выдаче патента по заявке № «Способ кулонометрического определения дубильных веществ в ЛРС», получен приоритет по заявкам № «Способ кулонометрического определения органических кислот в ЛРС и препаратах из растительного сырья» (от 6.04.2010 г.) и № «Способ кулонометрического определения аскорбиновой кислоты в ЛРС и препаратах из растительного сырья» (от 8.09.2010 г.)

Практическая значимость. Разработаны усовершенствованные методики и схемы методик количественного определения органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах, рябины плодах, малины плодах, смородины черной плодах, в лекарственных средствах «Холосас», «Сироп из плодов шиповника» и «Сок каланхое»; аскорбиновой кислоты в шиповника плодах, первоцвета весеннего листьях и лекарственном средстве «Сироп из плодов шиповника», арбутина в бадана листьях, брусники листьях и толокнянки листьях и дубильных веществ в пересчете на танин в дуба коре, лапчатки корневищах, ольхи соплодиях, кровохлебки корнях и корневищах, бадана корневищах, черники плодах методом гальваностатической кулонометрии, в том числе и в сочетании с методом ионообменной хроматографии (при определении суммы свободных и связанных органических кислот), на кулонометре «Эксперт-006» («Эконикс-эксперт», Россия).

Предложенные методики позволяют исключить расход дорогостоящих реагентов, не требуют применения стандартных образцов, построения градуировочных графиков, отличаются простотой проведения эксперимента, точностью и экспрессностью.

Внедрение в практику. Материалы о практической значимости подтверждены актами о внедрении в учебный процесс Казанского ГМУ на кафедре фармакологии фармацевтического факультета с курсами фармакогнозии и ботаники в виде учебно-методической разработки для студентов фармацевтического факультета «Применение гальваностатической кулонометрии для стандартизации лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов» («Казанский государственный медицинский университет», – 2011 г. – 46 с.); актами о внедрении в практику работы и ГУ «Центр контроля качества и сертификации лекарственных средств Республики Татарстан».

Апробация. 1-ой Всероссийской конференции «Современные методы химико-аналитического контроля фармацевтической продукции» (Москва, 2009), Х и XI международный конгрессе «Здоровье и образование в ХХI веке» (Москва, 2009, 2010), 65-ой межрегиональной конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2010), 3-й ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2010), III Всероссийской конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2010), Республиканской конференции «Актуальные вопросы повышения качества последипломной подготовки фармацевтических кадров» (Казань, 2010), 15-й Всероссийской конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань,2010), Всероссийская конференция «Современная фармацевтическая наука и практика: традиции, инновации, приоритеты» (Самара, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК и 11 тезисов на международных и всероссийских конференциях, издано методическое пособие.

Автор благодарит профессора кафедры аналитической химии Химического института им. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета, академика РАЕН за научные консультации и ценные советы на различных этапах выполнения данного исследования.

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России «Применение кулонометрического титрования в фармацевтическом анализе лекарственных средств и лекарственного растительного сырья» (№ гос. регистрации 012

Основные положения, выносимые на защиту. Методики стандартизации ЛРС и фитопрепаратов по содержанию органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ методом гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных титрантов. Результаты изучения взаимодействия электрогенерированного брома с арбутином.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 132 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований и выводов, содержит 29 таблиц, 22 рисунка. Список литературы включает 183 источника, в том числе 76 иностранных авторов.

ЭКСПЕРЕМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Определение содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в лекарственном растительном сырье и фитопрепаратах проводили на кулонометре «Эксперт-006» («Эконикс-Эксперт», Россия) при силе тока 5 мА. Генераторный и вспомогательный электроды представляли собой платиновые спирали. рН-метр, встроенный в кулонометр, калибровали по буферным растворам с рН 4 и 9 («Метром», Швейцария). Электрогенерацию гидроксид-ионов осуществляли из насыщенного водного раствора K2SO4, смешанного с водой очищенной в соотношении 1:7, конечную точку титрования определяли рН-метрически с помощью лабораторного комбинированного «полумикро»−pH-электрода ЭСК-10614 («Измерительная техника», Россия). Генерацию брома проводили из водного 0,2 М раствора KBr в 0,1 М растворе H2SO4. Электрогенерированный йод получали из 0,1 М раствора KI в хлористоводородном буферном растворе (рН 1,2). Гипоиодит-ионы получали из 0,1 М раствора KI в фосфатном буферном растворе (рН 9,5). Конечную точку титрования определяли биамперометрически с помощью платиновых электродов (DЕ=300 мВ).

Используемые реактивы имели квалификацию х. ч. или ч. д.а. Для проведения ионного обмена использовали катионит КУ-2-8. В качестве растворителя использовали воду очищенную.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Сравнительный анализ определения содержания

действующих веществ в ЛРС и фитопрепаратах.

Отечественная и зарубежная НД рекомендуют для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ титриметрические методы с визуальной и инструментальной фиксацией к. т.т., спектрофотометрию и ВЭЖХ. Недостатком титриметрических методов является трудность определения к. т.т. ввиду наличия собственной окраски вытяжки из ЛРС и необходимость предварительной стандартизации титранта, что увеличивает время анализа. Спектрофотометрия и ВЭЖХ являются ведущими физико-химическими методами анализа, но необходимость наличия стандартных образцов и дорогостоящего оборудования делают эти методы не всегда доступными. В связи с этим для определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ перспективна разработка экспресс-методик методом гальваностатической кулонометрии. Отсутствие необходимости предварительной стандартизации титранта, использования стандартных образцов, невысокая стоимость оборудования и реактивов дают этому методу явные преимущества для проведения рутинных измерений на фармацевтических предприятиях. В связи с этим был сделан вывод о необходимости совершенствования методик определения содержания органических кислот, аскорбиновой кислоты, арбутина и дубильных веществ в ЛРС и фитопрепаратах с помощью гальваностатической кулонометрии.

Определение содержания органических кислот в ЛРС и фитопрепаратах титрованием электрогенерированными гидроксид-ионами

Гидроксид-ионы образуются при электролизе воды на катоде по схеме: 2Н2О + 2ē ® 2OH– + H2­, в присутствии сульфата калия, как переносчика электронов. Эффективность кулонометрического титрования проверяли по стандарт-титру «Кислота соляная 0,1 моль/л», которая составила 99,9±0,2%.

Определение содержания органических кислот в шиповника плодах и рябины плодах. НД предлагает проводить стандартизацию по содержанию свободных органических кислот в пересчете на яблочную кислоту методом прямой алкалиметрии по фенолфталеину в смеси с метиленовым синим. В связи с этим было изучено взаимодействие яблочной кислоты с электрогенерированными гидроксид-ионами. Установлено, что реакция протекает быстро и количественно в стехиометрическом отношении 1:2.

Таблица 1

Результаты кулонометрического определения яблочной кислоты

по реакции с электрогенерированными гидроксид-ионами (n=5, Р=95%)

Введено яблочной кислоты, мкг	Найдено яблочной кислоты, мкг	Sr
148 207 256	149±2 208±2 257±3	0,013 0,007 0,009

Отсутствие систематической ошибки показано методом «введено-найдено» (табл. 1). Опыты с добавками яблочной кислоты к водному извлечению из шиповника плодов и рябины плодов также свидетельствуют об отсутствии систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 2).

Таблица 2

Определение содержания органических кислот с добавками яблочной кислоты к вытяжке из шиповника плодов и рябины плодов (n = 5, Р= 95%)

ЛРС	Найдено органических кислот, мкг	Добавлено яблочной кислоты, мкг	Рассчитано органических кислот, мкг	Найдено органических кислот, мкг	Sr
Шиповника плоды	182 182 182	46 91 139	228 273 321	230 ± 3 272 ± 3 320 ± 4	0,020 0,018 0,019
Рябины плоды	81 81 81	55 77 99	136 158 180	135±1 157±1 180±1	0,014 0,011 0,009

А Б

Рис.1. Кривые кулонометрического титрования яблочной кислоты (А) и водного извлечения из шиповника плодов (Б).

Количественное определение органических кислот в пересчете на яблочную кислоту в шиповника плодах и рябины обыкновенной плодах проведено методом, рекомендуемым НД и по разработанной методике (табл. 3, 4). Кривые кулонометрического титрования представлены на рис. 1. Содержание органических кислот в исследованных образцах шиповника плодов составляет от 1,6 до 2,8%, в рябины плодах от 3,4 до 4,1%. Относительная ошибка кулонометрического титрования не превышает 2%, что значительно ниже ошибки алкалиметрического титрования. При расчете критерия Фишера для всех исследуемых образцов шиповника оказалось, что Fрассч>Fтабл=4,85 при Р=99%, т. е. различие между дисперсиями статистически значимо и выборки неоднородны. Однако, размах варьирования значений выборки кулонометрического титрования входит в размах варьирования значений выборки алкалиметрического титрования. Больший интервал значений, найденных алкалиметрически, связан, по видимому, с трудностью визуальной фиксации к. т.т. ввиду интенсивной окраски водного извлечения из шиповника плодов. Для плодов рябины различие между дисперсиями (Fрассч<Fтабл=4,85 при Р=99%) и между средними (tрассч < tтабл =2,85 при Р=99% и f=20) статистически не значимо. Выборки однородны. Следует отметить, что интенсивность окраски водного извлечения из плодов рябины значительно меньше интенсивности окраски водного извлечения из плодов шиповника.

Таблица 3

Определение содержания органических кислот

в плодах шиповника (n = 11, Р= 95%)

ЛРС	Найдено кулонометрически, %	Найдено алкалиметрически, %
Шиповника коричного плоды, Республика Марий-Эл, 2007 г.	2,71±0,04 eср= 1,5% eед= 5,0%	2,8±0,1 eср= 4,2% eед= 13,9%
Fрассч = 7,55
Шиповника морщинистого плоды, Бот. сад КГМУ, 2007 г	2,56±0,03 eср= 1,0% eед= 3,3%	2,66±0,08 eср= 3,0% eед= 9,9%
Fрассч = 9,80
Шиповника плоды «Фито ЭМ»	1,65±0,02 eср= 1,1% eед= 3,7%	1,73±0,08 eср= 4,6% eед= 15,3%
Fрассч = 18,25

Таблица 4

Определение содержания органических кислот

в рябины обыкновенной плодах (n = 11, Р= 95%)

ЛРС	Найдено кулонометрически, %	Найдено алкалиметрически, %
Рябины плоды	3,41±0,04 eср= 0,94% eед= 3,1%	3,46±0,07 eср= 1,9% eед= 6,3%
Fрассч = 4,22 tрассч = 1,33
Рябины плоды Республика Марий-Эл 2008 г	3,90±0,06 eср= 1,6% eед= 5,3%	3,95±0,09 eср= 2,3% eед= 8,6%
Fрассч = 2,26 tрассч = 1,01
Рябины плоды Республика Чувашия 2008 г.	4,04±0,06 eср= 1,6% eед= 5,3%	4,02±0,09 eср= 2,2% eед= 7,3%
Fрассч = 1,84 tрассч = 0,41

Определение содержания органических кислот в свежих и высушенных плодах. Содержание органических кислот колеблется от 1,45% до 13,22% в высушенных плодах и от 6,32% до 22,1% в свежих плодах, относительная ошибка среднего кулонометрического определения не превышает 2% (табл. 5).

Определение содержания органических кислот в фитопрепаратах. Разработана методика кулонометрического определения содержания органических кислот в холосасе и сиропе из плодов шиповника титрованием электрогенерированными гидроксид-ионами с рН-метрической индикацией к. т.т. В холосасе разных производителей содержание органических кислот варьирует от 1,1 до 1,7%. В сиропах из плодов шиповника, приобретенных в розничной сети, содержится от 0,24 до 0,42% органических кислот (табл. 6).

Таблица 5

Определение содержания органических кислот

в растительном сырье (n = 11, Р= 95%)

Растительное сырье	Найдено кулонометрически, %
Рябины черноплодной плоды Республика Татарстан, 2008 г	3,37±0,03 eср= 0,99% eед= 3,3%
Земляники плоды Республика Татарстан, 2009 г	4,43±0,06 eср = 1,4% eед= 4,6%
Смородины черной плоды Республика Татарстан, 2008 г	13,2±0,1 eср= 0,89% eед= 3,0%
Облепихи плоды Республика Татарстан, 2008 г	10,26±0,08 eср= 0,80% eед= 2,7%
Малины плоды Республика Татарстан, 2008 г	5,51±0,03 eср= 0,61% eед= 2,0%
Боярышника плоды Республика Татарстан, 2008 г	1,45±0,12 eср= 0,74% eед= 2,5%
Барбариса плоды Республика Татарстан, 2008 г	10,8±0,1 eср= 0,97% eед= 3,2%
Облепихи плоды свежие, Республика Татарстан, 2009 г	7,17±0,03 eср= 0,46% eед= 1,5%
Клюквы плоды свежие, Республика Татарстан, 2009 г	22,1±0,3 eср= 1,3% eед= 4,3%
Малины плоды свежие, Республика Татарстан, 2009 г	6,32±0,08 eср= 1,3% eед= 4,3%

Таблица 6

Определение содержания органических кислот

в сиропе из плодов шиповника и холосасе (n = 5, Р= 95%)

ЛРС	Найдено кулонометрически, %	Найдено алкалиметрически, %
Холосас г. Бийск	1,15±0,02 eср= 1,8% eед= 4,0%	1,13±0,05 eср= 4,0% eед= 8,9%
Fрассч = 4,75 tрассч =1,11
Холосас г. Краснообск	1,70±0,02 eср= 0,95% eед= 2,1%	1,69±0,06 eср= 3,6% eед= 8,0%
Fрассч = 13,71 tрассч =0,45
Сироп из плодов шиповника «Астромар», БАД	0,282±0,006 eср= 2,0% eед= 4,5%	0,27±0,02 eср= 6,3% eед= 14,1%
Fрассч = 9,00 tрассч =1,90
Сироп из плодов шиповника -стандарт-Уфавита»	0,396±0,007 eср= 1,7% eед= 3,8%	0,42±0,03 eср= 5,9% eед= 13,2%
Fрассч = 13,33 tрассч =2,16

Относительная ошибка среднего кулонометрического определения не превышает 2%. Правильность и воспроизводимость предложенных методик оценивали путем сравнения с методикой, рекомендуемой НД, с помощью критерия Стьюдента и критерия Фишера, соответственно. Результаты статистической обработки показали, что различие между дисперсиями (Fрассч<Fтабл= 15,98 при Р=99%) и между средними (tрассч < tтабл = 3,50 при Р=99% и f=8) статистически не значимо.