Не инструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц (стр. 2 )

В качестве источника частиц углерода использовали аморфный углерод, который получали в виде сажи путем конденсирования из пламени горящего толуола на стеклянной поверхности. Собранный материал подвергали тщательной отмывке комплексом органических растворителей до исчерпывающего удаления продуктов неполного окисления углеводорода. Углерод суспендировали в 10-ти кратном по весу количестве толуола и кипятили в колбе с обратным холодильником в течение 30 минут, остужали, отфильтровывали на фильтре Шотта. Далее процедуру повторяли 5 раз без нагревания до полного исчезновения окраски в растворителе, после чего отфильтрованный углерод пятикратно отмывали при комнатной температуре диметилформамидом и гексаном. Подобная процедура приводила к полному обесцвечиванию про­текающего через очищаемый углерод растворителя каждого вида. Выбор используемых растворителей осуществляли на основании экспериментальных данных, сравнивая эффективность отмывки отдельных проб различными реагентами. Посредством высушивания под вакуумом ко­нечный продукт освобождали от следов связанных орга­нических растворителей и дополнительно прокаливали до постоянно­го веса в сухожаровом шкафу при 200-300оС в течение 12-24 часов. Получаемый подобным способом чистый аморфный углерод представля­л собой матово-черный лиофильный порошок, нераство­римый в доступных известных растворителях.

В процессе получения суспензии углеродных частиц к 2-х процентному раствору белка G в ЗФР добавляли аморфный углерод до конечной концентрации 5% в условиях вихревого перемешивания на магнитной мешалке. Использовали магнитный перемешивающий элемент, выполненный в виде «турбинки», что обеспечивало дополнительную гомогенизацию получаемой суспензии. Время, необходимое для полной пептизации частиц при комнатной температуре, составляло 30-36 часов. Полученную суспензию озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе. Условия ультразвуковой обра­ботки суспензии (частота и мощность, количество и продол­жительность циклов озвучивания) подбирали таким образом, чтобы обрабатываемый материал при одновременном (возможном) охлаждении не разогревался до температуры свыше 40оС. Полученный в ре­зультате эффективной ультразвуковой дезинтеграции суспензоид центрифугировали при 6000 g в течение 5-ти минут с целью удаления оставшихся относительно крупных частиц. В суспензию пептизированных белком G частиц углерода на роторном встряхивателе вносили равный объем 25% глутарового альдегида. Процесс конъюгирования проводили в течение 1 часа 40 минут при комнатной температуре и интенсивном перемешивании, после чего реагент центрифугировали при 6000 g и освобождали от избытка глутарового альдегида и несвязавшегося анти-лиганда гель-фильтрацией на колонке с Сефарозой CL-6B.

Фракции, вышедшие в холостом объеме и содержащие конъюгат, объединяли и добавляли БСА и глицерин до конечных кон­центраций, соответственно 1% и 20%. В качестве консерванта во всех растворах присутствовал азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

Конъюгаты углеродных частиц со стрептавидином получали аналогичным способом.

Синтезы углеродных конъюгатов, аффинными соединениями которых являлись антитела к ХГЧ, стрептококку группы А и АФП, включали предварительную процедуру дополнительной очистки «пришиваемых» анти-лигандов гель-хроматографией на Сефакриле S-300, после чего схема синтеза, в том числе антител к ТБГ в качестве «пришиваемого» анти-лиганда, не отличалась от описанной выше. Условная схема получаемой в результате частицы представлена на рис.1.

 

Таким образом, результатом разработки одноэтапной технологии синтеза углеродных конъюгатов явились, как минимум, два обстоятельства. С одной стороны, произошло существенное упрощение технологического процесса, которое привело к сокращению не менее, чем в два раза времени синтеза диагностических реагентов, существенному снижению трудоемкости и затратности их получения. С другой, – использование аффинного соединения в качестве пептизирующего полимера неизбежно приводит к увеличению удельного количества его эффекторных групп, связываемых с меткой, следствием чего можно ожидать повышение чувствительности определения лигандов в сконструированных системах аналитического тестирования. Разработанная технология была воспроизведена в 54-х синтезах различных конъюгатов. Схемы синтезов представлены на рис. 2.

 

Проведенные эксперименты показали, что длина волны спектрофотометра, равная 450 нм, при измерении OD углеродного суспензоида наиболее демонстративна с точки зрения удобства формализации оптической оценки реагента. Рабочая концентрация конъюгата составила 0,03%. Определяя оптическую плотность получаемого реагента, вычисляли титр (рабочее разведение), при котором использовали диагностикум в системах анализа.

Стабильность получаемых реагентов изучали на примере конъюгата стрептавидин-углерод, синтезированного по одноэтапной схеме в 1997 году. Его хранение осуществляли в бытовом холодильнике (температура от +4оС до +8оС) в герметично закрывающемся стеклянном флаконе. В процессе хранения часть образцов диагностикумов помещали на две недели в условия комнатной температуры (+22оС) с усредненной периодичностью один раз в два месяца. Аналитическую эффективность детекции оценивали по определению биотинилированного БСА, нанесенного на нитроцеллюлозную мембрану 0,45 мкм из разведений кратных десяти. Параллельно осуществляли детекцию конъюгатом, синтезированным ex tempore. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 3.

Как показывают результаты исследования, десятилетний срок хранения детектирующих реагентов при температурах бытового холодильника не оказывает заметного влияния на эффективность системы аналитического определения соответствующих лигандов даже при условиях кратковременного отклонения от оптимального режима. Чувствительность определения во всех вариантах составила 10 нг/мл.

Универсальность, как основной принцип детекции в структуре серологического анализа, сконструированного на основе углеродного конъюгата с G белком.

В первую очередь, важен тот факт, что G белок, выделенный в свое время из стрептококка G148, обладает чрезвычайно ярко выраженным сродством к Fc-фрагментам молекул IgG большинства млекопитающих, вовлеченных, так или иначе, в научно-исследовательскую сферу деятельности человека. Это послужило основанием для создания ряда аффинных сорбентов для специфического выделения и очистки иммуноглобулинов класса G, что нашло свое отражение в очистке антител, как одной из стадий реализации гибридомной технологии. Однако было бы совершенно неоправданно пройти мимо описанных свойств G белка, имея ввиду их использование в диагностике. Особенно важно подчеркнуть, что для самого G белка не играет никакой роли ни видовая принадлежность, ни способ получения, ни источник связываемых иммуноглобулинов.

Прямое определение IgG. На нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм при помощи приспособления «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США) наносили IgG человека, из серийных двукратных разведений. После подсушивания мембраны и 30-ти минутной инкубации в блокирующем растворе, в качестве которого использовали забуференный фосфатами физраствор, содержащий 0,05% Твина-20 и 1% казеина (ЗФРТ-К), мембрану инкубировали в течение 15 минут в растворе описываемого конъюгата. Параллельно осуществляли детекцию аналогичным конъюгатом, но полученным в результате двухэтапного синтеза. Результаты сравнительного определения, подтвержденные в ходе исследования аналитических параметров 13-ти конъюгатов G-белка с углеродными частицами, представлены на рис.4.

Результаты определения подтверждают предположение о том, что технология одноэтапного синтеза углеродных конъюгатов приводит к повышению чувствительности систем детекции. Реальным объяснением полученного эффекта может быть прогнозированное увеличение числа связывающих центров, включенных в активную поверхность углеродных частиц, составляющих диагностический реагент.

Определение антител к ВИЧ-1 и 2 в варианте сэндвич-анализа. В качестве твердофазных реагентов для определения использовали нитроцеллюлозные полоски с нанесенными в виде поперечных линий анти-лигандами – рекомбинантными вирусоспецифическими белками, продуцируемыми генами envI, gagI, polI и envII; и контрольными антигенами – внутренний отрицательный контроль – рекомбинант, не содержащий антигенных детерминант к ВИЧ-1 и 2, и внутренний положительный контроль – сыворотка против IgG человека. В качестве исследуемых образцов использовали смесь сывороток больных СПИДом с верифицированной инфекцией ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которую предварительно двукратно разводили в ЗФРТ-К, начиная с разведения 1/250. Готовые полоски (две серии по 11 полосок) помещали в исследуемые образцы и после 30-ти минутной инкубации промывали ЗФРТ трижды по 2 минуты. Детекцию проводили двумя диагностикумами: конъюгатом G белка с частицами углерода, полученным в результате одноэтапного синтеза, и ферментным конъюгатом (рис. 5).

Результаты сравнительного определения наглядно демонстрируют преимущества неферментной детекции, чувствительность которой в 4-8 раз превышает ферментную. Дело в том, что ферментная детекция предусматривает реакцию, катализируемую пероксидазой хрена, в ходе которой преципитирующий субстрат 4-Cl-1-нафтол приобретает синюю окраску. Интенсивность окрашивания (цветность) продукта реакции значительно уступает хромогенности частиц коллоидного углерода, а это неизбежно сказывается на чувствительности определения.

О высокой чувствительности и специфичности определения свидетельствует тот факт, что в ходе детекции 202-х ВИЧ-1-позитивных сывороток, 12-ти ВИЧ-2-позитивных сывороток, трех стандартных панелей сывороток содержащих антитела к ВИЧ-1 ГИСКа им. Л. А Тарасевича и 114-ти ВИЧ-негативных сывороток, полученных из банка донорской крови, тринадцатью конъюгатами G белка с частицами углерода не было получено ни одного ложноотрицательного или ложноположительного результата.

Определение антител к стрептококку группы А (СГА). В качестве иммуносорбентов использовали полоски нитроцеллюлозы с сорбированными на них в качестве анти-лиганда АПСХ-БСА из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР дотами по 3 мкл, кроличьими IgG (внутренний положительный контроль) и БСА (внутренний отрицательный контроль), нанесенными из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР. Подсушенные после нанесения анти-лигандов полоски блокировали в ЗФРТ-К в течение 30 минут при 37оС, промывали в ЗФРТ и вновь высушивали. Полученные описанным способом твердофазные реагенты инкубировали в растворах с известной концентрацией антистрептококковых антител, разведенных с шагом 2 в ЗФРТ, начиная с 50 нг/мл, в течение 30 минут, после чего осуществляли детекцию углеродным конъюгатом с G белком. Результаты анализа представлены на рис. 6.

Чувствительность определения, как следует из результатов анализа, составила 0,38 нг/мл. О высокой специфичности системы анализа свидетельствует отсутствие как ложноотрицательных (все точки положительного контроля визуализированы в ходе определения), так и отсутствие ложноположительных (отсутствие связывания углеродного конъюгата в зонах сорбции БСА) результатов. Результаты определения воспроизведены в ходе тестирования тринадцати синтезированных конъюгатов.

Универсальный набор для определения IgG. Проведенные исследования позволили разработать универсальный набор, предназначенный для самостоятельного конструирования в условиях научно-исследовательских лабораторий необходимые тест-системы, способные определять любые IgG в зависимости от интересов и потребностей исследователей. В состав набора входят:

1.  Конъюгат G белка с частицами коллоидного углерода.

2.  10-ти кратный концентрат ЗФРТ-К.

3.  Полоски нитроцеллюлозы с отмеченными зонами нанесения анти-лигандов и нанесенными IgG кролика (в качестве внутреннего положительного контроля) и БСА (в качестве внутреннего отрицательного контроля).

Инструкция по применению сводится к рекомендации нанести соответствующий антиген из раствора с концентрацией 10-100 мкг/мл каплей объемом 3-5 мкл в отмеченную на полоске зону, подсушить в течение 15-20 минут и выдержать 30 минут в разведенном предварительно ЗФРТ-К. Полученные таким образом иммуносорбенты проинкубировать в течение 30 – 60 минут в исследуемой пробе и после 3-х кратной промывки в ЗФРТ осуществить детекцию, выдержав полоски в течение 15 минут в растворе конъюгата. Можно самостоятельно сконструировать практически любую тест-систему определения антител, относящихся к иммуноглобулинам класса G при условии наличия соответствующих антигенов. Но даже при отсутствии соответствующих антигенов, образцы можно напрямую сорбировать на нитроцеллюлозные полоски и осуществлять детекцию описанным способом, учитывая, что детекции будут подвергнуты все IgG, находящиеся в исследуемой пробе. Таким образом, конъюгат G белка стрептококка с наночастицами коллоидного углерода представляет собой универсальный инструмент, применение которого для прямой визуализации (детекции) специфических лигандов и взаимодействий с участием иммуноглобулинов G отвечает всем требованиям корректной диагностики, реализуя основные качественные характеристики: чувствительность, специфичность, воспроизводимость, надежность, наглядность, доступность, безопасность и др.

Иммуноаналитические системы определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ)

Иммунохроматографическое определение ХГЧ. Для конструирования систем иммунохроматографического определения ХГЧ в качестве детектирующего реагента использовали конъюгат углеродных частиц с моноклональными антителами к β-субъединице гормона. На твердой фазе, в качестве которой применяли нитроцеллюлозные пластинки размером 20х80 мм с диаметром пор 5,0 мкм, сорбировали в виде поперечных линий моноклональные антитела к α-субъединице гормона из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в концентрации 50000 МЕ/л. После полного высыхания нанесенных анти-лигандов пластинки блокировали в растворе ЗФРТ-К в течение 30 минут и подсушивали при 37оС, промывали ЗФРТ и вновь высушивали. Подготовленные подобным образом иммуносорбенты наклеивали на прозрачный поливинилхлоридный толстый скотч. Верхнюю границу такой пластинки при помощи того же скотча плотно соединяли с впитывающим элементом (полоска толстой крупнопористой целлюлозной фильтровальной бумаги размером 40х80 мм), нижнюю – с таким же элементом, но размерами 10х80 мм, в качестве нижней контактной зоны. Полученную конструкцию нарезали на полоски шириной 4 мм.

В роли исследуемого образца использовали стандарт ХГЧ, разведенный в ЗФРТ, контролем служила моча здорового мужчины. Нижние контактные элементы хроматографических полосок опускали в подготовленные пробы, смешанные предварительно с равным объемом конъюгата, на 5-7 секунд, после чего их переносили на то же время в раствор ЗФРТ. Схема работы аналитической системы представлена на рис. 7.

За счет сил капиллярного всасывания раствор, содержащий гормон и детек­тирующий реагент, поднимался по полоскам со скоростью около 1,5 см/мин. Через 2-3 минуты результаты анализа определяли визуально по наличию (положительный результат) или отсутствию (отрица­тельный результат) связывания суспензоидного конъюгата в зоне иммобилизации первых антител (черные полосы на светло-сером фо­не). Свидетельством корректно проведенного анализа являлась черная полоса в зоне иммобилизации внутреннего положительного контроля (рис. 8).

Приведенные результаты иммунохроматографического определения ХГЧ демонстрируют высокий уровень чувствительности за счет использования в качестве детектирующего реагента частиц коллоидного углерода, конъюгированных с антителами к ХГЧ. Об этом свидетельствует окрашивание в зоне иммобилизации первых антител к ХГЧ при исследовании пробы, содержащей гормон в концентрации 10 МЕ/л. О высокой специфичности анализа говорит отсутствие окрашивания на поверхности иммуносорбента в условиях отрицательного контроля. Полученные результаты были воспроизведены при исследовании аналитических свойств восьми синтезированных диагностикумов.

Сам по себе результат определения 10 МЕ/л говорит о привлекательных аналитических характеристиках разработанной системы диагностики. Ни одна из представленных на нашем рынке систем определения ХГЧ, выполненных в аранжировке иммунохроматографии, не обладает чувствительностью выше 20-25 МЕ/л. Более того, качество этих систем оставляет желать лучшего, о чем свидетельствует рис. 9.

Автором не ставилась задача исследовать аналитические параметры и оценить достоинства или недостатки реализуемых на отечественном рынке систем экспрессной диагностики беременности. Выборка из аптечной сети была случайной. Анализируя полученные результаты, корректной можно считать работу только трех из восьми проверенных диагностикумов.

Иммунофильтрационное определение ХГЧ. Для осуществления иммунофильтрационного (называемого также проточно-адсорбционным) способа определения ХГЧ использовали те же иммунореагенты, что и в иммунохроматографии. Приспособле­нием для осуществления данного способа являлся пластиковый ци­линдр с заглубленным отверстием в верхней части, заполненный крупнопористой хроматографической бумагой в качестве впитывающего элемента, с помещаемыми сверху опорным диском из крупнопористого полипропилена и иммуносорбентом (рис.10), который готовили, сор­бируя на нитроцеллюлозном мембранном фильтре с диаметром пор 5 мкм связывающие моноклональные антитела к α-субъединице гормона в виде вертикальной линии из раствора с концентрацией 1,0 мг/мл ЗФР и сам гормон в качестве внутреннего положительного контроля в виде горизонтально пересекающей линии из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л.

Высушенные после нанесения анти-лигандов мембраны блокировали, инкубируя в ЗФРТ-К 1 час при комнатной температуре, после чего отмывали ЗФРТ и вновь высушивали таким же образом.

В ходе анализа в отверстие крышки вносили 0,5 мл ЗФРТ для смачивания иммуносорбента. Затем - 0,5 мл предварительно подготовленной пробы, представляющей собой смесь равных объемов исследуемого образца (моча беременных женщин или здоровых мужчин) и конъюгата углеродных частиц с моноклональными антителами к β-субъединице гормона в двукратном от рабочего разведении. После впитывания последней вносили 1 мл ЗФРТ для промывки поверхности мембраны. Время анализа 1,5 – 2 минуты. Результаты представлены на рис. 11.

Наличие «+» на поверхности мембраны свидетельствует о присутствии в пробе ХГЧ, «-» - об отсутствии гормона и корректно проведенном анализе.

Несомненным удобством аранжированного подобным образом анализа является его простота и наглядность. По сути, в наборе для реализации такого анализа должны присутствовать только ячейки с подготовленным иммуносорбентом, флакон с конъюгатом и одноразовые пластиковые пипетки, при помощи которых последовательным набором осуществляется смешивание исследуемого образца с конъюгатом и внесение готового раствора в ячейку. Для промывки иммуносорбента используется капельница с ЗФРТ. Все восемь синтезированных конъюгатов продемонстрировали корректный результат при исследовании 58-ми образцов мочи беременных женщин. В ходе исследования 42 образцов мочи здоровых мужчин ложноположительных результатов не наблюдали.

Дот-форматная аранжировка аналитической процедуры полуколичественного определения ХГЧ. Аранжирование определения ХГЧ в формате дот-иммуноанализа позволило разработать полуколичественный метод. Использовали уже описанное приспособление для нанесения проб на пористую мембрану «BIO-DOT Apparatus» (BIO-RAD, США). Условием проведения анализа являлась необходимость серийного разведения исследуемой пробы и сравнение последней визуализируемой точки со стандартом в известной концентрации. В качестве иммуносорбента использовали нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм с нанесенными анти-лигандами: моноклональными антителами к α-субъединице гормона, сам гормон из раствора с концентрацией 50000 МЕ/л в качестве внутреннего положительного контроля и ФСГ в качестве внутреннего отрицательного контроля. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата моноклональных антител против β-субъединицы ХГЧ с углеродом в течение 15

минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис. 12).

Результаты анализа, представленные на рис. 12, демонстрируют чувствительность определения 5 МЕ/л. Визуализируемой на этом уровне точке референса соответствует точка разведения исследуемого образца 1:104, из чего следует, что исходное содержание гормона было равно 50000 МЕ/л. Аналогичные результаты были продемонстрированы всеми восемью синтезированными конъюгатами. Таким образом, разработанная схема дот-иммуноанализа, вполне пригодна для полуколичественного определения любых лигандов при условии наличия референсных образцов. Возможность количественной формализации результатов анализа в существенной степени приближает удобную в процедурном отношении, чувствительную и надежную в плане аналитических возможностей диагностическую сферу медико-биологических исследований к пользователям, удаленным от крупных центров, оснащенных современным оборудованием.

Описанные для определения ХГЧ форматные аранжировки: иммунохроматография, иммунофильтрация и дот-иммуноанализ могут быть реализованы в конструировании любых систем, имеющих такое же форматное оформление. Речь идет о подготовке твердофазного реагента (иммуносорбента) описанным способом, контакте его с исследуемым объектом (кровь, сыворотка, моча, экстракт, слюна, слеза и т. д.) и детекции соответствующим специфическим диагностикумом. Определяющими оценочными факторами с позиции целесообразности того или иного процедурного оформления являются порог диагностически значимого результата и индивидуальные свойства компонентов диагностической системы, способные или неспособные реализовывать требуемые аналитические характеристики, в первую очередь, аффинность антител, структурная организация молекул, характер возможной контаминации. Что же касается самой углеродной метки, то и ее физико-химические параметры, и технология синтеза конъюгатов надежно гарантируют воспроизводимые качественные характеристики диагностикумов, обеспечивающие возможность их применения в любых процедурных аранжировках.

Прямое дот-иммуноаналитическое определение стрептококка группы А. В качестве детектирующего реагента использовали конъюгат кроличьих антистрептококковых антител с частицами коллоидного углерода. Системой сравнения служила детекция ферментным конъюгатом кроличьих антител к стрептококку гр. А с пероксидазой хрена и проявлением результатов анализа с 4-хлор-1-нафтолом в стандартных условиях. На полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм наносили АПСХ-БСА из серийных разведений в ЗФР дотами по 3 мкл и БСА в качестве отрицательного контроля. После высушивания нанесенных лигандов и блокирования поверхности полосок растворе ЗФРТ-К их обрабатывали

сравниваемыми системами детекции (рис. 13).

Преимущество неферментной детекции подтверждается, прежде всего, в два раза более высокими показателями чувствительности. Отсутствие стадии субстратного проявления делает процедуру анализа более оперативной, упрощает ее, исключает вредность контакта с токсичным субстратом ферментной реакции. Подобного рода система анализа, позволяющая в течение часа в кабинете врача или в условиях обычной клинической лаборатории определить наличие СГА в мазке больного с чувствительностью 40-80 нг/мл, могла бы стать действенным инструментом в первичной диагностике инфекции. Представленная модель аналитической системы демонстрирует преимущества и принципиальную возможность определения СГА углеродным конъюгатом, воспроизведенную в трех синтезах. В реальной аналитической практике возникает методическая проблема, связанная с подготовкой исследуемой пробы (лизис клеточной стенки бактерии), которая могла бы служить серьезным препятствием на пути внедрения описываемой диагностической системы в качестве оперативного инструмента. Существующее решение этой проблемы было апробировано в ходе разработки сэндвич-варианта дот-иммуноаналитической системы определения СГА.

Дот-иммуноаналитическое определение стрептококка гр. А в варианте сэндвич-анализа. Сравниваемые системы детекции были те же, что и при прямом сравнении определения АПСХ. На нитроцеллюлозные полоски сорбировали антитела к стрептококку гр. А дотами по 3 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР и АПСХ-БСА в качестве внутреннего положительного контроля (К+) в той же концентрации. Полоски обрабатывали в блокирующем растворе по описанной выше схеме. Исследуемыми образцами служили клеточные лизаты с известным содержанием клеток в исходных пробах. Лизаты получали методом, разработанным в лаборатории стрептококковых инфекций ММА им. [Шмакова и др., 1991]. Подготовленные иммуносорбенты инкубировали с анализируемыми образцами в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего отмытые в ЗФРТ полоски детектировали ферментным и углеродным конъюгатами. Результаты сравнительного анализа представлены на рис. 14.

В представленном варианте анализа чувствительность неферментного определения стрептококка группы А составила 104 клеток/мл, что существенно превышает чувствительность ферментного определения и соответствует рекомендациям ВОЗ, согласно которым данный показатель является необходимым порогом диагностически значимой чувствительности методов, особенно экспрессных, и позволяет проводить идентификацию СГА непосредственно в мазке из зева.

Дот-иммуноаналитическое определение АФП и ТБГ в сыворотке крови беременных женщин. Форматная аранжировка определения АФП и ТБГ фактически повторяет таковую, разработанную для полуколичественного определения ХГЧ, описанную выше. В процедуре подготовки твердофазного реагента, как и в ходе анализа, также использовали приспособление для нанесения проб на пористую мембрану. Анализировали образцы, полученные в результате серийного разведения исследуемой пробы (сыворотка крови беременной женщины в сроке 16 недель) в прямом сравнении с последней визуализируемой точкой раститрованного с шагом 2 референс-стандарта АФП. На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм наносили аффинноочищенные козьи поликлональные антитела к АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл в ЗФР объемом 20 мкл, сам белок в качестве внутреннего положительного контроля (К+) и БСА в качестве отрицательного контроля (К-). После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, и в лунки вносили образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь твердофазный реагент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата поликлональных антител против АФП с углеродом в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.15).

Чувствительность определения АФП в представленном варианте анализа составила 10 нг/мл. Из этого следует, что концентрация АФП с учетом разведения в исследуемом образце составляла около 40 нг/мл. Полученный результат согласуется с имеющимися данными, свидетельствующими о том, что медиана концентрации АФП в материнской сыворотке при сроке беременности 16 недель составляет 41 нг/мл (33 МЕ/мл) [Решетников, 2004, Tabor et al., 1987].

Для определения ТБГ в сыворотке крови (беременность 16 недель) на мембрану наносили моноклональные антитела к ТБГ в той же концентрации и таким же образом, что и в описанном определении АФП. В качестве контролей использовали сам белок – «К+» и АФП – «К-». В ходе анализа в лунки вносили образцы референсного белка, раститрованного с шагом 10 параллельно с исследуемыми образцами в аналогичном разведении. Детекцию осуществляли конъюгатом моноклональных антител к ТБГ с частицами углерода (рис.16).

 

Чувствительность определения ТБГ в системе дот-иммуноаналитического исследования составила 1,0 нг/мл. Следовательно, с учетом разведения концентрация определяемого белка в исследуемой пробе находилась в диапазоне от 10 до 100 мкг/мл. Согласно литературным данным, среднее значение нормы ТБГ в материнской сыворотке при сроке беременности 16 недель составляет 48 мкг/мл [Богданович и др., 2004].

Безусловно, с позиций количественной формализации результатов, полученную точность определения трудно назвать удовлетворительной, отсюда и квалификация разработанного метода как полуколичественного. Однако следует отметить, что для увеличения точности оценки результатов достаточно использовать более дробное разведение референсного и исследуемого материала.

Возможность количественной формализации получаемых результатов (даже с точки зрения оценки динамического «больше-меньше») может иметь особое значение при анализе парных проб, когда исследования одного и того же параметра осуществляются через определенные временные промежутки (1-2 недели). Разработанная система анализа может служить надежным инструментом, позволяющим динамически следить за концентрацией ТБГ, отсутствие прироста которого при еженедельном определении позволяет диагностировать наличие плацентарной недостаточности.

Полуколичественная оценка процесса сероконверсии в ходе получения специфических антител. Известна важность контроля за процессом выработки антител при иммунизации лабораторных животных. Наиболее широко используемым методом в современной лабораторной практике, является метод двойной радиальной иммунодиффузии в геле [Оухтерлони, 1949]. Метод достаточно демонстративный, но занимает слишком много времени, малочувствителен и страдает определенным субъективизмом в оценке результатов. Этих недостатков лишена дот-иммуноаналитическая система определения антител с использованием уже описанного углеродного конъюгата с G белком.

На нитроцеллюлозную мембрану с размерами пор 5,0 мкм при помощи устройства «Био-Дот» наносили АФП из раствора с концентрацией 0,1 мг/мл ЗФР объемом 20 мкл, в качестве внутреннего положительного контроля – IgG козы, в качестве внутреннего отрицательного контроля - БСА. После полного высушивания нанесенных анти-лигандов мембрану блокировали, как описано выше, и вносили в лунки образцы референсных и исследуемых проб объемом по 100 мкл. Референсные пробы – разведения козьих анти-АФП антител с известной концентрацией в ЗФР, исследуемые – разведения сыворотки крови иммунизированной козы. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После полного прохождения образцов сквозь иммуносорбент осуществляли детекцию, инкубируя мембрану в растворе конъюгата G белка с частицами углерода в течение 15 минут. Результат оценивали после 3-х кратной промывки мембраны ЗФРТ (рис.17).

 

Время проведения анализа, если не считать время подготовки иммуносорбента, – 25 минут, чувствительность определения – 10 пг/мл. Анализируя полученные результаты, можно рассчитать примерную концентрацию антител в исследуемой сыворотке. Последняя визуализируемая точка, равная 10 пг/мл, в ряду разведений сывороток соответствует разведению 1:107. Из этого следует, что концентрация антител в исследуемой сыворотке составляет 0,1 мг/мл.

Описанную систему анализа легко адаптировать для определения практически любых антител в любом биологическом материале. Отсюда возможность разработки систем простого и надежного контроля за эффективностью процессов вакцинации человека и животных. Это могло бы найти свое применение в ветеринарии, особенно в условиях угрозы эпидемического кризиса.

Биотин-стрептавидиновые взаимодействия в иммунодиагностике.

Универсальность уже описанных систем детекции стереоспецифических взаимодействий, основанных на использовании в качестве аффинного соединения конъюгата G белка бесполезна, когда единственным способом связывания определяемого лиганда с твердой фазой является использование специфических антител. Решение проблемы в виде синтеза конъюгата с использованием вторых антител, конъюгированных с частицами углерода при этом не всегда возможно по ряду вполне определенных причин, чаще всего - экономических. На наш взгляд, уместно использование уникальных способностей биотина и стрептавидина. Стрептавидин - белок, вырабатываемый Streptomyces avidinii, обладающий очень высоким сродством к биотину, благодаря наличию в структуре его молекулы четырех центров связывания. Наиболее стандартное применения этого белка - выявление биотинилированной ДНК в методе нерадиоактивной гибридизации in situ, где обычно он используется в комплексе с флуоресцентной или ферментной меткой. Однако биотинилировать можно не только ДНК. Используя N-гидроксисукцинимидный эфир аминокапроидбиотина, можно легко биотинилировать практически любые белки, в том числе и антитела. Именно такие биотинилированные зонды мы использовали в системах диагностики, где в качестве универсального детектирующего реагента применяли уже упомянутый конъюгат стрептавидина с углеродными частицами, синтезированный по описанной для G белка одноэтапной схеме.