Не инструментальные иммунодиагностические системы на основе углеродных наночастиц (стр. 3 )

Определение столбнячного и ботулинического анатоксинов на непористой твердой фазе. В качестве основы твердофазного реагента использовали плоское дно лунок планшета, предназначенного для серийных разведений, изготовленного из белого полистирола фирмы Linbro (США). На дно лунок сорбировали антитела к столбнячному и ботулиническому анатоксинам дотами из капель по 5 мкл в концентрации 0,1 мг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ). После инкубации во влажной камере при температуре +37оС капли удаляли, а поверхность иммуносорбента промывали ЗФРТ. В качестве внутреннего положительного контроля в каждой лунке сорбировали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного – IgG человека. В лунки вносили исследуемые образцы соответствующих анатоксинов в ЗФРТ в разведении, кратном двум и после 30-ти минутной инкубации и двукратной промывки - соответствующие биотинилированные антитела: в одном случае - к столбнячному, в другом – к ботулиническому анатоксинам. Время инкубации составляло 30 минут, после чего лунки промывали ЗФРТ и осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидина с углеродом в течение 15 минут (рис.18).

 

Чувствительность анализируемой системы 10 и 100 нг/мл не может считаться достаточной для целей реальной диагностики. Однако следует учитывать тот факт, что емкость сорбции на непористой твердой фазе существенно ниже, чем на пористых мембранах, что в конечном итоге и ограничивает диагностические возможности систем анализа, сконструированных на основе непористых материалов. В то же время описываемый материал имеет несомненное достоинство в том, что абсолютно не требует процедуры блокирования своей поверхности после комплексирования с анти-лигандами. Многочисленными экспериментами доказано отсутствие какого бы то ни было неспецифического взаимодействия углеродных конъюгатов с поверхностью полистирольного планшета. Что касается исследования аналитических параметров определения, то они были воспроизведены в ходе тестирования 24-х стрептавидиновых конъюгатов. Демонстрируемая система тестирования при помощи стрептавидинового конъюгата позволяет прогнозировать реальную возможность конструирования такого же универсального инструмента, как и в случае с конъюгатом G белка с углеродными частицами. В системе аналитической процедуры достаточно сменить только твердофазный реагент и биотинилированные зонды, чтобы получить систему, способную определять практически любой лиганд, к которому возможно получение специфических антител. Что же касается возможностей повышения чувствительности определения, то можно выделить, как минимум, два направления. Первое предусматривает использование в качестве иммуносорбента пористых материалов с сорбированными на них анти-лигандами, второе - усиление результирующего сигнала, введением в систему детекции конъюгат биотина с углеродом.

В качестве примера универсальных возможностей разработанного метода можно представить экспресс-применение биотин-стрептавидинового конъюгата для дифференциальной детекции IgG.

В ходе выделения и очистки одного из белков фетоплацентарного комплекса человека с использованием двух аффинных сорбентов: козьи антитела против АФП и кроличьи антитела против IgG человека, конъюгированных с сефарозой, в получаемом препарате появилась контаминация, верифицированная как IgG. Для идентификации видопринадлежности иммуноглобулинов использовали две полоски нитроцеллюлозы с диаметром пор 0,45 мкм, на которые сорбировали контаминированные пробы и биотинилированный БСА (Bi-БСА) в качестве положительного контроля. После блокирования в стандартных для этой процедуры условиях, полоски инкубировали, в одном случае, с биотинилированными анти-кроличьими антителами, в другом – с биотинилированными анти-козьими антителами. После промывки иммуносорбентов осуществляли детекцию конъюгатом стрептавидин–углерод. Результаты анализа представлены на рис. 19.

Из результатов анализа следует, что получаемый препарат был контаминирован кроличьими антителами, что свидетельствует об утечке лиганда с применяемой на стадии доочистки аффинной колонки. Положительный и отрицательный контроли убедительно продемонстрировали высокий уровень специфичности системы анализа. Подобный пример может служить демонстрацией универсальных способностей сконструированной системы детекции и прогнозировать возможность формирования универсального набора для конструирования систем анализа в условиях любой исследовательской лаборатории в зависимости от актуальных потребностей.

Привлекательной стороной использования особенностей биотин-стрептавидинового взаимодействия явилась возможности усиления чувствительности детекции. Идея использования амплификации результирующего сигнала потребовала синтеза углеродного конъюгата с биотином в качестве аффинного соединения. Для этого в качестве исходного реагента использовали биотинилированный БСА. Схема одноэтапного синтеза ничем не отличалась от описанной технологии получения диагностикумов с G белком, стрептавидином, очищенными поли - и моноклональными антителами.

Для реализации идеи усиления результирующего сигнала на дно лунок полистирольного планшета сорбировали описанным способом биотинилированный БСА дотами из капель по 5 мкл из разведений кратных двум в КББ, начиная с 5 мкг/мл. После комплексирования в лунки вносили в одном случае конъюгат стрептавидин-углерод, в другом - смесь равных объемов конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод (рис. 20).

Представленные результаты подтверждают возможность повышения чувствительности определения с использованием приема усиления результирующего сигнала введением в систему детекции биотинилированного углерода. Чувствительность определения в стандартных условиях составила 20 нг/мл, с усилением – 5 нг/мл. Механизм наблюдаемого усиления можно представить следующим образом. Частицы углерода связываются со специфическим иммунным комплексом на поверхности твердой фазы посредством взаимодействия стрептавидина на их поверхности с биотинилированным лигандом. В свою очередь, частицы углерода, поверхность которых модифицирована биотином, связываются с уже иммобилизованными частицами стрептавидинового диагностикума.

И те и другие частицы доступны для продолжения взаимных «контактов», осуществление которых приводит к амплифицированному увеличению числа связанных углеродных частиц в зоне сорбции специфических комплексов или молекул, что и способствует усилению результирующего сигнала. Кроме того, пространственная структура конъюгатов позволяет связываться с сорбированным на твердой фазе лигандом преформированного комплекса, образующегося в жидкой фазе реакционного объема. В сочетании с использованием пористого материала для сорбции анти-лигандов описанный прием может существенно повысить чувствительность детекции. Данное предположение было наглядно подтверждено в варианте определения анти-человеческих антител при анализе кроличьей иммунной сыворотки с целью оценки эффективности сероконверсии. Для проведения анализа поверхность нитроцеллюлозных полосок сенсибилизировали иммуноглобулинами G человека. Использовали уже описанное приспособление «Био-Дот». В прибор устанавливали мембрану с диаметром пор 0,45 мкм и в 6 рядов лунок вносили анти-лиганды по 20 мкл из раствора с концентрацией 1 мг/мл ЗФР. В качестве внутреннего положительного контроля использовали биотинилированный БСА, в качестве отрицательного – интактный БСА. После полного высушивания анти-лигандов полоски блокировали описанным способом и вновь высушивали. Подготовленный подобным образом иммуносорбент вновь помещали в прибор и вносили в нечетные ряды лунок по 0,2 мл растворов кроличьих антител против IgG человека с известной концентрацией от 50 мкг/мл до 5 пг/мл. В лунки четных рядов - образцы сыворотки иммунизированного кролика по 0,2 мл, разведенной в ЗФРТ с шагом 10. После полного прохождения образцов сквозь мембрану лунки промывали ЗФРТ 3-х кратно по 0,2 мл, после чего вносили в каждую лунку по 20 мкл биотинилированных анти-кроличьих антител в концентрации 1,0 мг/мл. В контрольные лунки вносили ЗФРТ. После двукратной промывки лунок ЗФРТ мембрану извлекали из прибора, вновь промывали и осуществляли детекцию в стандартной системе стрептавидиновым конъюгатом, описанной выше смесью конъюгатов стрептавидин-углерод и биотин-углерод и ферментным конъюгатом стрептавидин-пероксидаза хрена (рис.21).

Из результатов проведенных сравнительных анализов следует, что вариант совместного использования углеродных конъюгатов на основе стрептавидина и биотина позволяет существенно (в данном случае в 100 раз) повысить чувствительность определения.

Ферментная детекция, чувствительность которой равна чувствительности определения стрептавидиновым конъюгатом в стандартных условиях (без усиления), тем не менее, проигрывает по другим важным характеристикам. Прежде всего, обращает на себя внимание наличие слабого сигнала (фона) в зоне отрицательного контроля. Факт вполне объяснимый тем обстоятельством, что ферментная метка, особенно пероксидазная, обладает способностью к неспецифическому связыванию, как с белками, так и с пористыми материалами на основе нитроцеллюлозы. Дело в том, что общепринятая технология получения пероксидазных конъюгатов [Tijssen, 1985] предусматривает периодатное окисление фермента с последующим после конъюгирования восстановлением боргидридом натрия. Даже при самом незначительном от исчерпывающего отклонении в восстановлении окисленных форм фермента, что часто бывает в условиях масштабированного производства, появляются проблемы с фоном в ходе аналитических исследований.

Все описанные выше системы аналитического определения были либо направлены на детекцию иммунореактивных соединений, либо использовали иммунореактивные соединения в структуре аналитической аранжировки. Однако, если иметь ввиду более широкое понятие «стереоспецифический анализ», можно легко прогнозировать возможность разработки систем, основанных на принципах генно-гибридизационного и лиганд-рецепторного взаимодействий, в которых также есть место реализации достоинств углеродных конъюгатов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования наглядно продемонстрировали возможность получения надежных диагностикумов, эксплуатирующих уникальные природные свойства углеродных частиц. Химически индифферентный материал может быть вовлечен в физико-химическую перестройку, результатом которой является получение принципиально нового продукта – конъюгата инертных в отношении образования прочных химических связей углеродных частиц с различными биологически активными молекулами. Высокий уровень оптической контрастности (хромогенности) обеспечивает углеродной метке приоритетное положение в ряду любых цветных материалов, применяемых в диагностических системах.

Разработанная одноэтапная технологическая схема синтеза углеродных конъюгатов, по существу, представляет собой простой и надежный способ масштабного производства диагностикумов разной направленности. При этом, она объективно не зависит ни от условий производства, ни от уникального оборудования, требующего, как правило, дополнительных затрат на обслуживание и эксплуатацию. Смена производимого продукта не влечет за собой никаких технологических изменений и связанных с этим материальных затрат, а вопросы масштабирования решаются простым изменением объема сорбента, участвующего в процессе хроматографии.

Представленные результаты аналитического тестирования в полной мере демонстрируют основные привлекательные характеристики тест-систем, конструируемых с использованием углеродных конъюгатов. Высокая чувствительность за счет исключительной хромофорности углеродных частиц и максимального размещения активных групп на их поверхности обеспечивают получение диагностически значимого результата. Высокая специфичность, подтвержденная отсутствием примеров неспецифического связывания, в основе которой лежат технологические решения, предусматривающие минимизацию неспецифических взаимодействий, отвергает возможность получения ложноположительного результата, который может стать причиной негативных последствий некорректного тестирования. Стабильность реагентов, обусловленная прочностью химических связей, что являющается следствием надежного конъюгирования аффинных соединений с частицами коллоидного углерода, обеспечивает не только хорошую воспроизводимость результатов, но и возможность длительного и нетребовательного хранения. Это в равной степени касается и перспектив неограниченно долгого хранения результатов анализа, что бывает чрезвычайно важно в ситуациях, когда необходимо сравнение результатов исследований, разнесенных во времени.

Не меньшее значение имеет ряд процедурных удобств, свойственных сконструированным системам аналитического тестирования. Особенно это касается возможности создания экспрессных тест-систем. Такое качество, как простота исполнения анализа, освобождает от необходимости подготовки квалифицированных специалистов, что часто бывает серьезной проблемой в условиях небольших отдаленных от крупных центров медицинских пунктов и лабораторий. Наглядность и очевидность полученных результатов анализов предохраняют от неоднозначности и субъективизма в их трактовке, а оперативность исполнения позволяет сократить до минимума время адекватной реакции, особенно в случаях необходимости экстренного принятия мер интенсивной терапии. Все это может и должно стать основой для скорейшего доведения описанных и перспективных моделей аналитических систем до готового к использованию состояния и перехода к масштабному выпуску диагностических тест-систем углеродного происхождения.

Описанные конкретные системы аналитического определения различных лигандов никоим образом не исчерпывают возможности применения, как разработанной технологии, так и спектра конструируемых на ее основе систем детекции. Все описанные аналитические модели и различным образом аранжированные форматные процедуры определения принципиально отличающихся лигандов служат лишь демонстрацией некоторых возможностей применения детектирующих реагентов, синтезированных на основе частиц углерода. Более того, представленные примеры и те, которые представляют собой лабораторные модели, и те, которые используются в реальной лабораторной аналитической практике (идентификация IgG, оценка уровня сероконверсии), могут быть отнесены к группе, так называемых, неинструментальных методов исследования. Но неинструментальность не является основной целью представляемого направления научных исследований, а потому, не ставится автором в ряд необходимых процедурных характеристик, оценивающих основные параметры сконструированных тест-систем с позиции их привлекательности. Есть все основания, в том числе и экспериментальные, полагать, что описанные диагностические реагенты могут быть с успехом использованы в разработке инструментально аранжированных методов, в частности, турбидиметрического анализа с использованием спектрофотометрии для формализации получаемых результатов и плашечного варианта твердофазного анализа с детекцией результатов в планшетном фотометре. Очевидно, что это позволит существенно модифицировать целый ряд диагностических методов исследования, находящихся в арсенале клинических лабораторий, но это уже цель будущих исследований.

Необходимо отметить, что не все представленные аранжировки аналитических систем являются совершенными и технологичными. Нельзя, например, надеяться на то, что в любой лаборатории найдется прибор «Био-Дот» для нанесения образцов на мембрану и осуществления анализа. Отсюда - необходимость в дальнейшей разработке различных форматных аранжировок и процедурных приемов, основанных на использовании описанных свойств углеродных конъюгатов.

Таким образом, разработанная технология синтеза конъюгатов углеродных наночастиц может стать основой для конструирования широкого спектра эффективных систем для упрощенного диагностического тестирования, способных существенно расширить диапазон и повысить уровень информативной ценности и надежности фундаментальных и прикладных аналитических исследований в биологии, медицине, криминологии, сельском хозяйстве и т. д. Привлекательные характеристики таких тест-систем с успехом могут быть реализованы в разнообразных "один пациент-один тест" набо­рах для амбулаторных, пребольничных и больничных анализов, вклю­чая срочные клинические и эпидемические ситуации, в массовых "домашних" системах, пригодных для индивидуального ис­пользования, в полевых условиях работы экспедиционных групп и службы воинских подразделений, в экстренных ситуациях работы бригад скорой помощи и отрядов МЧС. Ими могут быть укомплектованы все ветеринарные службы: от клинических ветлабораторий до сельских ветпунктов, мобильные аптечки, необходимые в повседневной практике сельскохозяйственного производства. Главное преимущество разработанной технологии, заключается в ковалентном механизме конъюгирования биореагентов и углеродных частиц, что способно обеспечить перспективу разработки и широкое внедрение диагностикумов, сконструированных на ее основе.

ВЫВОДЫ:

1. Разработана одноэтапная технология синтеза белково-углеродных конъюгатов, предусматривающая гидрофилизирующую пептизацию углеродных наночастиц аффинным соединением, активацию гомобифункциональным реагентом и конъюгирование, осуществляемые единовременно. Эффективность разработанной технологии воспроизведена в 54-х синтезах.

2. Получаемые конъюгаты могут сохранять свои аналитические и эксплуатационные свойства в условиях хранения при +4оС - +8оС в течение 10-ти лет. Кратковременные (2 недели) отклонения в сторону повышения температуры хранения до +22оС не вызывают негативного влияния на свойства диагностикумов.

3. Обоснована универсальная система определения иммуноглобулинов класса G человека и животных, позволяющая с высокой чувствительностью и специфичностью определять любые лиганды, обладающие сродством к G белку стрептококка, использованного в качестве аффинного соединения диагностикума.

4. Обоснованы системы иммуноаналитического определения ХГЧ, стрептококков группы А, альфа-фетопротеина и трофобластического β-1-гликопротеина человека на основе антител. Охарактеризованы их аналитические параметры. Показана возможность качественного и полуколичественного определения лигандов в различных аранжировках: дот-анализ, иммунохроматография и иммунофильтрация.

5. Разработаны и апробированы универсальные методы определения различных лигандов (столбнячного и ботулинического анатоксинов, антител), основанные на свойствах и возможностях биотин-стрептавидинового взаимодействия, позволяющие различным образом аранжировать формат анализа. Показана возможность усиления результирующего сигнала, приводящая к увеличению чувствительности определения в раз.

Практические рекомендации

1.  Рекомендовать научно-производственным подразделениям, работы которых связаны с выделением и очисткой биологических макромолекул из биоматериалов, использовать углеродные тест-системы для определения IgG. Это позволит иметь постоянную оперативную информацию о контаминированности материала. Кроме того, станет возможным простой и достоверный контроль состояния сорбентов в случаях применения аффинной хроматографии.

2.  Рекомендовать специалистам в области экспериментальной иммунологии и ветеринарии использовать системы определения IgG для наблюдения за степенью сероконверсии при иммунизации животных в процессах получения антител, а также для оценки эффективности вакцинации.

3.  Рекомендовать специалистам Роспотребнадзора использовать системы экспрессного определения для оценки качества воды и пищевых продуктов.

4.  Рекомендовать научно-исследовательским лабораториям использование углеродных конъюгатов при конструировании систем анализа, основанных на принципах иммунного блоттинга, как более стабильных реагентов по сравнению с ферментными диагностикумами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

1. Физиология иммунной системы и экология // «Иммунология».-2001. - №3. - С.12-16.

2. , , Красных и применение универсальной тест-системы с использованием неферментных диагностикумов для безинструментального оценки уровня специфических антител // Биотехнология.- 2006.- №1.- С. 84-88.

3. Раев коллоидного углерода в качестве меток диагностических реагентов // Вестник уральской медицинской академической науки.- 2006.- №3(1).- С.202 – 205.

4. , , Николаева размера и концентрации циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по изотипам иммуноглобулинов // Вестник уральской медицинской академической науки№3(1). - С.107-109.

5. Раев коллоидного углерода в системах неинструментальной диагностики // Клиническая и лабораторная диагностика. – 2008. - №2. - С.44-49.

Статьи в журналах, сборниках, методические рекомендации для врачей.

6. Rayev М., Ambrosov I, Briko N. A novel method for the serodiagnosis of group A streptococcal antibodies. // Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology.-Plenum Press, New York and LondonV.418. - Р.327-329.

7. Ambrosov I, Rayev М., Briko N. A novel method for the primary diagnosis of group A streptococci from clinical specimens. // Streptococci and the Host. Ad. Thea Horaud at al. Advances in Experimental medicine and biology.-Plenum Press, New York and LondonV.418. - Р.323-325,

8. Особенности функционирования иммунной системы у работников нефтяной отрасли в регионах проведения технологических подземных ядерных взрывов // Сб. научных работ «Проблемы экспериментальной физиологии». Москва-ЕкатеринбургС.169-179.

9. Физиология иммунной системы и экология // ВИНИТИ Новости науки и техники, Серия: Медицина. Аллергология, астма и клиническая иммунология.-2000.- №8.-С.21-27.

10. Промышленное загрязнение окружающей среды и иммунная система // «Клиническая и прикладная иммунология»№1. - С.147-152.

11. Разработка новых тест-систем для неинструментального определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2. (Новый биотехнологический подход к диагностике) // Сборник «Научно-технический потенциал Западного Урала в области конверсии военно-промышленного комплекса». ISTC.-2001.-С.333-337.

12. , , , , Токмакова показатели иммунограммы детей и взрослых Пермской области // Справочно-методический материал для врачей, Пермь.-2002.

13. , , Черешнев наночастиц углерода в иммунодиагностике // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2007.-№3(17). - С.59-62.

Патенты

14. Метод стереоспецифического анализа и метод получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Патент РФ № 000 от 01.01.2001.

15. , Плаксин определения иммунореактивных соединений. Патент РФ № 000от 01.01.2001.

16. , , Орлова получения препарата альфа-фетопротеин сухой. Патент РФ № 000 от 01.01.2001.

17. Раев выделения и очистки альфа-фетопротеина. Патент РФ № 000 от 01.01.2001.

18. Раев получения конъюгата для стереоспецифического анализа. Положительное решение от 01.01.2001 о выдаче патента на изобретение по заявке № /15(031560).

19. , , Бахметьев выделения и очистки трофобластического β-1-гликопротеина. Положительное решение от 01.01.2001 о выдаче патента на изобретение по заявке № /15(000429).

20. Раев защиты и стабилизации твердофазных реагентов иммуноаналитических систем. Положительное решение от 01.01.2001 о выдаче патента на изобретение по заявке № /15(004097).

Тезисы докладов и статей.

21. Новые системы детекции стереоспецифических взаимодействий с использованием водонерастворимых красителей // Тез. докл. на международном симпозиуме «Проблемы загрязнения окружающей среды, токсикология», Пермь-Москва, 16-26 июля, 1991, стр. 246-247.

22. Новые подходы к неинструментальной экспресс диагностике // LXII Сессия общего собрания Академии мед. наук СССР, Москва, 19-23 марта, 1991.

23. А , , Кокшаров оценка критерий экологических групп риска детей // Тез. докл. международного симпозиума «Загрязнение окружающей среды, токсикология и эпидемиология». Москва-Пермь, 11-19 мая, 1993, стр. 126-127.

24. Вторичный иммунодефицит, индуцированный неблагоприятными условиями окружающей среды // Тез. докл. ICACI XV-EAACI'94, Стокгольм, Швеция, 1994, стр.1281.

25. Новые реагенты для неинструментального стереоспецифического анализа на основе суспензоидных углеродных частиц // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994.

26. Иммунные изменения у работников нефтяной отрасли в регионах проведения подземных ядерных взрывов // Intern. J. Immunorehabilitation, 1994, № 1.

27. Иммунологические последствия подземных ядерных взрывов. Урал атомный: наука, промышленность, жизнь // Тез. докл. II Международного симпозиума, Екатеринбург, Ин-т промышленной экологии Уральского отделения РАН, 1994, С. 53-54.

28. Тест-система для определения антител к ВИЧ–1,2 // Тез. докл. конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии», Пермь, 1994.

29. Chereshnev V., Kevorkov N., Bachmetyev B., Rayev M. B., Shilov Ju., Shirshev S. Secondary immunodeficiency induced by unfavourable environmental conditions. // Allergy & Clinical Immunology News, Suppl. № 2, 1994, P.195.

30. Иммунореабилитация экологических вторичных иммунодефицитных состояний // Intern. J. Immunorehab, 1995, № 1,

31. Иммунные и гематологические изменения у работников нефтяной отрасли в регионах проведения подземных ядерных взрывов // Тез. докл. XII Российской научной конференции, Челябинск, 1995, С. 115.

32. В. Черешнев, Н. Кеворков, Б. Бахметьев, М. Раев, Ю. Шилов, С. Ширшев.

Иммунореабилитация экологических вторичных иммунодефицитных состояний. Intern. J. Immunorehab, 1995, № 1.

33. Экологически стимулированный вторичные иммунодефицитные состояния // Международная конференция по нейроиммунным взаимодействиям и окружающая среда (ICONE”95), 17-24 июля, Санкт-Петербург, 1995, стр.102.

34. Новый метод прямой диагностики стрептококка гр. А. // Тез. докл. XIII Лэнсфилдского международного симпозиума по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, С. 258.

35. Новый метод для серодиагностики стрептококка гр. А // Тез. докл. XIII Лэнгсфилдского международного симпозиума по стрептококку и стрептококковым заболеваниям, Париж, Франция, 1996, С.259.

36. Влияние неблагоприятных условий окружающей среды на взаимоотношения возраста и иммунной системы детей // Тез. докл. 5 EFIT’96. Иерусалим, Израйль,1996.

37. Иммунологические критерии для оценки состояния здоровья населения при выраженной антропогенной нагрузке // Тез. докл. 2 конф. “Sustainable development: System analysis in Ecology”. Севастополь, Украина, 1996.

38. Тест-система для определения антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 // Тез. докл. AAAAI/AAI/CIS Joint Meeting. San Francisco, USA, 21-26 февраля, 1997.

39. Метод неинструментального стереоспецифического анализа на основе водонерастворимых цветных красителей // Доклад на 4м Национальном конгрессе «Человек и лекарства», Москва, 1997, С. 286-287

40. Исследование иммунной системы в сочетании с оценкой экологического влияния на человека // Доклад на 1м Национальном конгрессе Российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Москва, 1997, С.345.

41. Значение мониторинга иммунной системы для предупреждения ее функциональных нарушений в регионах промышленных // XIIIя Российская научная конференция, Челябинск, 1997, С.182-183.

42. Вторичные экологически обусловленные иммунодефициты. // Фридмановские чтения. Тез. докл. Всероссийской научной конференции, Пермь, 1988, сС. 142-143.

43. Принципы иммунокоррекции вторичных иммунодефицитов // 2я Национальная конференция российской ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Москва, 1998.

44. Влияние выраженной антропогенной нагрузки на функционирование иммунной системы населения // Тез. докл. 2й Международной конференции к 100-летию НПО «Биомед», Пермь, 1998.

45. Иммунотерапия и иммунореабилитация при вторичных иммунодефицитах // Тез. докл. Международной конференции «Загрязнение окружающей среды», Москва, 1998.

46. Новый метод идентификации CD-положительных клеток // The FASEB Journal, 1998, т.12, № 4, часть 1, стр. A617.

47. Многоцелевой стереоспецифический анализ на основе водонерастворимых цветных красителей // The FASEB Journal, 1998, т.12, № 4, часть 1, стр. A915.

48. Экологически индуцированные иммунные нарушения // Тез. докл. IIIй Междунар. конгресс по патофизиологии. Лахти, Финляндия, 1998.

49. Экология и иммунитет – патофизиологические аспекты // IIй Российский конгресс по патофизиологии, Москва, 2000, С.158.

50. Экология и иммунитет. // Аллергология и иммунология. 2000, Т.2, №3, С.11.

51. Неферментная система визуализации в неинструментальной диагностике // Доклад на Iй конференции иммунологов Урала. Екатеринбург, Россия, 2001.

52. , , . Безинструментальные методы неферментного стереоспецифического анализа // Тез. докл. на II конференции иммунологов Урала. Пермь, Россия, 2002.

53. ,. Г, , Тотолян метод оценки микроальбуминурии // Тез. 15 IFCC-FESCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 22 National Congress of the Spanish Society of Clinical Biochemistry and Molecular Pathology, Euromedlab Barcelona, Испания, 2003, С.156.

54. , ,. С, , Родионов оценка методов определения специфических антител к альфа-фетопротеину в сыворотке иммунизированных коз // «Медицинская иммунология», С.-Петербург, 2005, т.7, №2-3, С.279.

55. , , Родионов анализ использования линейного и градиентного ПААГ на примере исследования электрфоретической чистоты альфа-фетопротеина // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.76-77.

56. , , Орлова иммунизации коз для получения антител против альфа-фетопротеина человека в процессе серийного производства препарата «Профеталь» // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.119.

57. , , Родионов иммуноаффинной очистки альфа-фетопротеина и методы негативной иммуносорбции как способ их решения // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.122.

58. , , Родионов чувствительности различных методов определения специфических антител к альфа-фетопротеину в сыворотке иммунизированных коз // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.122-123.

59. , , К вопросу о способах синтеза иммуносорбентов для аффинной хроматографии белков фетоплацентарного комплекса // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С.123.

60. , , Родионов безинструментальных тест-систем для определения уровня специфических антител // «Цитокины и воспаление», Новосибирск, 2005, т.4, №2, С. 123.

61. , , Сибиряк иммунологических показателей у больных злокачественными опухолями при комбинированной и монотерапии препаратом «Профеталь» // Предварительные результаты. «Иммунология Урала», Уфа, 2005, № 1(4), С.159-161.

62. , , Красных универсальной тест-системы с использованием неферментного диагностикума для безинструментального определения уровня специфических антител // «Иммунология Урала», Уфа, 2005, № 1(4), С.192-194.

63. Раев подход к конструированию систем безинструментальной диагностики // Материалы Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия», Russian Journal of Immunology, Курск, 2006, V.9, №3, С.171.

64. Раев и полуколичественное определение белков репродукции методами неинструментальной диагностики // Russian Journal of Immunology, Сочи, 2007, V.9, supl. 4, Р.136-137.

Автор выражает искреннюю благодарность всем участникам работы, чей вклад адекватно отражен в совместных публикациях. Глубокую благодарность и безграничную признательность автор выражает своему Учителю – профессору, заслуженному деятелю науки РФ, д. м.н. Николаю Николаевичу Кеворкову Особую признательность и благодарность автор выражает своему первому руководителю, автору идеи и инициатору темы углеродных конъюгатов, к. м.н. Дмитрию Юрьевичу Плаксину, без которого бы эта работа не состоялась.