Исследование молекулярных эффектов тиазолидиндионов в эксперименте (стр. 1 )

На правах рукописи

КРИШТОПА

Анна Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ЭФФЕКТОВ ТИАЗОЛИДИНДИОНОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

МОСКВА

2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО "Ростовский государственный медицинский университет" Росздрава и Учреждение РАМН "Научный центр

биомедицинских технологий" РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор медицинских наук, профессор

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Ведущая организация: Кубанский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится "______" ________________2011 г.

в______часов на заседании диссертационного Совета Д 208.040.13 в ГОУ ВПО Первом Московском государственном медицинском университете ( Москва, ул. Трубецкая, стр.2)

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. ( Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан "_____ " ______________2010 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время 146,8 млн. жителей планеты (2,1%) страдают СД 2 типа. По прогнозам Международного института СД, к 2010 г. их число может составить более 200 млн. человек (3%). По данным ЭНЦ РАМН, в России 8 млн. человек (5% всего населения), страдают СД, из них 90% СД 2 типа (, 2001; , 2003). Смертность больных СД 2 типа в 2,3 раза выше, чем смертность в общей популяции.

В научной медицинской литературе представлены многочисленные данные о различной эффективности и безопасности применения сахароснижающих лекарственных средств, относящихся к разным классификационным группам по химическому строению и механизму действия (Chen N., 1992; Brunmair B. 2004). Интересные данные о новых фармакологических эффектах, в том числе, побочных эффектах, получены в ходе экспериментальных и клинических исследований эффективности и безопасности сахароснижающих лекарственных средств из группы тиазолидиндионов (Artwohl M., 2005; Chou, F., 2007).

Поиск причин новых доказательных фактов о различной эффективности и безопасности применения тиазолидиндионов, полученных в клинике, возможен только на основе стандартного протокола экспериментального фармакологического исследования и новых методов молекулярного тестирования лекарственных средств данной фармакотерапевтической группы, в том числе, с помощью инновационных систем для высокопроизводительного скрининга новых молекул-мишеней в диабетологии, а также на основе новых методов биомоделирования в экспериментальной фармакологии.

Известно, что в основе развития СД 2 типа лежит несколько генетических дефектов, представленных в эксперименте на основе биомоделирования: дефект в гене инсулина, проявляющийся снижением чувствительности рецепторов к инсулину периферических тканей, нарушением внутриклеточной передачи сигнала на пострецепторном уровне, а также генетически обусловленная экспрессия адипоцитокинов и антител к рецепторам инсулина.

Сахароснижающие лекарственные средства из группы тиазолидиндионов рассматриваются как препараты, повышающие чувствительность к инсулину и улучшающие функцию β-клеток поджелудочной железы. В механизме действия тиазолидиндионов рассматривается фармакологическая активация рецепторов PPARγ, вызывающая экспрессию нескольких генов и приводящая к возникновению целой палитры молекулярных эффектов, которые лежат в основе как необходимых терапевтических эффектов этих препаратов, так и НПР. Сегодня отсутствует информация о влиянии этой группы сахароснижающих лекарственных средств на экспрессию и взаимодействие ключевых молекул патогенеза СД 2 типа, которые определяют эффективность и безопасность применения тиазолидиндионов.

В связи с этим исследование, направленное на изучение молекулярных паттернов биологических жидкостей и тканей при применении тиазолидиндионов в условиях СД 2 типа на основе биомоделирования, единой технологии регистрации и экспериментального скрининга новых молекул – мишеней для разработки инновационных лекарственных препаратов, представляется крайне перспективным.

Диссертационная работа выполнена в УРАМН "Научный центр биомедицинских технологий" и ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и утверждена на заседании ученого Совета РостГМУ.

Цель работы: исследование молекулярных эффектов розиглитазона и пиоглитазона в эксперименте на основе биомоделирования СД 2 типа.

Задачи исследования:

1. Разработать модель аллоксанового СД 2 типа на основе аутбредной линии крыс Wistar и инбредной линии крыс AUG.

2. Провести исследование интегральных показателей жизнедеятельности, показателей шкалы изменений внешних признаков, шкалы изменения активности и гематологических параметров крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG с аллоксановой моделью СД 2 типа на фоне введения тиазолидиндионов.

3. Провести исследование гормонально-метаболической составляющей ФД - эффектов тиазолидиндионов в эксперименте.

4. Выполнить поиск фармакопротеомных профилей биологических жидкостей и тканей (кровь, моча, поджелудочная железа) крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG с аллоксановым СД 2 типа при введении розиглитазона и пиоглитазона.

5. Провести исследование ФК - параметров и разработку ФК/ФД - модели тиазолидиндионов на биомоделях СД 2 типа.

6. Разработать интегральные схемы межмолекулярных взаимодействий в биологических жидкостях и тканях на фоне введения тиазолидиндионов.

Научная новизна.

Впервые выполнено исследование гормонально - метаболической составляющей ФД - эффектов тиазолидиндионов на модели аллоксанового СД 2 типа у крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG.

Впервые в исследовании представлены сравнительный анализ особенностей ФК тиазолидиндионов и разработка ФК/ФД - модели для розиглитазона и пиоглитазона в условиях биомоделирования СД 2 типа.

В работе впервые выполнена сравнительная оценка молекулярных эффектов пиоглитазона и розиглитазона с помощью системы высокотехнологических биоаналитических методов исследования.

Впервые представлены схемы молекулярного механизма реализации ФД-эффектов тиазолидиндионов при СД 2 типа в условиях эксперимента, выделены новые молекулы для разработки перспективных сахароснижающих лекарственных средств (PXR, TLL2, CPB1, AMY2α, ELA3B) и молекулы, отвечающие за развитие НПР данной группы лекарственных средств (UMOD, PXR, KNG1).

Впервые в работе выполнен анализ молекулярных причин возникновения НПР розиглитазона и пиоглитазона.

Практическая значимость.

1. Экспериментальное исследование доказало наличие молекулярных маркеров эффективности и безопасности применения тиазолидиндионов в условиях экспериментального СД 2 типа.

2. Результаты фармакопротеомного анализа тиазолидиндионов и сравнительной оценки их ФК являются доказательной основой для разработки новых лекарственных средств и проведения качественных клинических испытаний сахароснижающих лекарственных средств в области диабетологии.

3. Предложены биомодели аллоксанового СД 2 типа на основе аутбредной линии крыс Wistar и инбредной линии крыс AUG для проведения доклинического тестирования новых сахароснижающих лекарственных средств.

4. В работе представлены новая система эффективных биоаналитических методов и технологий для проведения высокопроизводительного скрининга новых молекул-мишеней при создании перспективных лекарственных препаратов в диабетологии, а также новые технологии оценки эффективности и безопасности сахароснижающих лекарственных средств, рекомендуемые к внедрению в экспериментальную фармакологию.

5. Создана база данных новых молекул-мишеней для разработки современных средств лечения СД 2 типа и база данных молекул, отвечающих за развитие НПР тиазолидиндионов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика интегральных показателей жизнедеятельности, показателей шкалы изменений внешних признаков, шкалы изменения активности и гематологических параметров лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG свидетельствует о высокой эффективности и безопасности розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

2. Восстановление гормонально-метаболического профиля крови лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG происходит наиболее выражено на фоне введения розиглитазона.

3. Сравнительная оценка ФК тиазолидиндионов в эксперименте свидетельствует о формировании физиологической ФК/ФД – модели при введении розиглитазона.

4. Динамика функциональных групп белков плазмы крови, мочи и поджелудочной железы у лабораторных крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG на фоне введения пиоглитазона и розиглитазона отражает молекулярный механизм формирования различной эффективности и безопасности тиазолидиндионов.

5. Биоинформационный анализ спектра молекул белков плазмы крови, мочи и поджелудочной железы, обнаруженных в экспериментальном исследовании эффективности и безопасности тиазолидиндионов, позволяет выделить новые молекулярные мишени для разработки сахароснижающих лекарственных средств.

Внедрение результатов работы. Полученные результаты работы включены в материалы лекций и семинаров для студентов, интернов и ординаторов на кафедре фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ. Новые методы оценки эффективности и безопасности тиазолидиндионов внедрены в практику выполнения работ по экспериментальной фармакологии на кафедре фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертации обсуждены на конференции кафедры фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ. Материалы диссертации были доложены на 4-м Международном симпозиуме «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет-ресурсы» (г. Москва, 2007 г.), научно-практической конференции «Рациональная фармакотерапия: теория и практика применения лекарств» (г. Хабаровск, 2007 г.), III съезде фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.), XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2008 г.).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения, заключения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы, включающего 110 источников (из них отечественных - 9 источников, иностранных - 101 источник). Работа иллюстрирована 32 таблицами и 20 рисунками.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе, 3 статьи в рецензируемых журналах. Работа выполнена на базе кафедры фармакологии и клинической фармакологии РостГМУ (г. Ростов-на-Дону), центра протеомных исследований ИБМХ РАМН (г. Москва)[1].

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методы исследования

In vivo исследование выполнено на 116 лабораторных крысах - самцах аутбредной линии Wistar SPF line (56) и инбредной линии крыс AUG (60) SPF line одинакового возраста, сравнимого веса. Содержание крыс предполагало соблюдение требований GLP. Правила проведения экспериментального исследования учитывало директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС). Экспериментальное исследование выполнялось с разрешения Этического комитета РостГМУ. Нами были сформированы 2 контрольные группы крыс: I контрольная группа (n=10) - интактные крысы аутбредной линии Wistar без СД, II контрольная группа (n=10) – интактные крысы инбредной линии AUG без СД. Крысам контрольной группы вводили перорально изотонический раствор NaСl. Через 2 недели акклиматизации крысам линии Wistar (n=46) и AUG (n=50) вводился аллоксана тетрагидрат (Merk, США) внутривенно однократно в дозе 50 мг/кг в течение 2 недель.

В контрольных и исследуемых группах крыс через 5 дней после введения изотонического раствора NaСl и аллоксана тетрагидрата оценивали интегральные показатели - внешний вид, активность, симптомы интоксикации, прирост массы тела, потребление пищи и воды за сутки, диурез, гематологические показатели, параметры метаболического и электролитного профиля крови - глюкоза, мочевина, креатинин, ХС, мочевая кислота, ТГ, белок, альбумин, глобулин, билирубин, АСТ, АЛТ, ГГТ, ЛДГ, Са2+, Na+, фосфор, K+, Сl-, показатели СРО (МДА) и активности АОС (СОД, каталаза, ГР, ГПО, глутатиона), уровень гормонов (кортизол и инсулин) и пептидов (С-пептид, лептин), компонентов ЦТК (пируват, лактат, 2,3-ДФГ) и цепи дыхательных ферментов (ЦХО) в крови и эритроцитах, спектр белков плазмы крови и мочи. Условием включения биомоделей в эксперимент явилось увеличение уровня глюкозы до 18 ± 4 ммоль/л по отношению к исходному уровню. Крысы рандомизированы на 4 группы: I группа (n=24) - крысы линии Wistar с СД, которым вводили розиглитазон в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней; II группа (n=25) - крысы линии AUG с СД, которым вводили розиглитазон в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней; III группа (n=22) - крысы линии Wistar с СД, которым вводили пиоглитазон в дозе 3 мг/кг в течение 15 дней; IV группа (n=25) - крысы линии AUG с СД, которым вводили пиоглитазон в дозе 3 мг/кг в течение 15 дней.

В течение 24 часов после введения пиоглитазона и розиглитазона в исследуемых группах крыс осуществляли забор крови, регистрировались ФК-параметры тиазолидиндионов (Сmax, Tmax, Vd, AUC 0-24, T1/2). В спектре белков плазмы крови выполнялся анализ экспрессии CYP2C8, CYP2C9 и CYP3A4. Через 8 суток после введения пиоглитазона и розиглитазона крысам исследуемых групп и изотонического раствора NaСl крысам контрольных групп выполнялась оценка интегральных и гематологических показателей, параметров метаболического и электролитного профиля крови, показателей СРО и активности АОС, уровня гормонов и пептидов, компонентов ЦТК и цепи дыхательных ферментов в крови и эритроцитах, спектра белков плазмы крови и мочи. На «19» день эксперимента крысам контрольных групп осуществляли введение розиглитазона и пиоглитазона по схеме, соответствующей введению препаратов в исследуемых группах. Через 24 часа на «20» день эксперимента выполняли оценку интегральных показателей крыс, осуществляли забор крови и мочи, биоптатов поджелудочной железы крыс контрольных и исследуемых групп методом секционной биопсии для последующего фармакопротеомного анализа. Усыпление лабораторных животных осуществлялось этиловым эфиром. Биоптаты поджелудочной железы, образцы крови и мочи крыс перед процедурой пробоподготовки к фармакопротеомному анализу хранили в жидком азоте при температуре -80°С.

На «21» день исследования выполнялись оценка гематологических показателей, параметров метаболического и электролитного профиля крови, показателей СРО и активности АОС, уровня гормонов и пептидов, компонентов ЦТК, цепи дыхательных ферментов в крови и эритроцитах, фармакопротеомный анализ плазмы крови, мочи, биоптатов поджелудочной железы. Выполняли исследование ФК - параметров и построение ФК/ФД – моделей тиазолидиндионов.

Методы оценки гематологических показателей в эксперименте. Забор крови у крыс осуществляли из хвостовой вены. Анализ гематологических показателей выполнялся с использованием гематологического анализатора «Human» (Германия). Гематологические исследования в группах крыс включали показатели: количество лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, концентрация гемоглобина, гематокрит, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, средняя концентрация гемоглобина в эритроците, средний объем тромбоцита.

Методы исследования метаболического профиля крови крыс. Исследование метаболического профиля крови крыс в эксперименте проводили в плазме крови, используя стандартные наборы “DiaSys” (Германия). Определяли активность АСТ, АЛТ, ГГТ, ЛДГ, концентрацию глюкозы, ХС, ТГ, креатинина, мочевины, мочевой кислоты, общего белка, альбумина и глобулина. Общий билирубин измеряли наборами фирмы “Cormay” (Польша) на автоматическом биохимическом анализаторе “Targa BT 3000” (Италия).

Методы исследования электролитного профиля крови крыс. Исследование электролитного состава сыворотки крови (Na+, К+, Са2+) крыс контрольных и исследуемых групп проводили с помощью метода пламенной спектрофотометрии в модификации . Концентрацию Cl - в крови определяли меркуриметрическим методом с индикатором дифенилкарбазоном.

Контроль концентрации продуктов систем СРО - АОС. Концентрацию МДА в крови крыс определяли методом К. Yagi, активность каталазы - методом и соавт. на спектрофотометре «Thermo Electron Evolution» (США). Определение активности СОД проводили по способности фермента подавлять реакцию восстановления НСТ супероксидным анион - радикалом, генерированным in vitro в системе ксантин:ксантиноксидаза.

Определение содержания ГР, ГПО и глутатиона в крови и эритроцитах. Концентрацию глутатиона в крови определяли микрометодом и соавт. Исследование активности ГР в крови больных проводили по методу Hosoda и Nakamura, активности ГПО в эритроцитах проводили по методу . Регистрацию концентрации компонентов системы глутатиона проводили на спектрофотометре «Thermo Electron Evolution» (США).

Определение уровня продуктов гликолиза в крови крыс. ПВК определяли по Фридеману и Хаугену в модификации . Для определения лактата в крови крыс использовали ферментативный метод его определения со спектрофотометрической регистрацией количества образовавшегося НАД×Н. Для определения активности СДГ в лимфоцитах крыс применялся количественный цитохимический метод (анализатор Pentra 60, США). Для определения уровня 2,3 - ДФГ в эритроцитах использовался модифицированный метод Grisolia с соавт.

Определение активности цитохромоксидазы в эритроцитах крови крыс. Активность ЦХО в эритроцитах определяли спектрофотометрическим методом («Thermo Electron Evolution», США), который основан на измерении оптической плотности раствора восстановленного цитохрома С, имеющего максимум поглощения при 550 нм.

Исследования гормонального и пептидного профиля крови крыс. Для определения концентрации кортизола, ИРИ в сыворотке крови крыс применялся РИА на основе стандартных наборов РИА (В/О "Изотоп", Россия). Определение концентрации С-пептида, лептина проводилось методом конкурентного ИФА с помощью коммерческих наборов C-Peptide I, II (Rat) EIA (ALPCO Diagnostics, США) и Rat Leptin ELISA Kit (Cosmo Bio Co., LTD, Япония).

Фармакопротеомный анализ биообразцов крыс. Для разделения белков плазмы крови, мочи и поджелудочной железы применялись технологии SDS-PAGE и разделения белков в биологических жидкостях с помощью стандартных наборов, включающих 3 вида хроматографического разделения (MB-HIC C8 Kit, MB-IMAC Cu, MB-Wax Kit, Bruker, США). Получение масс-спектрограмм выделенных белков, полипептидных цепей и пептидов выполняли на основе MALDI-TOF-TOF-МС (прибор Ultraflex II, Bruker, США). Применяли пептидные (Mr в диапазоне от 700 до 4000 Дa) и белковые стандарты (Mr в диапазоне от 3000 до 45000 Дa). Идентификацию пептидного фингерпринта белков проводили в базе данных Mascot Search (Лондон, Великобритания).

Методы исследования фармакокинетики и построения ФК/ФД - модели тиазолидиндионов в эксперименте. Концентрации тиазолидиндионов в плазме крови крыс определялись с помощью ВЭЖХ/МС/МС-анализа (SURVEYORLC/SURVEYOR MSQ/LCQ DECA XP Max, «Thermo Finnigan», США) с применением внутренних стандартов Pioglitazone-d4 и Roziglitazone-d4 (BDG Synthesis Co, Великобритания). Регистрировались и рассчитывались ФК-параметры тиазолидиндионов (Сmax, Tmax, Vd, AUC0-24, T1/2). ФК/ФД - модели разработаны на основе физиологической модели.

Методы биоинформационного анализа результатов эксперимента. Исследование механизмов функционирования молекул биологических жидкостей и тканей крыс с СД 2 типа, выявление молекул - мишеней для действия новых лекарств выполнялись в базах данных: InterPro, Entrez, SWISS-PROT, OWL, NRDB, PROSITE, PRINTS, PDB. Данные о взаимодействиях и функции белков получены с помощью компьютерных программ STRING 8.1, STITCH.

Методы статистической обработки результатов эксперимента. Статистическую обработку материала исследования проводили на основе пакета статистических программ для биомедицинских исследований "Statistica 6.0" (StatSoft Inc., США). Результаты корреляционного анализа представлены коэффициентом ранговой корреляции Спирмена (r). Значимое различие между показателями контрольных и исследуемых групп крыс - 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика интегральных показателей жизнедеятельности крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Анализ динамики интегральных показателей жизнедеятельности крыс линий Wistar и AUG с СД 2 типа на «20» день эксперимента на фоне введения тиазолидиндионов показал, что восстановление показателей объема потребления пищи и воды, прироста массы тела и диуреза, показателей шкалы изменений внешних признаков и активности крыс происходило наиболее выражено в I и III группах крыс на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Зарегистрированы достоверные различия в средних значениях показателей потребления пищи (p<0,05) и воды (p<0,01) крысами II группы и крысами контрольной группы линии AUG. Отмечены достоверно высокие средние значения показателя потребления воды во II (p<0,001) и IV группах (p<0,001) крыс по сравнению со средними значениями этого показателя в контрольных группах крыс линий Wistar и AUG. Обнаружены более высокие средние значения показателя диуреза у крыс II и IV групп (II группа – p<0,01, IV группа – p<0,001) по сравнению со средними значениями данного показателя у крыс контрольной группы. Наблюдались межгрупповые различия в значениях основных показателей жизнедеятельности крыс I и III групп, доказавшие высокую эффективность розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

Динамика гематологических показателей крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Анализ динамики гематологических показателей крыс линий Wistar и AUG с СД 2 типа на «21» день эксперимента на фоне введения тиазолидиндионов показал, что достоверная реставрация основных показателей клеточного состава крови крыс до уровня показателей контрольных групп крыс происходила в I и III группах на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Средние значения гематологических показателей в I группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс, за исключением показателей количества эритроцитов (p<0,01), концентрации гемоглобина (p<0,01), средней концентрации гемоглобина в эритроците (p<0,05). Средние значения гематологических показателей во II группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс линии AUG, за исключением средних значений среднего объема эритроцитов (p<0,01), количества лейкоцитов (p<0,01), тромбоцитов (p<0,001), моноцитов (p<0,001), эозинофилов (p<0,001). Средние значения гематологических показателей в III группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс линии Wistar, за исключением средних значений количества эритроцитов (p<0,001), концентрации гемоглобина (p<0,001), уровня гематокрита (p<0,05), среднего объема эритроцитов (p<0,05), среднего содержания гемоглобина в эритроците (p<0,01), количества тромбоцитов (p<0,001), моноцитов (p<0,05), нейтрофилов (p<0,01), эозинофилов (p<0,01). Средние значения гематологических показателей во IV группе крыс достоверно отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс линии AUG, за исключением средних значений показателей концентрации гемоглобина, уровня гематокрита, среднего объема эритроцитов, количества лимфоцитов. Наблюдались межгрупповые различия в значениях гематологических показателей крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность и безопасность при введении крысам розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

Динамика параметров метаболического и электролитного профиля крови крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Анализ динамики биохимических показателей крыс линий Wistar и AUG с СД 2 типа на «21» день эксперимента на фоне введения тиазолидиндионов показал, что достоверное восстановление основных показателей биохимического профиля крови крыс до уровня показателей контрольных групп происходила в I и III группах крыс линии Wistar c СД на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Средние значения всех биохимических показателей в I группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс линии Wistar, за исключением показателя концентрации мочевины в крови (p<0,05). Средние значения биохимических показателей во II группе крыс не отличались от средних значений этих показателей в контрольной группе крыс линии AUG, за исключением, средних значений концентрации общего белка (p<0,01), концентрации глюкозы (p<0,01), мочевины (p<0,01), креатинина (p<0,05); достоверные различия в cредних значениях биохимических показателей в III группе крыс и крыс контрольной группы обнаружены по показателям концентрации ХС (p<0,05), Сl-(p<0,05), глюкозы (p<0,05), мочевины (p<0,01), билирубина (p<0,01) и Ca2+ (p<0,01) в крови крыс; обнаружены достоверные различия в cредних значениях всех биохимических показателей в IV группе крыс и крыс контрольной группы, за исключением показателей концентрации ХС, глобулина, ЛДГ, АСТ, концентрации фосфора, Na+. Выявлены межгрупповые различия в значениях биохимических показателей крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность и безопасность при введении розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном.

Динамика показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС у крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Показано, что на «21» день исследования достоверное восстановление показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС крови до уровня данных показателей контрольных групп крыс происходила в I и III группах крыс линии Wistar на фоне приема розиглитазона и пиоглитазона. Средние значения всех показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС во II группе крыс не отличались от средних значений аналогичных показателей в контрольной группе крыс, за исключением показателей концентрации ПВК (p<0,01), лактата (p<0,05). Достоверные различия в cредних значениях биохимических показателей в III группе крыс и крыс контрольной группы обнаружены по показателям концентрации каталазы, СОД, ГР, глутатиона, лактата в крови крыс, средние значения остальных показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС в III группе крыс не отличались от средних значений данных показателей в контрольной группе крыс. Обнаружены достоверные различия в cредних значениях всех показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС в IV группе крыс и крыс контрольной группы, за исключением показателя концентрации ГПО в крови. Наблюдались межгрупповые различия в значениях основных показателей работы звеньев ЦТК, цепи дыхательных ферментов и систем СРО-АОС крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном в отношении реставрации ключевых звеньев гликолиза и окислительно – восстановительных процессов в организме крыс с СД 2 типа.

Динамика показателей уровня гормонов и пептидов в крови крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Результаты оценки динамики средних значений уровня гормонов и пептидов в крови крыс линий Wistar и AUG контрольных и исследуемых групп в условиях СД 2 типа при введении тиазолидиндионов представлены на рис. 1,2.

I группа, «5» день	I группа, «21» день	III группа, «5» день	III группа, «21» день

 

Примечания. ` - недостоверные различия; * -р<0,05; ** - р<0,01.

Рис. № 1. Динамика показателей содержания гормонов и пептидов в крови крыс исследуемых групп на фоне введения тиазолидиндионов: линия Wistar.

II группа, «5» день	II группа, «21» день	IV группа, «5» день	IV группа, «21» день

 

Примечания. ` - недостоверные различия; * - р<0,05; ** - р<0,01.

Рис. № 2. Динамика показателей содержания гормонов и пептидов в крови крыс исследуемых групп на фоне введения тиазолидиндионов: линия AUG.

Показано, что наиболее быстрая и достоверная реставрация работы основных гормональных осей и параметров резервных возможностей поджелудочной железы крыс до уровня аналогичных показателей контрольных групп крыс происходила в I и III группах крыс линии Wistar c СД 2 типа, получавших розиглитазон и пиоглитазон. Наблюдались межгрупповые различия в значениях основных показателей работы гормональных и пептидных звеньев патогенеза СД у крыс I и III групп, показавшие более высокую эффективность розиглитазона по сравнению с пиоглитазоном в отношении восстановления звеньев регуляции уровня инсулина в крови крыс с СД 2 типа.

Фармакопротеомный профиль биообразцов крыс на фоне введения тиазолидиндионов

Для оценки молекулярных эффектов тиазолидиндионов выполнен биоинформационный анализ профиля белков крови, мочи и поджелудочной железы. Данные белки, согласно современным представлениям, принимают участие в патогенезе СД 2 типа и отражают эффективность и безопасность тиазолидиндионов на молекулярном уровне: 1) сыворотка крови - белки, регулирующие окислительно-восстановительные реакции (CYP3A4, CYP2C8, CYP2C9, PXR, GSTP1, GSTM1, СОД); белки, регулирующие процессы гидролиза (FAH, HDHPR); белки - участники ЦТК (FBP1, ТКТ, PK); белки – участники пентозо-фосфатного цикла Кальвина (ТК); белки, регулирующие клеточный рост, функцию нуклеосом, протоокогены, апоптотические белки (PPIA, p42 МАРK, GSTP1, СОД, GSTM1, CASP-3, CASP-9, HIST4H2AA); нейросекреторные белки (CHGB, PYGL); сократительные белки, отвечающие за полимеризацию актина, сократимость микротубул в цитозоле клеток (TPM1, PFN1, TUBB 5); белки – переносчики СЖК (FABP1); белки, предупреждающие нейродегенеративные процессы (PIN1, PPIA); белки, участвующие в передаче сигнала в иммунной системе (CTLA4, p42 МАРK, CASP-3, CASP-9); 2) моча - белки, регулирующие тонус сосудов и активность свертывающей и противосвертывающей систем крови (KNG 1, MUG 2, A1AT, KLK); белки, регулирующие коллоидно - осмотическое давление крови, связывающие биологически активные вещества крови и ксенобиотики, участники систем детоксикации (ALB, TBPA, CES-1); белки, регулирующие углеводный и липидный виды обмена, метаболизм костной ткани (PMF1); белки, регулирующие клеточный рост, участники реакций протеолиза в клетке, процессинга нейрогормональных факторов (TLL 2, MUG2, A1AT, INHBC); белки, участвующие в передаче сигнала в иммунной системе, белки клеточной адгезии, иммунного воспаления, супрессоры роста опухолевой ткани (UMOD, MUG2, Ig κ, CDH1, A1AT, OBP3); 3) биоптаты поджелудочной железы - амилоидогенные белки, белки свертывающей и противосвертывающей системы (PDIA 1, CPB1, PEBP, ENO1α, GRP 78); белки, регулирующие липидный обмен (PNLIP); белки прооксидантных и антиоксидантных систем (СОД, KRT8, PRDX6); белки, регулирующие углеводный и водно-электролитный виды обмена, процессинг гормонов, фолдинг белков (AMY2α, GRP 78, GRP 58, ATP6V1A, PCK2, PDIA 6); белки, регулирующие гидролиз в клетке (ELA3B, CPB1, CPA1, PEBP); белки, участвующие в передаче сигнала в иммунной системе, белки клеточной адгезии, иммунного воспаления, онкомаркеры (KRT8, TRA1); сократительные белки, отвечающие за полимеризацию актина, сократимость микротубул в цитозоле клеток (TUBB 5, SCGN, TUBA 1, ACT).

Результаты корреляционного анализа

Наиболее интересные закономерности динамики коэффициентов корреляции между показателями молекулярного профиля крови и мочи крыс в условиях биомоделирования СД 2 типа и на фоне приема тиазолидиндионов, характеризующиеся трансформацией вида корреляционной зависимости, зарегистрированы на «21» день эксперимента и представлены в таблицах 1,2.

Таким образом, назначение тиазолидиндионов сопровождалось особенностями динамики корреляций между значениями интенсивности экспрессии ключевых белков крови и мочи крыс каждой линии.

Таблица №1

Коэффициенты корреляции между показателями молекулярного профиля сыворотки крови крыс аутбредной линии Wistar и инбредной линии AUG контрольной и исследуемых групп на «21» день эксперимента

Показатель	r, коэффициент корреляции
CYP3A4, интенсивность экспрессии, усл. ед.
КГ Wistar AUG	I группа	II группа	III группа	IV группа
PXR, усл. ед.	-	-	-	-0,47*	-	-0,53**
GSTP1, усл. ед.	-0,37*	-0,34*	-0,15`	0,52**	-0,24`	0,58**
GSTM1, усл. ед.	-	-	0,34*	0,41*	-0,27`	-0,39*
CYP2C8, интенсивность экспрессии, усл. ед.
PXR, усл. ед.	-	-	-	-0,38*	-	-0,44*
GSTP1, усл. ед.	-0,44*	-0,45*	0,31`	0,41*	0,34`	0,50**
GSTM1, усл. ед.	-	-	-0,28`	-0,42*	0,22`	0,31`
CYP2C9, интенсивность экспрессии, усл. ед.
PXR, усл. ед.	-	-	-	-0,45*	-	-0,51**
GSTP1, усл. ед.	-0,45*	-0,48*	0,39*	0,55**	0,42*	0,59**
GSTM1, усл. ед.	-	-	-0,23`	-0,63**	0,26`	0,45*
СОД, усл. ед./мг белка	0,49**	0,47**	-0,44*	-0,28`	-0,47*	-0,25`
FBP1, интенсивность экспрессии, усл. ед.
ТКТ, усл. ед.	0,35*	0,38*	0,34`	0,35*	0,41*	0,39*
PK, усл. ед.	0,28`	0,26`	0,25`	0,39*	0,31`	0,43*
Лактат, усл. ед.	-0,16`	-0,18`	-0,18`	-0,25`	-0,37*	-0,46*
PPIA, интенсивность экспрессии, усл. ед.
HIST4H2AA, усл. ед.	-	-	0,22`	0,35*	0,42*	0,54**
p42 МАРK, усл. ед.	-	-	-0,28`	-	-0,45*	-
GSTP1, усл. ед.	0,28`	0,29`	0,19`	0,43*	0,28`	0,48**
CASP-3, усл. ед.	-	-	-	0,27`	-	0,38*
CASP-9, усл. ед.	-	-	-	0,45*	-	0,27`
PIN1, усл. ед.	-0,18`	-0,22`	-0,20`	-0,27`	-0,31`	-0,39*
TPM1, интенсивность экспрессии, усл. ед. экспрессии, усл. ед.
TUBB 5, усл. ед.	-	-	0,34`	0,42*	0,40*	0,43*
PFN1, усл. ед.	0,19`	0,21`	0,15`	0,33`	0,17`	0,37*
Глюкоза, ммоль/л	-0,16`	-0,17`	-0,23`	-0,19`	-0,19`	-0,17`
ИРИ, мкЕД/мл	-0,24`	-0,27`	0,22`	0,18`	0,35*	0,20`
С-пептид, нг/мл	-0,15`	-0,17`	0,28`	0,17`	0,32`	0,21`
CTLA4, интенсивность экспрессии, усл. ед.
CASP-3, усл. ед.	-	-	-	-0,56**	-	-0,31`
CASP-9, усл. ед.	-	-	-	-0,43*	-	-0,27`

Примечание. ` - недостоверные различия; * - достоверность связи при р<0,05, ** - достоверность связи при р <0,01.