Научные основы биотестирования с использованием инфузорий (стр. 2 )

Необходимо отметить, что уравнение "концентрация - время" удачно описы­вает экспериментальные данные в области больших и средних кон­цен­траций токсичных веществ. В области же малых концентраций могут наблюдаться отклонения экспериментальных данных от тео­ретической кривой. Мы склонны объяснять этот факт проявлением различных адаптационных механизмов клеток инфузорий, частично компенсирующих воздействие повреждающего фактора. Кроме того, при большом времени экспозиции (несколько часов и более) может воз­никать эффект десинхронизации культуры. Вследствие этого кри­вые, которые должны ассимптотически приближаться к оси ординат, на самом деле не пересекают некоторую вертикальную линию, за которой концентрация токсичного вещества настолько мала, что не вызывает гибели клеток.

Сравнение чувствительности к токсичным веществам тест-реакции гибели Colpoda steinii и высших животных показывает, что инфузории реагируют на концентрации на один-два порядка ниже, чем теплокровные. Об этом наглядно свидетельствуют материалы таблицы 1. В последней графе указана концен­трация токсичного вещества в экстракте исследуемого корма при соотношении экстрагента и навески пробы корма 5 : 1, полноте экс­тракции 100% и содержании токсина в пробе в количестве, приво­дящем к гибели 50% подопытных теплокровных животных, считая условно, что животное съедает в сутки количество корма, эквивалентное 10% своего веса.

Из материалов таблицы видно, что чувствительность данного тест-объекта к изученным токсичным веществам выше, чем у теплокровных животных. Таким образом, тест-реакция гибели инфузории Colpoda steinii может быть использована для анализа объектов внешней среды в области острой токсичности.

Таблица 1 – Оценка чувствительности тест-реакции гибели инфузории Colpoda steinii к токсичным веществам в сравнении с теплокровными животными

Вещество	Предел обнаружения, %	ЛД50, мг/кг ве­са тела	Содержание в экстракте, %
Cu2+	1,56.10-3	248,5	49,7.10-3
Cd2+	1,39.10-3	53,9	10,77.10-3
Hg2+	1,52.10-4	12,9	25,86.10-4
Мертиолат	4,93.10-4	75,0	150,0.10-4
2,4-Д	8,96.10-3	100,0	20,0.10-3
Этафос	1,81.10-3	250,0	50,0.10-3

Вторая тест-реакция, которую мы использовали в экспериментах, это тест-реакция хемотаксиса. В качестве тест-критерия нами было выбрано отношение показания прибора "Биотестер" в опыте к его показанию в контроле, выраженное в процентах. Данный тест-критерий характеризует относительное количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу оптической кюветы, содержащую анализируемый образец, по сравнению с контролем.

Показано, что количество клеток инфузорий, перешедших в верхнюю фазу кюветы, содержащую токсичное вещество, за определенный промежуток времени находится в зависимости от концентрации этого вещества (зависи­мость "концентрация - эффект"). В области, в которой тест-критерий находится в пределах 10-70%, данная зависимость может быть описана уравнением прямой линии. За пределами этой области наблюдаются отклонения экспериментальных данных от линии регрессии. В качестве характеристики токсичности вещества мы выбрали концентрацию этого вещества, при которой величина тест-критерия составляет 50%.

Сопоставление чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum со стандартными характеристиками токсичных веществ (таблица 2) показывает, что данная тест-реакция может быть использована для оценки объектов окружающей среды при работе с концентрациями некоторых токсичных веществ, приближающихся к области предельно допустимых концентраций.

Таблица 2 – Оценка чувствительности тест-реакции хемотаксиса инфузории Paramecium caudatum к токсичным веществам в сравнении с гигиеническими параметрами

Токсичное вещество	Cd2+	Cu2+	Zn2+	Фенол
ПДК, %	6,0.10-7	2,6.10-6	4,8.10-5	1,0.10-7
C50, %	8,0.10-5	6,6.10-5	8,3.10-5	7,1.10-3

В процессе экспериментов обе тест-реакции показали постоянные уровни чувствительности к изученным токсичным веществам, высокую экспрессность, информативность и удобство в использовании, что дает основания к рекомендации их для практического применения.

Воздействия на тест-систему

В общем случае ответные реакции формируются в тест-системе, как результат целого комплекса внешних воздействий. Основным из них, интересующим исследователя в первую очередь, является фактор исследуемого образца. Как правило, практические работники имеют дело с комплексным загрязнением исследуемых объектов окружающей среды. И ценность биотестирования во многом обусловлена возможностью проводить оценку интегральной токсичности объекта исследования. Однако проблема действия смесей токсичных веществ на живые организмы и, в частности, на инфузорий все еще остается недостаточно изученной. Поэтому важной частью нашей работы явилось исследование комбинированного воздействия различных токсичных веществ на используемые тест-системы. Были изучены бинарные смеси веществ с единым предполагаемым механизмом действия (катионы кадмия - катионы цинка, катионы кадмия - катионы меди) и смеси соединений, относящихся к различным группам токсичных веществ (катионы кадмия в сочетании с 2,4-Д, метафосом, фенолом, а также глутаровым альдегидом). В каждой серии опытов одно из двух веществ пребывало в постоянной концентрации и служило фоном, а концентрацию второго вещества мы меняли в некоторых пределах. Кривые “концентрация - время”, построенные по материалам исследований, позволили провести оценку характера комбинированного воздействия изученных бинарных смесей.

При этом удалось выявить два различных характера взаимовлияния токсичных веществ при их взаимодействии с тест-системой. Аддитивный тип взаимовлияния веществ наиболее ярко может быть продемонстрирован на примере раствора, содержащего катионы цинка и кадмия (рис. 3), а также катионы меди и кадмия. Токсический эффект, вызываемый смесью, складывается из токсических эффектов, вызываемых каждым компонентом такой смеси при их изолированном воздействии.

Фоновая концентрация катионов цинка: 1 - 0%; 2 - 0,8.10-3%; 3 - 1,25.10-3%;

4 - 1,7.10-3%.

Рисунок 3 – Комбинированное влияние катионов кадмия и цинка

на клетки Colpoda steinii

Происходит это, вероятно, по причине того, что механизм действия этих веществ на тест-систему един. При изменении концентрации фонового компонента кривая “концентрация - время” смещается вдоль оси абсцисс на величину, пропорциональную данному изменению (рисунок 4). При низких концентрациях фонового компонента данный процесс может быть описан формулой:

где: А - нормирующий коэффициент, b - коэффициент, определяющий токсикологическую широту действия основного компонента смеси, С1 - молярная концентрация основного компонента смеси, С2 - молярная концентрация фонового компонента смеси, Спр1 - предел обнаружения основного компонента смеси [моль/л], Спр2 - предел обнаружения фонового компонента смеси [моль/л].

1 - кривая “концентрация - время” при отсутствии Zn2+;

2 – кривая “концентрация - время” при фоновой концентрации Zn2+ 0,8.10-3%;

1` - отображение профиля кривой 1, иллюстрирующее аддитивный характер

взаимодействия катионов двух металлов

Рисунок 4 – Характер комбинированного воздействия катионов Cd2+ и Zn2+

При повышении концентрации фонового компонента до величин, близких к пределу обнаружения, эффект действия смеси был несколько ниже суммы эффектов влияния компонентов при их изолированном применении, что говорит об отклонении характера действия смеси катионов тяжелых металлов от аддитивности в сторону антагонизма. При этом изменялась токсикологическая широта действия смеси, что сопровождалось изменением абсолютного значения коэффициента “b” в показателе степени уравнения. По нашему мнению, это обусловлено повышением вклада фонового компонента в суммарный эффект действия смеси, а также конкуренцией катионов тяжелых металлов, возникающей в процессе их взаимодействия с молекулами-мишенями.

Характер взаимовлияния токсичных компонентов близкий к аддитивному был выявлен также при исследовании смесей метафоса с катионами кадмия, а также фенола с катионами кадмия. Токсикологическая широта действия смеси метафоса и катионов кадмия при введении метафоса, как фонового компонента, расширялась. О смеси фенола и катионов кадмия подобного заключения сделать не удалось ввиду того, что кривые “концентрация - эффект” при комбинированном действии этих двух веществ не соответствуют виду степенной функции.

Антагонистический тип взаимовлияния токсичных компонентов смеси был выявлен при исследовании смесей 2,4-Д с катионами кадмия, а также глутарового альдегида с катионами кадмия. Хотя результат действия смесей этих веществ и превышал эффекты от их изолированного влияния, он был меньше суммы этих эффектов. При этом токсикологическая широта действия смеси при изменении соотношения ее компонентов либо не изменялась, как в случае с 2,4-Д и катионами кадмия, либо уменьшалась (смесь глутарового альдегида и катионов кадмия).

Помимо токсичных соединений, присутствующих в исследуемом образце изначально, в процессе постановки биологического теста могут участвовать и иные вещества, так как хотя одни объекты окружающей среды, такие как природные и сточные воды, удается исследовать непосредственно, другие предварительно приходится переводить в действующую форму, которая может представлять собой экстракт, эмульсию либо суспензию. В связи с использованием в этих целях органических растворителей и ПАВ встает вопрос об их воздействии на тест-систему. Нами была изучена чувствительность инфузорий к органическим растворителям - этанолу, ацетону, ДМСО и поверхностно-активным веществам - твину-80, тритону Х-305, додецилсульфату натрия, неонолу П-6 и неонолу П-9-12. Полученные данные позволяют говорить о том, что для суспензирования не растворимых в воде токсичных веществ целесообразно применять этанол, ДМСО, ацетон, тритон X-305 и твин-80, так как эти вещества не обладают высокой токсичностью по отношению к инфузориям. Токсическое действие ДСН и поверхностно-активных веществ группы неонолов, напротив, ярко выражено. Но при использовании указанных растворителей и ПАВ для подготовки действующих форм необходимо учитывать их влияние на чувствительность тест-систем к токсичным веществам.

Таблица 3 – Комбинированное действие органических растворителей и токсичных веществ (Colpoda steinii, тест-реакция гибели)

Растворитель	Токсичное вещество
Наимен.	Конц-ия, %	Cd2+ Спр, %; b	Cu2+ Спр, %; b	Zn2+ Спр, %; b	фенол Спр, %; b
-	-	1,39.10-3; -3,24	1,56.10-3; -2,79	2,05.10-3; -1,79	38,5.10-3; -1,90
ДМСО	2,5.10-3	0,65.10-3; -2,26	1,28.10-3; -2,49	1,09.10-3; -1,64	30,3.10-3; -1,89
	50.10-3	0,49.10-3; -2,15	1,19.10-3; -2,47	0,95.10-3; -1,59	28,0.10-3; -1,88
ацетон	0,5	0,45.10-3; -1,85	1,07.10-3; -2,37	0,65.10-3; -1,53	36,7.10-3; -1,90
	2,5	0,32.10-3; -1,67	1,05.10-3; -2,36	0,48.10-3; -1,45	35,1.10-3; -1,90
	0,96	-	1,34.10-3; -2,79	-	-
этанол	1,90	0,58.10-3; -1,78	-	0,93.10-3; -1,61	26,9.10-3; -1,92
	3,20	0,51.10-3; -1,73	-	-	24,2.10-3; -1,91

Нами изучены комбинации растворов, содержащих фенол и катионы тяжелых металлов (кадмия, меди и цинка) в сочетании с ДМСО, ацетоном, этанолом, твином-80, ДСН и тритоном Х-305, использованными в качестве фонового компонента в концентрациях, которые при изолированном действии не вызывали заметного эффекта. Для каждой пары веществ были построены серии кривых “концентрация - время”, по этим кривым была проведена оценка характера комбинированного воздействия веществ. Во всех изученных сочетаниях токсичных веществ с органическими растворителями наблюдался эффект потенцирования, то есть эффект действия смеси значительно превышал сумму эффектов ее компонентов при их изолированном воздействии. При этом предел обнаружения токсичного вещества снижался в 1,5 - 4 раза. Токсикологическая широта действия при добавлении органического растворителя повышалась лишь у катионов тяжелых металлов, а у фенола статистически достоверных изменений не претерпевала (таблица 3).

Таблица 4 – Комбинированное действие ПАВ и токсичных веществ (Colpoda steinii, тест-реакция гибели)

ПАВ	Токсичное вещество
Наимен.	Конц-ия, %	Cd2+ Спр, %; b	Zn2+ Спр, %; b	фенол Спр, %; b
-	-	1,39.10-3; -3,24	2,05.10-3; -1,79	38,5.10-3; -1,90
Твин-80	2.10-3	0,45.10-3; -1,57	0,57.10-3; -1,43	18,3.10-3; -1,91
	20.10-3	0,28.10-3; -1,54	-	-
	0,2.10-3	1,06.10-3; -3,23	-	-
ДСН	2.10-3	0,56.10-3; -3,19	0,55.10-3; -1,45	25,8.10-3; -1,88
	20.10-3	-	-	18,0.10-3; -1,89
Тритон X-305	2.10-3	1,11.10-3; -3,23	0,59.10-3; -1,45	19,7.10-3; -1,65
	20.10-3	0,99.10-3; -3,24	0,41.10-3; -1,41	17,7.10-3; -1,63

Влияние поверхностно-активных веществ было во многом подобно действию органических растворителей. Во всех изученных смесях наблюдали эффект потенцирования. При этом предел обраружения изученных токсичных веществ снижался в 2-5 раз. Однако токсикологическая широта действия изменялась не во всех случаях. Так, тритон X-305 и додецилсульфат натрия не снижали коэффициент “b” для катионов кадмия, а твин-80 и додецилсульфат натрия не снижали этот коэффициент для фенола (таблица 4).