Научные основы биотестирования с использованием инфузорий (стр. 4 )

Третью группу внешних воздействий на тест-систему составляют "шумовые" факторы. Как правило, их воздействие обусловлено теми манипуляциями, которые производят с тест-системой в процессе осуществления ее контакта с исследуемым образцом. К ним относятся колебания температуры, изменения кислотности среды, осмотические воздействия и так называемый "ударный" эффект. Воздействие этих факторов на тест-систему обычно не приводит к значительному искажению результатов, однако определенный вклад в погрешность при определении тест-критерия они вносят. Поэтому, хотя эти факторы не всегда удается учитывать и устранять в процессе постановки биологического теста, следует принимать меры для их минимизации.

Разработка теоретической концепции биотестирования как метода научного исследования дала нам возможность перейти к ее практическому воплощению.

Практическая реализация научных основ биотестирования

Одной из задач, стоявших перед нами, явилась разработка нового, эффективного, экспрессного и недорогого биологического теста, с помощью которого можно было бы исследовать объекты внешней среды сельскохозяйственных птиц, такие как корма, вода и другие, а также внутренние среды организма птиц в условиях промышленного птицеводства. Поскольку новый биологический тест планировали использовать в условиях лабораторий птицефабрик и иных сельскохозяйственных предприятий, не приспособленных для осуществления ряда мероприятий по систематическому поддержанию культур инфузорий и не имеющих возможности использовать специальное дорогостоящее оборудование для наблюдения за некоторыми специфическими тест-реакциями, то такой биологический тест должен был иметь вид стандартного набора, содержащего готовую к применению тест-систему, а используемая тест-реакция доступна для наблюдения с помощью стандартных технических средств, имеющихся в любой лаборатории.

Эти условия дали нам ориентиры в поиске тест-организма. В первую очередь наше внимание привлекли те виды свободноживущих инфузорий, которые имеют в своем жизненном цикле стадию покоя и способны образовывать цисты покоя. Особый интерес в этом отношении представляют почвенные виды инфузорий. Один из них, Colpoda steinii, был выбран нами в качестве тест-организма. Среди признаков, присущих прочим инфузориям, данный вид обладает рядом уникальных свойств. Способность образовывать цисты покоя, устойчивые к высушиванию, и быстрый переход от стадии покоя к активной жизнедеятельности позволяют получать на основе культуры Colpoda steinii удобный в использовании сухой препарат-диагностикум с длительным сроком годности. А отсутствие стадии конъюгации в жизненном цикле и фа­зы старения в клональном цикле, специфика процесса деления макронуклеуса, в результате которого генетический материал, в отличие от большинства инфузорий, точно распределяется между дочерними вегетативными ядрами, а также тетраплоидность макронуклеуса на постцистной стадии жизненного цикла определяют относительное генетическое постоянство лабораторных штаммов данной инфузории и однородность ее культуры, полученной путем индуцированного проращивания цист покоя.

В ходе работ с данным видом выделен и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного НИИ ОЧБ штамм инфузории Colpoda steinii П-1. Изучены его морфологические и физиологические характеристики, жизненный цикл, охарактеризована чувствительность к токсичным веществам. Результаты этих исследований дали основания для разработки на основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 токсикологического диа­гностикума. Форма приготовления этого препарата предложена в виде так называемого токскита, сухого стандартного набора, содержащего живую тест-систему, предназначенную для токсикологических исследований.

Необ­ходимым этапом разработки технологии приготовления препарата явилось изучение кинетики роста смешанной культуры инфузории Colpoda steinii и бактерии Bacillus subtilis, представляющей собой систему типа "субстрат - жертва - хищник". Для математического описания этого процесса была выбрана система трех дифференциальных уравнений:

где: S - концентрация лимитирующего субстрата; X1 - концентрация жертвы; X2 - концентрация хищника; t - время; m1m - максимальная удельная скорость роста жертвы; m2m - максимальная удельная скорость роста хищника; KS - константа полунасыщения по лимитирующему субстрату; KX1 - константа полунасыщения по жертве; e0=1/aS - усвояемость лимитирующего субстрата жертвой; e1=1/aX1 - коэффициент хищничества (усвояемость жертвы хищ­ником).

Константы модели были определены в острых опытах, что позволило, задавая начальные условия и интегрируя систему в численном виде явным методом Рунге-Кутта четвертого порядка, предсказывать поведение смешанной культуры и управлять ее раз­витием. Эксперименты показали, что математическая модель достаточно точно описывает процесс культивирования смешанной культуры Colpoda steinii и Bacillus subtilis при температуре 22°C. Значительные отклонения экспериментальных данных от теоретических наблюдали лишь в последние часы эксперимента. Так, реальные концен­трации глюкозы и клеток Bacillus subtilis не достигали нуля, а кон­центрация трофонтов Colpoda steinii по достижении максимума начинала быстро убывать за счет формирования цист покоя. Но следует отме­тить, что максимальные концентрации организмов смешанной куль­туры полученной системой уравнений предсказываются верно, как и время достижения этих концентраций, что является ключевым моментом в практическом использовании модели. Отклонения эксперименталь­ных данных от теорети­ческих кривых мы склонны объяснять погрешностями при опреде­лении констант математической модели, измерении параметров процесса и некоторыми допущениями, принятыми при составлении модели. К последним относятся: предположение о постоянстве эко­номических коэффициентов (коэффициентов хищничества и усвояе­мости субстрата) и пренебрежение влиянием первого трофического звена на третье. Кроме того, модель не учитывает нелинейный ха­рактер зависимости скорости фагоцитоза инфузорий-седиментато­ров от концентрации бактерий, особенности процесса палинто­мического деления Colpoda steinii и ее способность образовывать цисты покоя. Приняв во внимание все эти моменты, можно сделать вывод, что полученная математическая модель позволяет предсказать поведе­ние системы и целенаправленно управлять ею и, следовательно, вполне применима на практике.

Проведенные исследования позволили отработать производственные режимы выращивания больших количеств культуры Colpoda steinii для приготовления препарата. Результаты экспериментов нашли отражение в технической документации на препарат и в патентной документации.

Еще одним важным звеном в разработке диагностического препарата явилось исследование процесса его хранения и создание комплекса мер по увеличению срока его годности. Полученные кривые выживания цист покоя Colpoda steinii в сухом состоянии показывают, что значительная доля инцистиро­вавшихся инфузорий в изученных условиях погибала в течение первых 20 суток хранения. Причем доля погибших цист зависела от вида носи% на ацетилцеллюлозной пленке и 71% на стекле). В дальнейшем кинетика гибели цист менялась. Скорость гибели цист была невелика и зависела от материала носителя. Из изученных вариантов условий хранения наилучшим является хранение цист покоя, сорбированных на аце­тилцеллюлозной пленке, в герметично закрытых флаконах в темном месте. В таком виде срок годности препарата составляет 24 месяца, что делает возможным его промышленное производство и коммерческое использование.

Разработанный препарат призван решить проблему экспрессной оценки интегральной токсичности кормопродуктов и воды, поступающих на птицефабрики, непосредственно в лаборатории предприятия-потребителя. Препарат прошел широкую проверку и внедрен в практику работы лабораторий ряда сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Ре­зультаты производственных испытаний подтвердили данные каме­ральных опытов и позволили сделать вывод о его пригодности для оценки кормов сельскохозяйственных животных на общую токсичность. Такой же вывод был сделан при независимой проверке препарата в Институте ветеринарной медицины УААН (г. Киев) и в НПЦ "Корм" (г. Санкт-Петербург).

Другой перспективной сферой применения биотестирования с использованием инфузорий является диагностика и мониторинг состояния организмов высших животных, а также их популяций путем исследования токсических свойств их внутренних сред. Применение разработанного нами препарата в этой специфической области позволило провести изучение динамики токсичности сыворотки крови кур в зависимости от их возраста в нормальных условиях, а также при различных заболеваниях и специальных технологических мероприятиях. Результаты исследования показали, что токсические свойства сыворотки крови кур находятся в зависимости от возраста, причем, возрастные изменения носят закономерный характер. Экстремальные внешние воздействия изменяют свойства сыворотки крови кур. Так, при профилактической вакцинации цыплят против болезни Гамборо и инфекционного ларинготрахеита токсичность сыворотки крови птиц увеличивалась в 3-4 раза уже на следующие сутки. Подобное явление наблюдали и при инфекционном процессе, вызванном мезогенным вирусом ньюкаслской болезни. Среднее значение регистрируемого параметра изменялось в 1,7 раза по сравнению с нормой. Таким образом, уровень токсичности крови птиц, а также статистический разброс этого параметра могут служить критерием для экспрессной диагностики общего состояния поголовья птиц в условиях промышленного птицеводства.

ВЫВОДЫ

1 Сформированы научные основы биотестирования, как метода анализа объектов окружающей среды. Они включают в себя:

- связную систему оригинальных определений основных терминов, используемых в биотестировании;

- схему постановки биологического теста, как процесса превращения материального потока, представленного исследуемым образцом и его действующей формой, в информационный, результатом которого является оценка исследуемого образца;

- описание внутренней структуры тест-системы, как центрального звена процесса биотестирования, и трех групп факторов внешних воздействий на тест-систему;

- пути оптимизации, стандартизации и управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

2 Даны обоснования к использованию инфузорий в качестве тест-объектов в биологических тестах, разработаны системы требований для отбора тест-организмов, тест-реакций и тест-критериев, наиболее пригодных для практического применения.

3 Выведена универсальная зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции гибели, и на ее основе получены характеристики токсичных веществ - предел обнаружения, определяемый как концентрация данного ве­щества в растворе, вызывающая гибель 50% клеток Colpoda steinii в течение 3 часов, и токсикологическая широта действия, характеризуемая коэффициентом в показателе степени уравнения "концентрация - время", а также самой тест-системы - индекс синхронизированности, представляющий собой отношение нормирующих коэффициентов в уравнениях "концентрация - время" для 100% и 50% гибели инфузорий. Чувствительность тест-реакции гибели Colpoda steinii к изученным токсичным веществам на 1-2 по­рядка выше таковой для теплокровных животных. Кривые "концентрация - время", характеризующие процесс взаимодействия тест-системы с токсичным веществом, описываются уравнением степенной функции, а морфологические изменения, происходящие в клетках во время интоксикации, носят специфический характер.

4 Выведена зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции хемотаксиса. Показано, что применение этой тест-реакции дает возможность исследовать интегральную токсичность объектов внешней среды с содержанием поллютантов на уровне, сравнимом с ПДК.

5 В результате изучения процесса комбинированного воздействия смеси токсичных веществ на культуру клеток инфузорий выявлены аддитивный и антагонистический типы взаимовлияния различных ксенобиотиков, выведены формулы, описывающие процесс взаимодействия смеси токсичных веществ с тест-системой при аддитивном типе взаимовлияния.

6 В результате исследования процесса комбинированного воздействия смеси токсичного вещества с органическими растворителями, а также с поверхностно-активными веществами на культуру клеток инфузорий выявлен эффект потенцирования. Показана принципиальная возможность использования органических растворителей и ПАВ в качестве функциональной нагрузки с целью управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

7 Сформирован комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем. Он включает использование депонированных штаммов инфузорий, обладающих стабильными генетическими и физиологическими характеристиками, синхронизацию тест-систем перед применением, регулирование чувствительности тест-системы с помощью функциональных нагрузок.

8 В результате практической реализации теоретических основ использования инфузорий в биотестировании выбран вид инфузории, обладающий рядом специфических свойств, обуславливающих его преимущества перед иными тест-организмами, выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован штамм Colpoda steinii П-1.

9 На основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 создана тест-система, обладающая по сравнению с существующими важными преимуществами - высокой чувствительностью к токсичным веществам, высокой степенью синхронизированности и постоянством генетических и физиологических характеристик.

10 Для управления процессом культивирования моноксеничной культуры инфузории Colpoda steinii использована математическая модель типа "субстрат - жертва - хищник", получены значения коэффици­ентов этой модели.

11 В результате изучения процесса хранения цист покоя Colpoda steinii в высушенном состоянии определены оптимальные условия их хранения и срок годности.

12 Разработан первый отечественный токскит на основе культуры инфузории Colpoda steinii, штамм П-1, со сроком годности более 2 лет. Препарат прошел широкие испытания и внедрен в практику работы лабораторий сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Метод оценки интегральной токсичности фуражного зерна и комбикормов с использованием препарата включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97, в Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р . Применение препарата в исследованиях внутренних сред организмов в промышленном птицеводстве является перспективным и может быть использовано при решении вопросов, связанных с регулированием условий содержания животных, проведением профилактических мероприятий, а также при создании различных систем прогнозирования экономических показателей сельскохозяйственных предприятий.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 , Виноходов токсикологичес­кой диагностики кормов // Ростовский ЦНТИ.

2 Па­тент № 000 Российской Федерации, МКИ5 C 12 N 5/00. Штамм инфузории Colpoda steinii для приготовления токсикологического диагностикума/ , - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 19с.

3 Патент № 000 Российской Федерации, МКИ5 G 01 N 33/18. Способ получения препара­та для токсикологических исследований объектов внешней среды/ , - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 19с.

4 Vinochodov D., Vinochodov V. Preparation for toxicological estimation of poultry fodder // International conference "Biotechno­logy St. Petersburg94". St. Petersburg, Russia, September 21-23, 1994: Program and abstracts. - SPb, 1994. - P. 97-98.

5 Виноходов исследования кормов с использованием инфузорий. – СПб: АВН, 19с.

6 Патент № 000 Российской Федерации, МКИ6 C 12 O 1/02, G 01 N 33/18. Способ определения токсич­ности объектов внешней среды/ , - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 19с.

7 , , Гинак как метод научного исследования // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 40-43.

8 , , Ананченко "концентрация - время" в острых опытах // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 73-78.

9 , Colpoda steinii как тест-организм // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 85-87.

10 , , Гинак токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ // Биоиндикация-98: Материалы Международной молодежной научной школы 21-28 сентября 1998. - Петрозаводск, 1998. - Т. 1. - C. 164-167.

11 Виноходов моделирование кинетики роста культуры инфузории Colpoda steinii в периодических условиях // Архив ветеринарных наукТ. 1(48). - C. 121-134.

12 , , Гинак общей токсичности зернопродуктов // 1-ый съезд токсикологов России 17-20 ноября 1998: Тезисы докладов. - М.: 1998. - C. 271.

13 , , Виноходов свойств сыворотки крови кур с использованием культуры простейших // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 275-278.

14 , Виноходов органических растворителей на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 229-232.

15 , Виноходов поверхностно-активных веществ на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 225-228.

16 , Виноходов токсигенных грибов, контаминирующих корма, при помощи инфузорий // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 266-269.

17 Виноходов наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii // Ветеринарная газета№ 2 (153). - C. 5.

18 , , Земляникина инфузорий в исследованиях внутренних сред высших организмов // Архив ветеринарных наукТ. 1(48), ч. 3. - C. 551-577.

19 Зерно фуражне, продукти його переробки, комбiкорми: Методи визначення токсичностi. ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Державний стандарт Украiни. Киiв: Держстандарт Украiнис.

20 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности. ГОСТ 13496.7-97. Межгосударственный стандарт. - МГС по стандартизации, метрологии и сертификациис.

21 , , Ивакина поверхностно-активных веществ на тест-реакции инфузорий // Биотехнология в ФЦП "Интеграция": Тезисы докладов заочной научно-практической конференции. - СПб: Изд-во СПбГТИ(ТУ), 1999. - C. 107-109.

22 Патент № 000 Российской Федерации, МКИ6 A 01 K 67/02, A 61 B 10/00, C 12 Q 1/02. Способ определения естественной резистентности организма птиц/ , , - М.: ФИПС, 19с.

23 , Виноходов поверхностно-активных веществ на тест-реакцию хемотаксиса Paramecium caudatum // Концептуальные вопросы питания населения и военнослужащих: Сборник трудов по материалам Всероссийской научной конференции, посвященной 45-летию научно-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения (25 мая 2001 год). - Санкт-Петербург, 2001, с. 46-49.

24 , Виноходов применения поверхностно-активных веществ в биотестах // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии: Материалы международной конференции молодых ученых (15 ноября 2002 г.), выпуск второй. - Тверь, 2002. - с. 20.

25 , Гинак токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ // Ветеринария в птицеводстве№1. - С. 9.

26 , , Виноходов -метод определения токсичности пищевых продуктов с использованием инфузории Colpoda steinii // Ветеринария в птицеводстве№3. - С. 26-29.

27 , Поляков в птицеводстве и ветеринарии: Введение в биотестирование // Ветеринария в птицеводстве№5-6. - С. 41-46.

28 Виноходов рекомендации по определению токсичности продуктов животноводства и кормов (микробиологический экс-пресс-метод) // Ветеринария в птицеводстве№5-6. - С. 49-54.

29 , Поляков микотоксинов методами биотестирования // Ветеринария в птицеводстве№5-6. - С. 47-48.

30 , , Виноходов биологической активности новых веществ экспрессными методами (на примере перхлоратных аммиакатов кобальта (III)) // Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (20-21 ноября 2003 года). - СПб: ВМедА, 2003. - С. 184-185.

31 , , Илюшина , реакционная способность активных форм кислорода и их деструктивная роль в процессах жизнедеятельности // VII Вишняковские чтения: Стратегия и тактика вузовской науки в регионе: Материалы международной научной конференции (Бокситогорск, 2 апреля 2004 г.). - СПб. – 2004. - С. 100-110.

32 , , Илюшина комплексообразования на свойства коразола // Химия и технология синтетических биологически активных веществ: Сборник трудов Всероссийской научно-технической конференции «Успехи в специальной химии и химической технологии». - М., 2005. - С. 58-62.

33 , Поляков ассоциированных токсикозов методами биотестирования // Международный вестник ветеринарии№1/ - C. 91-95.

34 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р . - М.: Стандартинформ, 20с.

35 Виноходов на культурах инфузорий в диагностической профилактике пищевых отравлений животных (обзор) // Ветеринарная патология№1. - С. 90-96.

36 , , Филимон чувствительности Paramecium caudatum к токсичным веществам от условий обитания // IV съезд Общества биотехнологов России им. (17–19 октября 2006 г.), Пущино, 2006.

37 , , Поляков экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Практик№2. - С. 26-31.

38 , Пожаров особенности токсикологических тестов с инфузориями // Известия СПбГЭ-ТУ «ЛЭТИ». Серия «Биотехнические системы в медицине и экологии»Вып. 3. - С. 60-67.

39 , , Виноходов экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Ученые записки Казанской академии ветеринарной медициныТ. 180. - С. 210-219.