В случае использования образцов антибактериальных покрытий, содержащих наночастицы металлов, необходимо на основе полученных изображений произвести подсчет поверхностной плотности наночастиц, их распределения по размерам. При наличии разных типов покрытий, содержащих одинаковые наночастицы, необходимо также провести анализ сравнения распределения наночастиц по размерам и их поверхностной плотности с данными об антибактериальной активности.
В случае использования композитных наноматериалов содержащих биологические молекулы необходимо произвести визуальный анализ структуры и оценить размеры отдельных кластеров наноматериала.
Отчет должен содержать:
1. Основные сведения по физическим основам электронной оптики.
2. Принципиальную схему электронного микроскопа.
3. Анализ экспериментальных результатов (словесное описание рельефа изображения; если было проведено фотографирование, то необходимо привести в отчете фотографию объекта исследования).
Тема 3: Метод динамического рассеяния света
Цель занятия: знакомство студентов с методом динамического рассеяния света.
Время занятия: 4 академических часа.
Необходимое оборудование: установка для измерения динамического рассеяния света (например, PHOTOCOR, Россия), набор образцов (суспензии наночастиц металлов, растворы полимеров, биологических молекул).
План работы:
Ознакомление студентов c теоретическими основами динамического рассеяния света
В отличие от классического метода статического (упругого) светорассеяния, в котором фиксируется усредненное значение интенсивности света, рассеянного растворами полимеров, частиц при разных углах наблюдения, в методе динамического рассеяния света (ДРС) изучается флуктуационная или динамическая составляющая интенсивности. В основе метода лежит изменение частоты рассеянного света в результате движения источников вторичных волн (эффект Допплера). Использование высококогерентных источников света (лазеров) позволяет определять спектр интенсивности с очень высоким разрешением, что и дает возможность изучать процессы с временами релаксации в диапазоне, характерном для конформационной динамики исследуемых образцов. Если разрешающая способность классической спектроскопии с использованием интерферометров не может превышать значений Δλ/λ~10-8, то в методе ДРС разрешение лимитируется лишь длительностью измерений, так как измеряется не абсолютное значение частоты спектральных гармоник регистрируемого излучения, а значение частоты биений между этими гармониками и опорной световой волной (метод гетеродинирования) или друг с другом (метод гомодинирования).
Использование метода оптического гомодинирования позволяет определить корреляционную функцию интенсивности рассеянного света. В отличие от метода оптического гетеродинирования, когда сравнивается опорный (падающий на образец) пучок и рассеянный свет, в методе гомодинирования (метод самобиений) на фотоумножитель падает только свет, рассеянный образцом. На автокорреляторе происходит перемножение сигналов, отстоящих во времени на величину t, кратную заданному в эксперименте интервалу Dt (времени задержки). Таким образом получают корреляционную функцию интенсивности рассеянного света:
G(2) (t) =<I(0)I(t)>.
Считая движения частиц в растворе независимыми, с точностью до членов порядка 1/N, где N – число рассеивателей, мы можем воспользоваться соотношением Зигерта:
g(2) (t) = 1 +b êg(1) (t)ê2 ,
где g(2)(t)=G(2)(t)/G(2)(∞) — нормированная корреляционная функция рассеяния, G(2)(∞) — экспериментально определяемая базовая линия (значение G(2) при t®¥) , b — фактор когерентности, связанный с параметрами установки, g(1) (t) — нормированная корреляционная функция поля: g(1)(t)=G(1)(t)/G(1)(0), где Gсоответствует значению функции G(1)(t) при t=0.
Автокорреляционная функция поля (АКФ) g(1)(t) несет информацию о разных типах релаксационных процессов в системе:
g(1) (t) = ∑ Aiexp(-t/ti),
где Ai — амплитуда, ti — характерное время (время релаксации) i —го релаксационного процесса. Представление g(1)(t) в виде суммы экспонент с последующим вычислением значений ti для каждого релаксационного процесса является некорректной задачей. Существуют разные способы обработки данных, полученных методом ДРС, в частности, использование пакетов программ CONTIN, DynaLS. В результате могут быть построены спектры времен релаксации. В идеале такой подход позволяет, например, получить информацию о разных типах движения в макромолекуле: поступательном, вращательном и внутреннем движении отдельных сегментов полимера. Однако вычленить последнюю составляющую чрезвычайно трудно и в настоящее время практически невозможно, так как этот тип движения вносит лишь небольшой вклад в суммарный сигнал по сравнению с движением молекулы как целого.
Принято считать, что в разбавленных растворах монодисперсных частиц при условии q<R2>1/2 <<1, где <R2>1/2 — среднеквадратичный радиус инерции, q-значение волнового вектора, q=(4pn/l)sin(J/2), J — угол рассеяния, n - показатель преломления среды) автокорреляционная функция поля (АКФ) связана с поступательной диффузией:
g(1)(t)=exp(-t/t)=exp(-Гt)=exp(-Dtq2t),
где t — время релаксации рассматриваемого релаксационного процесса, Г =1/t — скорость релаксации, Dt — коэффициент поступательной диффузии. Для определения Dt проводят экстраполяцию зависимости функции распределения Г от q2 и из наклона при q®0 определяют Dt. По величине Dt обычно определяют так называемый гидродинамический радиус частицы Rh (при этом полагают, что частица представляет собой непроницаемую сферу радиусом Rh):
Dt = kT/f =kT/6ph0Rh,
где f — коэффициент поступательного трения сферы. Согласно формуле Стокса, f = 6ph0Rh, h0 — вязкость растворителя.
Понятно, что такой подход представляет собой чрезвычайно грубую аппроксимацию для растворов макромолекул. Однако в случае частиц с формой, близкой к сферической использование величины Rh позволяет получать достоверную информацию об их размерах.
Следует отметить, что, как это уже отмечалось выше, в общем случае в системе могут присутствовать различные релаксационные процессы, а автокорреляционная функция поля является взвешенной суммой индивидуальных вкладов. При непрерывном распределении по t:
g(1)(t) = 
,
где A(t) — функция распределения по t интенсивности рассеянного света.
Несмотря на целый ряд проблем, возникающих при обработке данных, полученных методом ДРС, этот метод имеет целый ряд преимуществ по сравнению, например, с методом статического рассеяния света (СРС). Во-первых, несмотря на высокие требования к степени очистки образцов, в методе ДРС этот фактор не играет столь значительной роли, как в СРС. Кроме того, метод ДРС позволяет определять параметры частиц в случае коллоидных и дисперсных систем. Таким образом, это значительно расширяет возможности исследователей при изучении объектов, не образующих молекулярные (истинные) растворы, например образцы, содержащие наночастицы.
На рисунке 5 представлена схема спектрометра динамического рассеяния света фирмы Photocor (Россия).
Рисунок 5 — Схема спектрометра Photocor Complex и его изображение
Photocor Complex собран по традиционной схеме спектрометра динамического рассеяния света, предназначенного для многоугловых измерений динамического и статического рассеяния света и измерения размеров наночастиц.
На жестком основании (6) смонтированы прецизионный гониометр (10) и оптическая скамья (5), на которой размещены He-Ne лазер (1) и фокусирующий узел (3). Термостат (7) и адаптер кювет (8) установлены на гониометре коаксиально с его осью. На поворотной консоли (11) гониометра располагается фотоприемный блок (14), в состав которого входит приемная оптическая система (13) со сменной диафрагмой выбора апертуры (12), малошумящий фотоумножитель, работающий в режиме счета фотонов, быстрый усилитель-дискриминатор (15) со сквозным по постоянному току трактом и специальный высоковольтный источник питания ФЭУ без паразитных корреляций. Сигнал с выхода фотоприемного блока анализируется одноплатным многоканальным коррелятором, который вставляется непосредственно в один из разъемов материнской платы персонального компьютера. С помощью компьютера осуществляется управление процессом измерения и обработка результатов измерения.
Порядок выполнения практической части работы со спектрометром динамического рассеяния света
Студент должен:
1. Внимательно ознакомиться с устройством предложенного для выполнения работы спектрометра динамического рассеяния света.
2. Ознакомиться с интерфейсом предложенного программного обеспечения для управления спектрометра и обработки данных.
3. Произвести измерения для предложенного образца. Измерения необходимо произвести для 3–5 углов рассеяния.
4. Произвести обработку данных и получить времена релаксации.
5. Произвести вычисления коэффициентов поступательной диффузии и соответствующих размеров.
6. Построить график зависимости коэффициентов диффузии (или обратных значений времен релаксации) от угла рассеяния.
7. Вычислить значения коэффициента диффузии при угле рассеяния стремящемя к нулю.
8. На основании полученных данных произвести анализ содержащихся в образце фракции.
9. Составить отчет о проделанной работе.
В качестве образцов лучше всего использовать водные растворы (суспензии, взвеси) наночастиц, с разными известными значениями размеров (полидисперсные). В этом случае, на основании обработки результатов измерений можно будет сделать выводы как о распределении наночастицпо размерам, так и о примерном соотношении концентраций каждого размера наночастиц в образце.
Отчет должен содержать:
1. Основные сведения по физическим основам динамического рассеяния света.
2. Принципиальную схему спектрометра динамического рассеяния света.
3. Анализ экспериментальных результатов (расчеты распределения частиц по концентрациям и размерам в исследуемой системе)
Тема 4: Метод сканирующей зондовой микроскопии на примере атомно-силовой микроскопии
Цель занятия: знакомство студентов с методом атомно-силовой микроскопии.
Время занятия: 4 академических часа.
Необходимое оборудование: сканирующий-зондовый микроскоп (например из линейки фирмы VEECO, USA или НТ-МДТ, Россия), набор образцов для исследования (биологические молекулы, наночастицы, образцы композитных наноматериалов).
План работы:
Ознакомление студентов c теоретическими основами атомно-силовой микроскопии
Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) — один из мощных современных методов исследования морфологии и локальных свойств поверхности твердого тела и различных микро - и нано-объектов с высоким пространственным разрешением. За последние годы сканирующая зондовая микроскопия превратилась из методики, доступной лишь ограниченному числу исследовательских групп, в широко распространенный и успешно применяемый инструмент для исследования. Именно развитие сканирующей зондовой микроскопии послужило основой для развития новых методов в нанотехнологии.
Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ) — первый из семейства зондовых микроскопов — был изобретен в 1981 году швейцарскими учеными Гердом Биннигом и Генрихом Рорером из исследовательской лаборатории IBM в Цюрихе. Настоящее признание данная методика получила после визуализации атомарной структуры поверхности ряда материалов и, в частности, поверхности кремния. В 1986 году за создание туннельного микроскопа Г. Биннигу и Г. Рореру была присуждена Нобелевская премия по физике.
За туннельным микроскопом в течение короткого времени были созданы атомно-силовой микроскоп (АСМ), магнитно-силовой микроскоп (МСМ), электросиловой микроскоп (ЭСМ), ближнепольный оптический микроскоп (БОМ) и многие другие приборы, имеющие сходные принципы работы и называемые сканирующими зондовыми микроскопами. СЗМ — на сегодняшний день наиболее простые в использовании и удобные приборы для «прямого» наблюдения поверхностей и наноструктур различного характера и природы.
Принцип работы сканирующих зондовых микроскопах основывается получении характеристик взаимодействия специальным образом приготовленных зондов в виде игл с поверхностью образца. Рабочая часть таких зондов (острие) имеет размеры порядка 10 нанометров.
Характерное расстояние между зондом и поверхностью образцов в зондовых микроскопах по порядку величин составляет 0,1–10 нм. В основе работы зондовых микроскопов лежат различные типы взаимодействия зонда с поверхностью. Работа туннельного микроскопа основана на явлении протекания туннельного тока между металлической иглой и проводящим образцом; различные типы силового взаимодействия лежат в основе работы атомно-силового, магнитно-силового и электросилового микроскопов. На рисунке 6 представлена блок-схема устройства сканирующего-зондового микроскопа.
Рисунок 6 — Схема устройства сканирующего-зондового микроскопа
Основой метода атомной силовой микроскопии (АСМ) является определение силы взаимодействия между образцом и иглой, острие которой имеет радиус кривизны порядка нескольких нанометров, в процессе сканирования поверхности образца. Игла располагается на конце упругой пластинки – кантилевера (левера), см. рисунок 7.
Рисунок 7 — Микрофотографии зондов для сканирования в методе атомно-силовой микроскопии
Система игла-кантилевер помещается над образцом, который расположен на твердой подложке. Подложка размещается на пьезоманипуляторе.
В процессе сканирования игла перемещается строка за строкой над определенным участком поверхности заданной площади. Площадь сканирования определяется числом прописываемых строк, их длиной и расстоянием между ними. Движение подложки с образцом относительно иглы осуществляется при помощи пьезоманипулятора в результате изменения его размеров в трех направлениях под действием разности потенциалов, приложенной к трем управляющим электродам на его поверхности (соответствующим X, Y и Z координатам). При движении иглы система обратной связи стремится сохранить величину силы взаимодействия (которая зависит от относительного расстояния игла-образец — d) на заданном уровне. Иными словами, фиксируется расстояние d. При этом может осуществляться регистрация в реальном масштабе времени сигнала обратной связи.
Обычно используют два основных режима сканирования: режим постоянного контакта и режим прерывистого контакта. В режиме постоянного контакта механическая система сближает иглу и образец до контакта. При контакте происходит изгиб кантилевера, величина которого фиксируется прецизионным датчиком по смещению луча на 4-х секционном фотодиоде. По величине изгиба кантилевера определяют контактную силу, а поддерживание ее величины на заданном уровне с помощью системы обратной связи позволяет «прописать» в процессе сканирования профиль поверхности.
В большинстве атомно-силовых микроскопов для фиксации силы, как правило, используют оптические датчики изгиба кантилевера, работающие по следующей схеме: лазерный луч падает под углом на поверхность кантилевера и отражается в центре четырехсекционного фотодиода. При изгибе кантилевера в нормальном или тангенциальном направлении по отношению к поверхности или при возникновении торсионного отклонения возникает разница между сигналами соответствующих участков фотодиода: верхний/нижний сегменты или правый/левый сегменты соответственно. Разностный сигнал правых и левых сегментов фотодиода, отображающий величину тангенциальных сил (сил трения), действующих на иглу при сканировании, выводится на компьютер и отображается на экране монитора. Разностный сигнал верхних и нижних сегментов фотодиода сравнивается с опорным сигналом. Их разность усиливается и подается на Z электрод пьезоманипулятора. Это приводит к смещению образца в вертикальном направлении (Z-координата). Одновременно сигнал обратной связи поступает на компьютер и отображается на экране монитора, неся информацию о топографии поверхности.
Рисунок 8 — Четырехсекционный фотодиод, используемый в качестве оптического датчика в сканирующих-зондовых микроскопах
Если обозначить исходные значения фототока в секциях фотодиода через I01, I02, I03, I04, а через I1, I2, I3, I4 — значения токов после изменения положения консоли, то разностные токи с различных секций фотодиода ΔIi = Ii‑I0i будут однозначно характеризовать величину и направление изгиба консоли зондового датчика АСМ (см. рисунок 8).
Недостатком режима постоянного контакта является то, что в процессе сканирования возникают силы, способные разрушить молекулы образца или перемещать их с места на место. Для преодоления этих недостатков используется режим прерывистого контакта.
В режиме прерывистого контакта игла совершает колебательные движения по координате Z, лишь в нижней точке своей траектории касаясь образца. В рассматриваемом режиме работы АСМ дополнительный пьезоманипулятор возбуждает вынужденные вертикальные колебания кантилевера на его резонансной частоте вдоль оси Z. При сближении зонда и образца амплитуда колебаний будет уменьшаться — размах колебаний будет ограничиваться соударениями с образцом. Таким образом, поскольку амплитуда колебаний будет зависеть от среднего (по периоду колебаний) значения расстояния зонд-образец, то фиксация ее на заданном уровне в процессе сканирования позволит прописать профиль поверхности. Сигнал обратной связи, осуществляющий фиксацию амплитуды колебаний, и в этом случае будет нести информацию о профиле поверхности. Существует также возможность фиксации сигнала, отображающего сдвиг фаз между вынужденными колебаниями кантилевера и вынуждающей силой. Сдвиг фаз в резонансе составляет величину π/2 (это значение соответствует отсутствию контакта иглы с образцом при колебаниях). При сближении иглы и образца система частично выходит из резонанса, поскольку включается дополнительная упругая сила — сила отталкивания иглы и образца при контакте, наличие градиента которой сдвигает резонансную частоту. Это вносит вклад в сдвиг фаз и сказывается на уменьшении амплитуды колебаний. С другой стороны, наряду с упругими (недиссипативными) взаимодействиями, контактное взаимодействие зонда и образца характеризуется и неупругими процессами, приводящими к диссипации энергии колебаний кантилевера. Неупругие процессы также уменьшают амплитуду колебаний, но не вносят вклада в сдвиг фаз. Таким образом, сигнал отображает баланс вязко-упругих свойств исследуемой поверхности.
Преимуществом метода атомно-силовой микроскопии при исследовании рельефов поверхности образцов по сравнению с другими методами, например, электронной микроскопии, являются во-первых возможность исследования в комнатных условиях, то есть без создания вакуума, во-вторых, возможность исследования образцов не только на воздухе, но и в жидкости, не прибегая к особых ухищрениям, а лишь используя специальные ячейки для помещения образца.
Вторая особенность весьма важна для изучения биологических объектов.
Приготовления образцом для метода атомно-силовой микроскопии заключается в случае крупных объектов при изучении их поверхности в их размельчении до размеров, пригодных для помещения в измерительную часть прибора, а в случае мелких объектов (наночастиц, полимеров, биологических молекул) в их высаживании на атомарно гладкую подложку, например расщепленную слюду, графит.
Порядок выполнения практической части работы с атомно-силовым микроскопом
Студент должен:
1. Внимательно ознакомиться с устройством предложенного для выполнения работы атомно-силового микроскопа.
2. Ознакомиться с интерфейсом предложенного программного обеспечения для управления атомно-силовым микроскопом и обработки данных.
3. Произвести измерения предложенных образцов в режимах постоянного или прерывистого контакта на выбор преподавателя.
4. Произвести обработку полученных изображений и сделать оценку структурных особенностей образцов.
5. Произвести измерения размеров в латеральном и вертикальном направлениях характерных структур образцов.
6. Составить отчет о проделанной работе.
В качестве образцов лучше выбирать наночастицы, высаженные на поверхность, либо биологические молекулы. В этом случае возможно проведения как качественных так и количественных оценок, например, проведение характеризации распределения по размерам наночастиц в образце. Возможно использование идентичного образца использованному в работе по изучению метода динамического рассеяния света. В этом случае возможно произвести сравнение результатов, полученных двумя разными методами.
В случае использования образцов наноматериалов для стоматологии или костной хирургии возмоджно сравнение с данными метода электронной микроскопии. В этом случае интересным представляется сравнение полученных морфологических особенностей поверхности образцов, полученных двумя разными методами.
Отчет должен содержать:
1. Основные сведения по физическим основам метода атомно-силовой микроскопии.
2. Принципиальную схему атомно-силового микроскопа.
3. Анализ экспериментальных результатов (в зависимости от предложенных образцов – количественный или качественный анализ).
РАЗДЕЛ II Изучение структуры и свойств биосовместимых композитных наноматериалов на примере простейших систем
Тема 5: Получение композитных наноматериалов на основе биологических молекул: ДНК-компактизация
Цель занятия: получение прототипа композитного наноматериала на основе биологичесих молекул — компактных структур ДНК
Время занятия: 4 академических часа.
Необходимое оборудование: образцы ДНК (из тимуса теленка, эритроцитов цыплят, плазмидная ДНК), конденсирующие агенты (спермин, спермидин, гексамин кобальта, полилизин), оборудование для пробоподготовки
План работы:
Ознакомление студентов c теоретическими основами ДНК-компактизации
Молекула ДНК, являясь носителем генетической информации, выполняет уникальные функции в биологических системах. Она является полиионом с чрезвычайно высокой плотностью заряда и большой термодинамической жесткостью. Вместе с тем, вирусная ДНК представляет собой плотноупакованную структуру, в десятки тысяч раз более компактную, чем в растворе. В бактериальных клетках и ядрах эукариот ДНК сжата меньше, однако все равно находится в чрезвычайно компактном состоянии и достаточно упорядочена, что обеспечивает эффективную репликацию генома. Подобные конформации ДНК in vivo в значительной степени поддерживаются многовалентными катионами и положительно заряженными белками. Для высокомолекулярной ДНК в растворе в ряде случаев наблюдается конденсация ДНК в компактные частицы определенной морфологии. В отличие от компактизации, под которой подразумевают любое существенное уменьшение объема макромолекулы, конденсация — это процесс формирования отдельных дискретных частиц определенного размера и формы. Таким образом, интерес к явлению конденсации ДНК обусловлен, прежде всего, вопросом упаковки ДНК в биологических системах. Однако в последние годы, благодаря быстрому прогрессу в развитии генетической инженерии, интерес к изучению конденсации ДНК в растворе обусловлен также и необходимостью создания биологических комплексов для решения задач о направленной передаче генетической информации в клетку.
Для высокомолекулярной ДНК в растворе характерна конформация статистического клубка достаточно большого объема. Однако, в ряде случаев наблюдается конденсация ДНК при ее взаимодействии с положительно заряженными лигандами, имеющими заряд 3+ и выше. Наиболее известными конденсирующими агентами являются природные полиамины (спермин, спермидин), неорганический ион гексаминкобальта. Среди других конденсирующих агентов можно выделить полипептиды, такие как полилизин, гистоны Н1 и Н5. Двухвалентные ионы металлов могут вызывать конденсацию ДНК в водноспиртовых растворах. Существуют данные, что конденсация возможна и при взаимодействии ДНК с заряженными поверхностями. Незаряженные или даже отрицательно заряженные полимеры в присутствии спирта также способны конденсировать ДНК. Высокие концентрации этанола обычно используются для высаживания ДНК, однако при тщательно подобранных условиях возможно образование частиц определенной морфологии. Нейтральные полимеры, например полиэтиленгликоль, в водно-солевых растворах ДНК высокой концентрации индуцирует появление конденсированного состояния с образованием упорядоченных спиральных форм. В ранних работах под Ψ — конденсацией (psi — polymer salt induced condensation) понимали такое компактное состояние ДНК, реализуемое при взаимодействии с полимером в присутствии соли, при котором фиксировались определенные изменения спектров кругового дихроизма (КД) ДНК (по увеличению или уменьшению положительного максимума в спектре КД различают Ψ+ и Ψ- — конденсацию). Это определение относилось к формированию дискретных частиц определенной формы и размера, предшествующему агрегации и выпадению ДНК в осадок. В последних работах понятие Ψ‑конденсации ДНК расширилось. Известно, что Ψ‑конденсация ДНК возможна и в присутствии полианионных полимеров, таких как полиаспартат и полиглутамат, а также некоторых других анионов, которые в большом количестве содержатся в головках бактериофагов.
Считается, что конденсация больших молекул ДНК происходит в три этапа: индукционный переход, когда лиганд присоединяется к ДНК, быстрая внутримолекулярная конденсация, длящаяся порядка несколько миллисекунд, когда связанный лиганд достигает критической концентрации, и медленная межмолекулярная конденсация, длящаяся порядка 100 сек.
Конденсация ДНК под действием мультивалентных катионов при малых концентрациях ДНК приводит к образованию тороидальных и палочкообразных структур. Поразительной особенностью конденсации ДНК является тот факт, что размер и морфология образующихся тороидов и палочек не зависят от состава и размеров ДНК.
В последнее время большой интерес представляет изучение взаимодействия молекулы ДНК с синтетическими катионными полимерами, способными образовывать обратимые ДНК-полимерные комплексы, используемые в генной инженерии для направленной передачи генетической информации. Такие комплексы должны отвечать ряду требований. Во-первых, комплекс должен представлять собой достаточно компактную структуру, чтобы проникнуть через клеточную мембрану – представлять собой биосовместимый композитный наноматериал. Во‑вторых, процесс комплексообразования должен быть обратим. В-третьих, так как молекула ДНК имеет отрицательный заряд, для образования компактных структур она должна взаимодействовать с положительно заряженными полимерами.
Существует большое многообразие среди полимеров, используемых в качестве генных векторов. Среди них линейные полимеры, разветвленные полимеры, дендримеры. Активно используется также известный конденсирующий агент — полилизин, однако он проявляет низкую трансфекционную активность. В настоящее время практически все передающие системы имеют те или иные недостатки: малая эффективность, токсичность и т. д. Размер, заряд и растворимость комплексов, сформированных ДНК с поликатионами, сильно зависят от отношения заряда поликатиона и ДНК. Однако ответ на вопрос относительно связи между размером, зарядом и результатом трансфекции неоднозначен, т. к. имеются работы, не подтверждающие заключение, что эффективная трансфекция происходит при образовании маленьких катионных частиц.
При определенных условиях в водных растворах электростатические взаимодействия между отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК и положительно заряженными группами поликатионов обеспечивают формирование компактных структур, в которых ДНК надежно защищена от действия агрессивных факторов внешней среды.
Генные векторы на основе синтетических полимеров имеют и ряд других преимуществ по сравнению с использованием инактивитрованных вирусов: достаточно простой и дешевый способ получения, возможность различной модификации полимеров, удобство транспортировки и хранения. Эффективность трансфекции может быть повышена, например, включением специфических групп, направленных на связывание вектора с клеточными мембранами.. Невирусная генная терапия, использующая катионные полимеры, снижает вероятность активизации имунной системы организма.
Таким образом, создание биосовместимых композитных наноструктур, содержащих ДНК и поликатионы, представляет собой одну из важных задач современной медицины.
В настоящей работе предлагается изучить процесс образования ДНК-компактных структур, то есть образования прототипа биосовместимого композитного наноматериала на основе биологических молекул.
Порядок выполнения практической части работы
Студент должен:
1. Внимательно ознакомиться с оборудованием для пробоподготовки ( с устройством дозатора переменного объема, пробирками типа «эппендорф» и т. п. в зависимости от предложенного оборудования).
2. Приготовить растворы содержащие ДНК и конденсирующий агент, с разными концентрациями конденсирующего агента ( должны быть указаны концентрации, приводящие к компактизации ДНК).
3. С помощью набора методов провести исследования приготовленных образцов.
4. Произвести оценку изменения размеров композитных структур в зависимости от концентрации конденсирующего агента и построить график этой зависимости.
5. Составить отчет о проделанной работе.
В качестве методов исследования возможно использовать весь изученный набор методов исследования наностурктур. Метод спектрофотометрии в данном случае должен показывать увеличение оптической плотности системы за счет возрастания рассеяния, чтоо указывает на образование компактных структур. Методы электронной и атомно-силовой микроскопии покажут изменения в размерах и форме объектов. Метод динамического рассеяния света позволит наблюдать уменьшения размеров исследуемых объектов при компактизации (увеличение коэффициента диффузии). В связи с вышеуказанным, преподавателю предоставляется свобода в использовании методов эксперимента в данной работе и возможность сравнения результатов, полученных разными методами.
Отчет должен содержать:
1. Описание механизма компактизации ДНК под действием конденсирующих агентов.
2. Описания примененных методик исследования и процесса приготовления образцов.
3. Анализ полученных экспериментальных данных (количе6ственный и качественный).
Тема 6: Исследование свойств композитного наноматериала для применения в стоматологии: влияние светового излучения на структуру и свойства
Цель занятия: рассмотрение процесса изменения свойств композитного наноматериала под действием светового излучения.
Время занятия: 4 академических часа.
Необходимое оборудование: композитный наноматериал, содержащий фотополимер, источник светового излучения.
План работы:
Ознакомление студентов c теоретическими основами принципов активации фотополимеров
Композиты световой активации (светоотверждаемые, фотополимеры, гелиоматериалы) представляют собой пасты, изготовленные и упакованные в заводских условиях. Реакция полимеризации инициируется видимым голубым светом с длиной волны 450‑550 нм. Под действием света определенной длины волны инициатор полимеризации распадается, вызывая комплекс реакций, ведущих к образованию свободных радикалов и формированию полимерных цепей. Для правильной полимеризации таких материалов следует четко придерживаться инструкции производителя как по времени полимеризации, так и по виду устройства, рекомендуемого для работы с этим композитом. Глубина полимеризации для разных композитов может составлять от 2 до 10 мм. Она зависит от опаковости и цвета материала.
Усадка фотополимеров теоретически направлена к источнику света. Однако, учитывая скорость распространения светового потока, можно сказать, что небольшие порции фотокомпозита (в пределах 2 мм толщины) полимеризуются одновременно во всей массе, аналогично самоотверждаемым. Полимеризационную усадку светоотверждаемого композита можно снизить плавным началом полимеризации, уменьшением объема отверждаемого материала, направленной полимеризацией.
Особенность композитов световой активации состоит в наличии паст различной прозрачности (или непрозрачности, опаковости). Аналогично структуре зуба выделяют 3 вида материала по этому признаку: аналог дентина — опаковые тона; аналог эмали — эмалевые тона; аналог режущего края — тона режущего края. По прозрачности они различаются между собой, в среднем, на 20—30 %. Укладывая различные по цвету и прозрачности виды материала в одну реставрацию, можно достичь полной имитации структуры зуба. Опаковые тона служат для маскировки пятен и создания «отражающей» среды, подобно дентину зуба, эмалевые тона в основном окрашивают и рассеивают свет, тона режущего края только преломляют и слегка рассеивают свет, создавая «живость» реставрации.
Для активации реакции полимеризации светоотверждаемых материалов требуется внешний источник голубого света. Такое устройство называется полимеризационным прибором, или лампой. Для получения голубого света с длиной волны 470—550 нм используются специальные установки: галогеновые, диодные, плазменные, лазерные. Обычно они состоят из собственно источника света, блока управления и световода. Для правильной работы требуется минимальная мощность светового потока 300 мВт/см2 (для приборов с галогеновой лампой). Световод должен находиться во время полимеризации как можно ближе к поверхности материала. Удаление его на 5 мм снижает мощность светового потока на 30 %. Кроме света полимеризационные установки могут генерировать тепло. Мощность теплового потока не должна превышать 50 мВт/кв. см. Полимеризационные устройства разных производителей отвечают общим стандартам и могут использоваться для отверждения материалов разных фирм. В связи с высокой яркостью света, необходимой для полимеризации, следует избегать попадания в глаза прямого и отраженного света, пользуясь защитными очками или экранами. Этот свет не содержит ультрафиолетовых лучей. Перед использованием конкретного прибора следует внимательно ознакомиться с инструкцией по эксплуатации.
Порядок выполнения практической части работы
Студент должен:
1. Внимательно ознакомиться с предложенным материалом и приборами.
2. Приготовить два образца, пригодных для исследования методом электронной микроскопии либо методом атомно-силовой микроскопии. Первый образец не должен подвергаться световому облучению, а второй должен быть облучен (полимеризован) на характерной длине волны для данного материала.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 |
