Фитохимическое изучение кукурузы столбиков с рыльцами и создание на их основе препаратов гепатопротекторного действия (стр. 2 )

1	2	3	4	5	6	7
СО рутина (Sigma-Aldrich, Германия)
1	14,32	1,025	0,554	0,882	204, 255, 355	Рутин
СО кверцетина (Sigma-Aldrich, Германия)
1	20,81	1,073	0,488	0,986	204,	Кверцетин
СО кофейной кислоты («SIGMA Aldrich», США)
1	11,87	0,503	1,346	0,237	217, 235пл, 300пл, 325	Кофейная кислота
СО феруловой кислоты («SIGMA Aldrich», США)
1	15,90	0,513	1,553	0,214	215, 235, 300пл, 325	Феруловая кислота
СО хлорогеновой кислоты («SIGMA Aldrich», США)
1	10,33	0,372	1,140	0,302	203, 235-244 пл, 325	Хлорогеновая кислота

Примечание: «-» показатель не определялся в связи с незначительной высотой пика

В ходе анализа данных хроматографического разделения фенольных соединений спиртового извлечения (табл. 1, рис. 1А) установлено, что в кукурузы столбиках с рыльцами, заготовленных на Алтае, присутствуют девять флавоноидов, среди которых идентифицированы ориентин (τ = 13,62 мин), лютеолин (τ = 21,69 мин) и апигенин (τ = 24,18 мин), и четыре фенолокислоты, в том числе, хлорогеновая (τ = 10,44 мин) и кофейная (τ = 11,90 мин) кислоты. Превалирующие пики образуют хлорогеновая кислота и флавоноид, образующий пик со временем удерживания 17,41 мин.

После проведения гидролиза (табл. 1, рис. 1Б) в спиртовом извлечении обнаружены четыре флавоноида, в том числе агликоны лютеолин и апигенин, С-гликозид ориентин, а также флавоноид, образующий пик со временем удерживания 17,41 мин, не подвергающийся гидролизу и, по-видимому, также относящийся к группе агликонов или С-гликозидов. Отсутствие флавоноидов, найденных в спиртовом извлечении, указывает на их принадлежность к группе О-гликозидов лютеолина и апигенина. После проведения гидролиза наблюдалось также появление 6 новых фенолокислот (τ=14,42 мин; 15,29 мин; 18,95 мин; 23,61 мин; 26,12 мин), в том числе феруловой кислоты (τ=16,10 мин), которые в нативном извлечении, по-видимому, находились в связанном состоянии.

Количественное определение основных групп БАВ гидрофильной фракции кукурузы столбиков с рыльцами. Для извлечения флавоноидов и фенолокислот из кукурузы столбиков с рыльцами был использован спирт этиловый 60%, выбранный в качестве оптимального экстрагента при проведении технологических экспериментов.

Количественное определение флавоноидов в кукурузы столбиках с рыльцами проводили методом дифференциальной спектрофотометрии, основанным на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Сопоставление характера спектров поглощения спиртового извлечения из кукурузы столбиков с рыльцами и СО лютеолина в присутствии алюминия хлорида свидетельствовало о целесообразности количественного определения данной группы БАВ при длине волны 400 нм в пересчете на лютеолин (рис. 2).

Рис. 2. УФ-спектры спиртового извлечения из кукурузы столбиков с рыльцами (1) и СО лютеолина (2) в присутствии алюминия хлорида

В ходе проведения исследований были установлены оптимальные условия пробоподготовки (способ получения извлечения – двукратное настаивание при соотношении «сырье: экстрагент» – 1:25; время отдельной ступени экстракции – 45 минут) и протекания реакции комплексообразования (соотношение «аликвота: алюминия хлорида спиртовый раствор 2%» – 1:2; время протекания реакции комплексообразования – 40 минут), а также удельный показатель поглощения хелата лютеолина при аналитической длине волны (550,84±11,96). В ходе валидационной оценки было выявлено, что предлагаемая методика обладает специфичностью (открываемость – 99,55±1,79%), линейностью (R2 = 0,9994), прецизионностью в условиях повторяемости (RSD = 1,37%) и воспроизводимости (RSD = 3,05%) и правильностью (открываемость – 100,35±0,90%).

Для определения содержания фенолокислот в кукурузы столбиках с рыльцами было апробировано несколько методов: прямая спектрофотометрия, экстракционного-спектрофотометрический метод, прямая спектрофотометрия по методу Фирордта.

Использование метода прямой спектрофотометрии являлось нецелесообразным в связи с тем, что спиртовые извлечения кукурузы столбиков с рыльцами содержат значительные количества флавоноидов, поглощающих электромагнитное излучение в близкой фенолокислотам области длин волн.

Экстракционно-спектрофотометрический метод количественного определения фенолокислот (, , 2001), заключающийся в предварительной реэкстракции фенолокислот из сгущенного спиртового извлечения этилацетатом с последующим спектрофотометрическим определением, не обеспечивал полноты разделения фенолокислот и флавоноидов.

На основании результатов проведенных исследований было сделано заключение о целесообразности количественного определения фенолокислот в кукурузы столбиках с рыльцами с помощью метода Фирордта, основанного на принципе аддитивности и учете концентрации флавоноидов, установленной ранее (, 2007). Содержание фенолокислот определяли в пересчете на хлорогеновую кислоту при длине волны 329 нм. Для проведения расчетов были определены удельные показатели поглощения хлорогеновой кислоты (535,14±11,20) и лютеолина (492,80±3,42) при аналитической длине волны. Кроме того, было установлено, что параметры пробоподготовки для количественного определения фенолокислот и флавоноидов совпадают, что свидетельствует о рациональности количественного определения указанных групп БАВ в одном извлечении. В процессе валидационной оценки было выявлено, что предлагаемая методика обладает специфичностью (открываемость – 100,86±2,66%), линейностью (R2 = 0,99997), правильностью (открываемость – 100,49±0,61%) и прецизионностью в условиях повторяемости (RSD = 2,11%) и воспроизводимости (RSD = 2,59%).

Для количественного определения дубильных веществ (суммы легкоокисляемых веществ) и полисахаридов были использованы стандартные методики ГФ XI изд. (перманганатометрический и гравиметрический методы соответственно). Результаты исследований по количественному определению основных групп БАВ кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных в Алтайском крае, представлены в табл. 2.

Таблица 2

Содержание основных групп биологически активных веществ в кукурузы столбиках с рыльцами

№ серии	Содержание БАВ, %
Флавоноиды (в пересчете на лютеолин)	Фенолокислоты (в пересчете на хлорогеновую кислоту)	Дубильные (легкоокисля-емые) вещества	Полисахариды
1	0,77±0,01	2,25±0,07	4,25±0,01	5,30±0,01
2	0,66±0,02	1,86±0,04	3,63±0,01	4,78±0,01
3	0,57±0,02	1,68±0,04	2,95±0,02	4,21±0,01
4	0,81±0,02	2,41±0,06	4,52±0,02	5,12±0,01
5	0,45±0,02	1,49±0,04	2,26±0,01	3,63±0,01

Из данных, представленных в табл. 2, видно, что содержание флавоноидов в кукурузы столбиках с рыльцами в пересчете на лютеолин в различных сериях сырья варьирует от 0,45±0,02% до 0,81±0,02%; фенолокислот в пересчете на хлорогеновую кислоту – от 1,49±0,04% до 2,41±0,06%; дубильных веществ (легкоокисляемых веществ) – от 2,26±0,01% до 4,52±0,02%, полисахаридов – от 3,63±0,05% до 5,30±0,01%.

Выбор оптимального срока заготовки сырья. Исследования показали, что накопление основных групп БАВ гидрофильной фракции (флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, полисахариды) в период молочно-восковой спелости початков кукурузы в 3-4 раза превышает аналогичный показатель сырья, заготовленного в период полной спелости початков кукурузы. Указанные результаты согласуются с физиологической ролью изучаемой части растения в указанные периоды вегетации. На основании полученных результатов в качестве оптимального периода заготовки изучаемого вида сырья была выбрана фаза молочно-восковой спелости початков кукурузы.

Вышеприведенные исследования по изучению химического состава БАВ гидрофильной фракции кукурузы столбиков с рыльцами были использованы для выбора показателей качества и методик анализа при стандартизации изучаемого сырья и составлении проекта ФСП «Кукурузы столбики с рыльцами». Стандартизацию кукурузы столбиков с рыльцами проводили на 5 сериях, согласно ОСТу 91 500.05.001–00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» и ГФ XI изд. по следующим показателям: описание, подлинность (СФМ – максимум поглощения в присутствии алюминия хлорида при длине волны 400±2 нм, ВЭЖХ – не менее 9 флавоноидов, в том числе ориентин, лютеолин и апигенин, и 4 фенолокислот, в том числе хлорогеновая и кофейная кислоты), потеря в массе при высушивании, содержание основных биологически активных веществ (флавоноидов – не менее 0,35% и фенолокислот – не менее 1,20%), зола общая, зола нерастворимая в хлористоводородной кислоты растворе 10%, допустимые примеси, микробиологическая чистота (категория 4Б).

Установлен предварительный срок годности кукурузы столбиков с рыльцами в условиях естественного хранения, равный 1,5 годам.

3. Разработка технологии экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого и изучение его фармакологической активности

Разработка технологии. Разработка ресурсосберегающей технологии экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого была начата с выбора оптимального экстрагента. При этом выявлено, что спирт этиловый 60% извлекает большее количество флавоноидов и фенолокислот по сравнению со спиртом этиловым 40% и 50%, одинаковое количество указанных групп БАВ по сравнению со спиртом этиловым 70%, а также по сравнению с последним обеспечивает меньший расход ценного экстрагента.

В качестве параметров сравнительной характеристики процесса экстрагирования фенольных соединений из кукурузы столбиков с рыльцами были использованы время наступления равновесного состояния в системе «сырье – экстрагент» и коэффициент вымывания. Кроме того, были определены основные технологические свойства и параметры процесса (насыпная масса, коэффициент поглощения сырьем экстрагента, ёмкость диффузора и соотношение «сырье: экстрагент») (табл. 3).

Из данных, представленных в табл. 3, видно, что наилучшими показателями обладает сырье с измельченностью 3-5 мм: время экстрагирования на отдельной ступени экстракции – 4 часа; коэффициент вымывания по флавоноидам – 0,330; коэффициент вымывания по фенолокислотам – 0,304; насыпная масса – 0,208 г/см3, соотношение «сырье: экстрагент» – 1:5,5 (без предварительного замачивания). Ёмкость диффузора для сырья с указанной измельченностью – 640 см3 на 100 г кукурузы столбиков с рыльцами.

Таблица 3

Основные технологические свойства сырья и параметры технологического процесса

Показатель	Измельченность сырья, мм
1-3	3-5	5-10	10-15	15-20	Неизмельчен-ное
Время наступления равновесного состояния, час						В пределах данного эксперимента не установлено
- по флавоноидам	-	4	4	4	4
- по фенолокислотам	-	4	5	5	5
Коэффициент вымывания
- по флавоноидам	-	0,330	0,318	0,252	0,196	0,193
- по фенолокислотам	-	0,304	0,274	0,239	0,187	0,174
Скорость свободного слива, мл/мин	1,45	5,21	5,53	5,89	5,86	5,91
Насыпная масса, г/см3	0,513	0,208	0,125	0,059	0,060	0,060
Соотношение «сырье: экстрагент»
- без замачивания	1:4	1:5,5	1:7	1:8,5	1:8,5	1:8,5
- с замачиванием	-	1:5,5	1:5,5	1:5,5	1:5,5	1:5,5

Примечание: «-» показатель не определялся