Фитохимическое изучение кукурузы столбиков с рыльцами и создание на их основе препаратов гепатопротекторного действия (стр. 3 )

С учетом выбранных значений технологических факторов, влияющих на процесс извлечения БАВ гидрофильного характера, и расчетов теоретической эффективности экстрагирования была разработана оптимальная технология получения экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 перколяторов с последующим сгущением и вакуумной сушкой, который обеспечивает значительный выход по флавоноидам (до 86,66%), фенолокислотам (до 88,63%) и экстрактивным веществам (до 86,26%).

Стандартизация экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого была проведена по показателям, рекомендуемым ОСТом 91 500.05.001–00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения». Все серии экстракта по показателям: описание, потеря в массе при высушивании, тяжелые металлы, микробиологическая чистота (категория 4Б) соответствовали предъявляемым требованиям.

Для определения подлинности экстракта были изучены: характер УФ-спектров спиртовых растворов указанного экстракта в присутствии алюминия хлорида и качественный состав флавоноидов и фенолокислот, установленный с помощью метода ВЭЖХ. Как характер УФ-спектров, так и состав основных групп БАВ изучаемого экстракта были идентичны аналогичным показателям исходного сырья.

Для количественного определения флавоноидов и фенолокислот в экстракте были применены методики, аналогичные методикам определения вышеназванных групп БАВ в исходном сырье. При этом стадия экстрагирования была заменена стадией растворения навески экстракта в спирте этиловом 60%. Рациональность использования данных методик была подтверждена данными определения прецизионности в условиях повторяемости (RSD = 2,24% для флавоноидов и 1,87% для фенолокислот). Содержание флавоноидов в изучаемом экстракте варьировало от 0,92 до 1,71%, фенолокислот – от 3,02 до 5,25%. Установлен предварительный срок годности экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого в условиях естественного хранения, равный 1 году.

Полученные результаты исследований положены в основу составления лабораторного регламента и проекта ФСП «Экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой».

Определение острой токсичности экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого проводили на 30 белых крысах линии Wistar массой 230–250 г и 30 белых нелинейных мышах массой 19–21 г. Экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой вводили в дозах 3000, 5000, 7000 мг/кг для крыс и 7000, 11700 и 16300 мг/кг для мышей. Общая продолжительность наблюдения за животными после введения исследуемого препарата составила 14 дней. По результатам исследований экспериментальный препарат отнесен к IV классу опасности (малоопасные вещества), т. к. гибели животных в исследуемых дозировках не наблюдалось.

Гепатопротекторную активность изучали на 105 белых крысах линии Wistar массой 195-245 г на модели экспериментального гепатита, индуцированного тетрахлорметаном. Экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой вводили в дозировках 100 и 200 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали Легалон в дозировке 200 мг/кг.

В ходе фармакологических экспериментов было выявлено, что экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой в дозировке 100 мг/кг проявляет гепатопротекторную активность (снижает гиперферментемию, уровни холестерина, триглицеридов и мочевины в плазме крови), сопоставимую с эффективностью препарата сравнения. Применение изучаемого экстракта в большей дозировке (200 мг/кг) сопровождается ухудшением некоторых биохимических показателей, в частности, активности гамма-глутамилтрансферазы.

Антиоксидантная активность. Влияние экстракта кукурузы столбиков с рыльцами на процессы свободно-радикального окисления оценивали в опытах in vitro на основании его способности активировать или ингибировать окисление твин-80. Полученные данные свидетельствовали о том, что изучаемый экстракт в зависимости от концентрации способен как подавлять, так и индуцировать процессы свободно-радикального окисления, что согласуется с данными опытов in vivo, в которых большую эффективность проявляет экстракт в дозировке 100 мг/кг, и подтверждает рациональность выбора указанной дозировки.

4. Разработка технологии твердых дозированных лекарственных форм на основе экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого

Капсулы являются одной из перспективных лекарственных форм для сухих экстракционных препаратов из растительного сырья, обеспечивающих высокую биологическую доступность БАВ и защиту экстракта от влияния факторов внешней среды.

Результаты исследований по изучению технологических свойств экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого свидетельствовали о том, что изучаемый экстракт обладает удовлетворительной сыпучестью (4,46±0,15 г/сек, угол естественного откоса – 50,0±1,76), большой насыпной массой (0,952±0,025 кг/м3), невысокими показателями потери в массе при высушивании и отсыреваемости (3,45±0,12% и 4,48±0,22% соответственно), но высокой гигроскопичностью (27,08±0,93%).

С учетом приведенных технологических свойств экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого нами было разработано и получено 8 прописей, в состав которых включили различные количества вспомогательных веществ (лактоза, аэросил, магния оксид, лудипресс), снижающих гигроскопичность, и изучены их технологические свойства (табл. 4).

Таблица 4

Сравнительная оценка технологических свойств исследуемых прописей

№ прописи	Состав прописи	Сыпучесть, г/сек	Насыпная масса, г/см3	Гигроскопичность, %
1	экстракт 0,4 лактоза 0,02	3,84±0,14	0,955±0,032	23,82±0,53
2	экстракт 0,6 лактоза 0,01 аэросил 0,01	1,86±0,06	0,840±0,028	24,47±0,62
3	экстракт 0,4 аэросил 0,02	1,73±0,07	0,636±0,025	24,83±0,48
4	экстракт 0,4 лактоза 0,01 магния оксид 0,01	2,81±0,09	0,972±0,020	24,56±0,45
5	экстракт 0,4 лудипресс 0,02	5,16±0,19	1,000±0,015	25,05±0,56
6	экстракт 0,4 лактоза 0,08	3,39±0,08	0,973±0,028	19,83±0,69
7	экстракт 0,4 лудипресс 0,08	5,15±0,16	0,941±0,016	18,95±0,51
8	экстракт 0,4 лудипресс 0,12	5,44±0,20	0,903±0,022	19,32±0,72

При сопоставлении полученных данных по технологическим показателям изучаемых смесей (табл. 4) было сделано заключение о том, что наиболее рационально изготавливать капсулы с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим по прописи № 7, так данная пропись обеспечивает одновременно удовлетворительную сыпучесть (5,15±0,16 г/сек) и более низкую гигроскопичность (18,95±0,51%) по сравнению с исходным экстрактом. Для капсулирования терапевтической дозы экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого по прописи № 7 необходимо использовать капсулы № 0.

Стандартизацию капсул, получивших условное название «Маискап» проводили по показателям, регламентируемым ГФ XI изд. ОФС «Капсулы» и ОСТом 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения»: описание, подлинность (СФМ – максимум поглощения в присутствии алюминия хлорида при длине волны 400±2 нм, ВЭЖХ – не менее 9 флавоноидов, в том числе ориентин, лютеолин и апигенин, и 4 фенолокислот, в том числе хлорогеновая и кофейная кислоты), средняя масса (0,563 г до 0,571 г), отклонение массы каждой капсулы (не более 10%), отклонение массы содержимого каждой капсулы (не более 10%), количественное определение (от 0,00364±0,00004 до 0,00676±0,00015 г флавоноидов на капсулу), распадаемость (не более 12 мин), растворение (от 95,19±2,25% до 98,22±2,14%), микробиологическая чистота (категория 3Б).

Установлен предварительный срок годности капсул Маискап в условиях естественного хранения, равный 1 году.

Результаты исследований были положены в основу разработки лабораторного регламента и проекта ФСП «Маискап капсулы 0,4».

Разработка комплексной таблетированной лекарственной формы с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим и энтеросорбентом. В результате анализа сорбционной активности и технологических свойств наиболее часто применяемых в медицинской практике энтеросорбентов для получения комплексных таблеток с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим были выбраны уголь активированный и СУМС-1. С целью выбора оптимального энтеросорбента была изучена гепатопротекторная активность смесей изучаемого экстракта с углем активированным и СУМС-1 в соотношении 3:1. Эксперименты проводили параллельно с изучением гепатопротекторной активности исходного экстракта. В результате исследований установлено, что применение смеси экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с энтеросорбентом СУМС-1 характеризуется усилением фармакологической активности (частично восстанавливается уровень глюкозы, снижаются уровни триглицеридов, мочевины, билирубина в плазме крови животных по сравнению с аналогичными показателями как контрольной группы, так и группы животных, получавших экстракт отдельно), что свидетельствует о рациональности сочетания указанных компонентов в одной лекарственной форме.

В результате проведенных исследований по изучению технологических свойств смеси экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с энтеросорбентом СУМС-1 установлено, что изучаемый объект обладает очень хорошей сыпучестью (9,60±4,08 г/сек, угол естественного откоса – 50,0±2,45), большой насыпной массой (0,625±0,001 г/см3), невысокими показателями потери в массе при высушивании и отсыреваемости (3,23±0,54% и 3,51±0,58% соответственно), но высокой гигроскопичностью (34,76±1,25%). Прессуемость смеси установить не удалось в связи с расслаиванием полученных таблеток.

В связи с вышеизложенным, нами было разработано и получено 6 прописей, в состав которых включили различные количества вспомогательных веществ, улучшающих прессуемость, снижающих гигроскопичность и не уменьшающих адсорбционную активность энтеросорбента (табл. 5).

В результате сравнительной оценки полученных смесей и модельных таблеток на их основе, полученных методом прямого прессования при 120 кгс/см2, по гигроскопичности, прессуемости, адсорбционной активности, а также по показателям «Распадаемость» и «Растворение» (табл. 6) было сделано заключение о целесообразности получения комплексных таблеток по прописи № 3. Следует отметить, что использование указанной технологии привело к получению неоднородных по внешнему виду таблеток, что можно объяснить различиями в насыпной массе энтеросорбента и смеси экстракта со вспомогательными веществами (0,718±0,010 и 0,910±0,015 г/см3 соответственно).

Учитывая вышеизложенное, была разработана технология получения комбинированных таблеток с предварительной сухой грануляцией смеси изучаемого экстракта со вспомогательными веществами с последующим отбором фракции гранулята размером от 0,4 до 0,5 мм, имеющей насыпную массу (0,700±0,015 г/см3), близкую к аналогичному показателю энтеросорбента СУМС-1 (0,718±0,010 г/см3).

Стандартизацию таблеток, получивших условное название «Маиссорб» проводили по показателям, регламентируемым ГФ XI изд. ОФС «Таблетки» и ОСТом 91500.05.001-00 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения»: описание, средняя масса (от 0,491 до 0,500 г) и отклонение от средней массы (не более 5%), подлинность (СФМ – максимум поглощения в присутствии алюминия хлорида при длине волны 400±2 нм, ВЭЖХ – не менее 9 флавоноидов, в том числе ориентин, лютеолин и апигенин, и 4 фенолокислот, в том числе хлорогеновая и кофейная кислоты), количественное определение (0,00275±0,00005 до 0,00515±0,00012 г флавоноидов на таблетку), распадаемость (не более 5 мин), растворение (от 95,37±2,89% до 97,88±2,87%), прочность на истирание (от 97,98 до 98,86%), микробиологическая чистота (категория 3Б).

Установлен предварительный срок годности таблеток Маиссорб в условиях естественного хранения, равный 1 году.

Результаты исследований были положены в основу разработки технологической схемы получения таблеток Маиссорб (рис. 3), лабораторного регламента и проекта ФСП «Маиссорб капсулы 0,3».

Таблица 5

Сравнительная оценка технологических свойств таблетируемых прописей и модельных таблеток на их основе

№ прописи	Состав прописи	Гигроскопичность, %	Прессуемость, %	Адсорбционная активность, %	Распадаемость, мин	Растворение, %
1	экстракт 0,30 СУМС-1 0,10 лактоза 0,02 МКЦ 0,08	31,44±0,98	59,23±2,76	67,9±1,0	3,4	78,9±1,8
2	экстракт 0,30 СУМС-1 0,10 лактоза 0,02 МКЦ 0,06 кальция стеарат 0,02	34,14±1,12	17,68±0,78	68,2±2,2	-	-
3	экстракт 0,30 СУМС-1 0,10 лактоза 0,05 МКЦ 0,05	30,06±0,56	33,15±0,99	62,5±0,8	4,3	97,7±1,8
4	экстракт 0,30 СУМС-1 0,10 ПВП 0,04 Na-КМЦ 0,04 лактоза 0,02	27,51±0,7	63,72±2,88	119,9±4,5	более 15	32,2±1,9
5	экстракт 0,30 СУМС-1 0,10 ПВП 0,03 Na-КМЦ 0,02 лактоза 0,05	27,07±1,4	51,49±1,39	125,5±2,2	более 15	36,6±1,5
6	экстракт 0,30 СУМС-1 0,10 ПВП 0,03 лактоза 0,02	26,65±1,19	39,23±1,11	79,6±3,6	4,7	71,9±0,3

Примечание: «-» показатель не определялся

Рис. 3. Технологическая схема получения таблеток Маиссорб

Общие выводы

1.  В результате комплексного фитохимического изучения (методы ТСХ, ВЭЖХ) кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных в Алтайском крае, выявлено их соответствие по составу БАВ гидрофильной фракции сырью, заготавливаемому в других регионах России. При этом установлено наличие девяти флавоноидов – производных флавона, которые находятся в форме агликонов, О - и С-гликозидов, среди которых идентифицированы ориентин, лютеолин и апигенин. Доказано присутствие в изучаемом сырье четырех фенолокислот (в том числе, хлорогеновой, феруловой и кофейной кислот), дубильных веществ гидролизуемой группы и полисахаридов.

2.  Предлагаемые усовершенствованные спектрофотометрические методики количественного определения флавоноидов и фенолокислот в кукурузы столбиках с рыльцами могут быть рекомендованы для их стандартизации, т. к. обладают соответственно специфичностью, линейностью (R2=0,9994 и 0,99997), повторяемостью (RSD = 1,37% и 2,11%), промежуточной прецизионностью (RSD = 3,05% и 2,59%) и правильностью (= 100,35±0,90% и 100,49±0,61%).

3.  Заготовку кукурузы столбиков с рыльцами целесообразно проводить в Алтайском крае в связи с высоким содержанием БАВ: флавоноидов (в пересчете на лютеолин) – от 0,45±0,02% до 0,81±0,02%, фенолокислот (в пересчете на хлорогеновую кислоту) – от 1,49±0,04% до 2,41±0,06%, дубильных веществ (суммы легкоокисляемых веществ) – от 2,26±0,01% до 4,52±0,02%, полисахаридов – от 3,63±0,01% до 5,30±0,01%.

4.  Оптимальным периодом сбора кукурузы столбиков с рыльцами является фаза молочно-восковой спелости початков, т. к. накопление основных групп гидрофильной фракции БАВ в указанный период значительно (в 3-4 раза) превышает аналогичный показатель сырья, заготовленного в период полной спелости початков кукурузы.

5.  На основании проведенных экспериментальных исследований и теоретических расчетов выявлены оптимальные значения технологических факторов и параметры технологического процесса получения экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с применением метода многоступенчатого противоточного экстрагирования с законченным циклом в батарее из 5 перколяторов с последующим сгущением и вакуумной сушкой, обеспечивающего выход по флавоноидам до 86,66%, фенолокислотам – до 88,63% и экстрактивным веществам – до 86,26%.

6.  В ходе фармакологических исследований установлено, что экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой относится к IV классу опасности (малоопасные вещества) согласно ГОСТу 12.1.007-76. На модели экспериментального токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном, доказано, что изучаемый экстракт проявляет гепатопротекторные свойства в дозировке 100 мг/кг. Для усиления фармакологической активности изучаемого экстракта целесообразно его сочетание с энтеросорбентом СУМС-1 в одной лекарственной форме. Эксперименты, проведенные in vitro, свидетельствовали о том, что механизм гепатопротекторного действия изучаемого экстракта может быть обусловлен антиоксидантной активностью.

7.  В результате комплекса проведенных технологических, биофармацевтических и фармакологических исследований выбраны оптимальные составы и технологии твердых дозированных лекарственных форм с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим (капсул Маискап и комбинированных с энтеросорбентом СУМС-1 таблеток Маиссорб), имеющих высокие показатели теста «Растворение» (до 98,22±2,14 и 97,88±2,87% соответственно).

8.  Проведена стандартизация, предложены показатели качества и методики анализа флавоноидов и фенолокислот для изучаемого вида сырья, полученного экстракта и твердых дозированных лекарственной форм на его основе, которые положены в основу соответствующих проектов ФСП: «Кукурузы столбики с рыльцами», «Экстракт кукурузы столбиков с рыльцами сухой», «Маискап капсулы 0,4» и «Маиссорб таблетки 0,3». Исследование стабильности вышеуказанного сырья и экспериментальных препаратов позволило установить предварительные сроки годности в условиях естественного хранения: для кукурузы столбиков с рыльцами – 1,5 года, для экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого, капсул Маискап и таблеток Маиссорб – 1 год.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.  Дворникова, анализ состава фенольных соединений кукурузы обыкновенной столбиков с рыльцами, собранных в Алтайском крае и сырья в заводской упаковке / , // Молодежь Барнаулу: материалы XI городской НПК молодых ученых (17-20 ноября 2009 г.): в 2 т. / отв. ред. . – Барна0. – Т.2. – С. 116.

2.  Дворникова, оценка состава биологически активных веществ кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных на Алтае в различные фазы спелости початков кукурузы / , // Вестник ПГФА. – 2010. – №7. – C. 55-58.

3.  Дворникова, состава фенольных соединений кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных на Алтае, методом ВЭЖХ / , // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2010. – Вып. 65. – С. 308-310.

4.  Босенко, методики количественного определения флавоноидов методом спектрофотометрии в кукурузы столбиках с рыльцами / , , // Актуальные проблемы фармакологии и фармации: ежегодный сборник научных и методических работ преподавателей, молодых ученых и студентов фармацевтического факультета. – Вып. VII. – г. Барнаул, 2010. – C. 31-37.

5.  Дворникова, спирта этилового различной концентрации на извлечение флавоноидов и экстрактивных веществ из кукурузы столбиков с рыльцами / // Молодежь – Барнаулу: материалы медицинского раздела XII городской НПК молодых ученых (17-22 ноября 2010 г.): в 2 т. – Барна1. – Т.2. – С. 44-46.

6.  Дворникова, состава фенолокислот кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных на Алтае / , // 35 лет фармацевтическому факультету АГМУ: итоги и перспективы. Материалы научно-практической конференции, посвященной 35-летию фармацевтического факультета. – Барнаул, 2010. – С. 66-71.

7.  Дворникова, по изучению влияния концентрации спирта этилового на извлечение фенолокислот из кукурузы столбиков с рыльцами / , // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. – Вып. 66. – С. 64-67.

8.  Николаева, по стандартизации экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого / , , // Актуальные проблемы фармакологии и фармации: ежегодный сборник научных и методических работ преподавателей, молодых ученых и студентов фармацевтического факультета. – Вып. VIII. – г. Барнаул, 2011. – C. 149-154.

9.  Жилин, оптимального сорбента для получения комбинированных таблеток с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим / , , // Актуальные проблемы фармакологии и фармации: ежегодный сборник научных и методических работ преподавателей, молодых ученых и студентов фармацевтического факультета. – Вып. VIII. – г. Барнаул, 2011. – C. 59-64.

10.  Дворникова, оптимальных параметров экстрагирования биологически активных веществ из столбиков с рыльцами кукурузы / , // Актуальные вопросы фармацевтической науки и образования. Материалы Межрегиональной научной конференции с международным участием, посвященной 70-летию фармацевтического факультета СибГМУ / 7-8 сентября 2011 г. – Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2011. – С. 49-53.

11.  Дворникова, по установлению показателей качества кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных в Алтайском крае / // Вестник уральской медицинской науки. – 2011. – № 3/1(37). – С. 57.

12.  Дворникова, таблеток «Маиссорб» с экстрактом кукурузы столбиков с рыльцами сухим / , // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2012. – Вып. 67. – С. 155-156.

13.  Дворникова, соединения кукурузы столбиков с рыльцами как основа создания препарата гепатопротекторного действия / , , [и др.] // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы V Всероссийской конференции с международным участием. – Барнаул, 2012. – С. 260-262.

14.  Дворникова, кукурузы столбиков с рыльцами сухой как потенциальное средство терапии токсических гепатитов / , , [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2012. – том 14. – № 5(3). – С. 711-714.

15.  Дворникова, оценка гепатопротекторной активности экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого и его смесей с энтеросорбентами / , , [и др.] // Фундаментальные исследования. – 2012. – том 14. – № 10(2). – С. 393-396.

(Россия)

Фитохимическое изучение кукурузы столбиков с рыльцами и создание на их основе препаратов гепатопротекторного действия

Проведено комплексное фитохимическое изучение биологически активных веществ гидрофильной фракции кукурузы столбиков с рыльцами, заготовленных в Алтайском крае. Выбран оптимальный срок заготовки изучаемого вида сырья. Разработана технология получения экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого методом многоступенчатого противоточного экстрагирования с последующим сгущением и вакуумной сушкой. Выявлены гепатопротекторная (in vivo) и антиоксидантная (in vitro) активности сухого экстракта. Изучены технологические свойства экстракта, выбран оптимальный состав и разработана технология капсулированной лекарственной формы на его основе. Фармакологически обоснована целесообразность сочетания экстракта кукурузы столбиков с рыльцами сухого с энтеросорбентом в одной лекарственной форме, разработан состав и рациональная технология комбинированных таблеток. Проведена стандартизация, предложены показатели качества и методики анализа флавоноидов и фенолокислот для сырья, экстракта кукурузы столбиков сухого, капсул Маискап и таблеток Маиссорб.

Dvornikova Lyubov (Russia)

Phytochemical research of corn silk and development of hepatoprotective preparations on their basis

A comprehensive phytochemical study of biologically active substances of hydrophilic fraction of corn silk gathered in Altai region has been conducted. The optimum term of gathering raw material has been chosen. The technology of production of corn sulk dry extract by multistage countercurrent extraction with the subsequent condensation and vacuum drying has been developed. Hepatoprotective (in vivo) and antioxidant (in vitro) activities of dry extract have been determined. Technological properties of the extract have been studied to choosing the optimal composition and the technology of production capsules with corn silk dry extract. Expedience of combination dry extract with enterosorbent in one dosage form has been determined in pharmacological experiment. The optimal composition and the technology of production of complex tablets with corn silk dry extract and enterosorbent have been chosen. The standardization of corn silk, the dry extract, capsules Mayscap and tablets Mayssorb has been conducted, and the indicators of quality and technique of their analysis have been offered.

Подписано в печать ___2013 г.

Формат 60×90/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая.

Гарнитура Таймс Нью Роман. Тираж 100 экз. Объем 1,0 п. л. Заказ №..

Алтайский государственный медицинский университет

г. Барна